DE4200349C2

DE4200349C2 - Verfahren zur Herstellung eines natürlichen, stabilen grünen Farbstoffes auf Basis von Chlorophyll für die Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie

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Publication number: DE4200349C2
Application number: DE4200349A
Authority: DE
Inventors: Georg Dr Buech
Original assignee: Individual
Current assignee: BUECH, GEORG, DR., 68723 SCHWETZINGEN, DE
Priority date: 1992-01-09
Filing date: 1992-01-09
Publication date: 1997-08-28
Anticipated expiration: 2012-01-10
Also published as: DE4200349A1

Description

Farben besitzen im menschlichen Leben, sowohl im sozialen Bereich, als auch in der Ernährung eine große Bedeutung. Bis zur revolutionären Entwicklung der Farbstoffchemie Ende des letzten Jahrhunderts wurden Lebensmittel mit natürlichen Farbstoffen, färbenden Gewürzen wie Safran oder Paprika, aber auch mit Mineralsalzen gefärbt. Durch den Einsatz der neu entwickelten Teerfarbstoffe wurden die natürlichen Pigmente in allen Bereichen zurückgedrängt.

Entscheidend waren hierfür der Preis der neuen Produkte, ihre Standardisierbarkeit, ihre Färbekraft und Stabilität.

In die Diskussion gerieten speziell Azofarbstoffe erstmals zu Beginn dieses Jahrhunderts, als der für Lebensmittel erlaubte Farbstoff Buttergelb als Canzerogen identifiziert wurde.

Da der Konsument oftmals nicht unter der Vielzahl an Azofarbstoffen mit ihren unterschiedlichen physiologischen Wirkungen differenziert, ist hierin womöglich noch immer die Ansicht begründet, Azofarbstoffe wären im allgemeinen gesundheitsschädlich.

Seit dem Einsetzen der "Biowelle" Anfang der achtziger Jahre, sinkt die Akzeptanz synthetischer Farbstoffe immer mehr. "Künstlich" wird dabei mit "schlecht", "natürlich" mit "gut, gesund" gleichgesetzt. Verstärkt werden nun Ersatzmöglichkeiten für synthetische Farbstoffe gesucht. Die über Jahrzehnte zurückgedrängten natürlichen Farbstoffe erleben eine Renaissance. Für die gelben, orangen und roten Azofarbstoffe lassen sich dabei hinlänglich stabile Alternativen in der Natur finden. Beispiele hierfür sind Carotine, Xanthophylle, Anthocyane, Karmin, Curcumin und Betain.

Schwieriger ist der Ersatz der künstlichen grünen Farb stoffe. Der einzige in Frage kommende natürliche grüne Farbstoff ist der zu den Metalloporphyrinen zählende Tetrapyrrolfarbstoff Chlorophyll. Schon dessen künstliche Alternativen, wie Brilliantsäuregrün oder Mischungen aus Patentblau und gelben Azofarbstoffen stellten keine befriedigende Lösungen für einen grünen Lebensmittelfarbstoff dar. Die Triphenylmethanfarbstoffe zeigen nur eine geringe Lichtechtheit. Auch die stabileren, von Chlorophyll abgeleiteten Cu-Chlorophylle und Cu-Chlorophylline werden vom Verbraucher nicht als natürliche Farbstoffe akzeptiert. Die Hydrophobität des Chlorophyllmoleküls schränkt seinen Einsatz in Lebensmitteln ein. Dispergierbarkeit und Dosierung sind so oftmals erschwert. Neben den wasserlöslichen Chlorophyllinen wird in der Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie darum nur zum geringeren Teil in Öl gelöstes Chlorophyll, hauptsächlich in stark fetthaltigen Kompositionen, eingesetzt. Weiter wird der Einsatz von natürlichem Chlorophyll in Lebensmitteln durch seine geringe Stabilität gegenüber Licht, Säure und höheren Temperaturen stark eingeschränkt (vgl. Abbildung 1 und 2).

Abbildung 1 Struktur der Chlorophylle a und b Abbildung 2 Hauptabbaureaktionen von Chlorophyll a und b, (CPH, Chlorophyllase)

Die qualitätsentscheidende Reaktion des Chlorophylls stellt die Konversion zu Pheophytin dar. Die Farbe ändert sich von einem leuchtenden Blattgrün zu einem olivbraunen Ton. Eine Bildung von C-10 Epimeren hat keinen Einfluß auf die Farbeigenschaften, da die Epimere a′ und b′, sowie die originären Chlorophylle fast identische visuelle Spektren aufweisen. Gleiches wird für Pheophytine beobachtet. Bei stärkerer Erhitzung tritt ein Verlust der C-10 Carboxymeth oxygruppe auf. Hierdurch entstehen olivbraune Pyropheophytine.

Unter Verlust des Phytolrestes entstehen die Chloro phylline. In ihren spektralen Eigenschaften ähneln sie den Chlorophyllen. Mit der Abspaltung des hydrophoben Restes werden die Chlorophylline besser wasserlöslich. Analog zur Entstehung der Pheophytine bilden sich die grünbraunen Pheophorbide. Ebenso, wie bei Chlorophyllen entstehen bei Chlorophyllinen, Pyropheophorbide bei hohen Temperaturen. Die Gruppen des isozyklischen Ringes können mit reaktiven Komponenten in Lebensmitteln, wie z. B. Diketonen oder Aminen, weiter reagieren. Dieser weitere Abbau erfolgt über die Pheophorbide zu Chlorinen und Rhodinen.

Ziel der Erfindung soll ausgehend von der geringen Chlorophyllstabilität nicht nur deren Verbesserung sein. Vielmehr soll auch, aufgrund der mangelhaften Löslichkeit von Chlorophyll in wäßrigen Medien ermittelt werden, welche Trägerstoffe die Löslichkeit, bzw. Dispergierbarkeit von Chlorophyll verbessern können. Als Trägerstoffe für hydrophobe Substanzen werden in der Lebensmittelindustrie Hydrokolloide, grenzflächenaktive Substanzen, Polysaccharide und Proteine diskutiert. Chlorophylle sind in allen photosynthetisch aktiven Organismen an bestimmte Proteinstrukturen gebunden. Daher scheinen sich Proteine in diesem Zusammenhang am ehesten als Trägerstoffe für Chlorophyll zu eignen. Chlorophyll ist dabei nicht das einzige Metalloporphyrin das Bindungen mit Proteinen eingeht. Auch das mit Chlorophyll nahe verwandte Häm bildet mit verschiedenen Proteinen Komplexe. Die bekanntesten Häm/Proteinkomplexe sind Myoglobine, Hämoglobine, Peroxidasen, Katalasen und Cytochrome. Seit Ende der 70iger Jahre sind Untersuchungen bekannt, die zeigen, daß andere Metallporphyrine als Chlorophyll, z. B. Zn- und Mg-Pyropheophorbide, durch Apomyo- und Hämoglobin gebunden werden können. Die Bindungsfähigkeit des Apoproteins ist also nicht selektiv auf Häm ausgerichtet. In Hämoglobin sind primär Histidine an der Bindung von Häm beteiligt. Ähnliche Bindungsmechanismen werden für Chlorophyll diskutiert und im Falle von photosynthetisch aktiven Bakterien auch bestätigt. Chlorophyll bildet allerdings auch mit Proteinen Komplexe, die ursprünglich nicht zur Bindung von Porphyrinen bestimmt waren. So sind z. B. Rinderserumalbumin, Eialbumin und Casein in der Lage, geringe Mengen an Chlorophyll zu binden. Diese Beispiele zeigen, daß Porphyrin/Proteinkomplexe in der Natur weit verbreitet sind und auch in vitro hergestellt werden können.

In bezug auf Bindungsfähigkeit und Löslichkeit aussichtsreichster Trägerstoff für Chlorophyll, wird somit erfindungsgemäß das Protein Hämoglobin untersucht.

Hier interessiert welcher Anteil an Chlorophyll im Molekül gebunden werden kann, welche Änderungen der Lösungseigenschaften sich durch eine mögliche Bindung ergeben und schließlich, wie sich die Licht-, pH- und Temperaturstabilität von Chlorophyll im Komplex, gegenüber nicht gebundenem Chlorophyll verändert.

Da bei einer Vielzahl von Lebensmitteln Triglyceride die geeigneten Trägerstoffe für Chlorophyll sind, soll ermittelt werden, welche Triglyceride sich als Lösungsmittel für Chlorophyll hinsichtlich seiner Stabilität besonders eignen.

Gerade unter Lichteinfluß überlagert der photooxidative Effekt, die pH- und Temperatureffekte des Chlorophyllabbaus. Zusätzlich wird Chlorophyll durch Radikale und Peroxide, die während der Autoxidation oder der enzymatischen Oxidation von Linol- und Linolensäure entstandenen sind, in hohem Maß abgebaut. Daher soll im Zusammenhang mit Triglyceriden als Chlorophyllträger auch ermittelt werden, ob sich eine Erhöhung der Chlorophyllstabilität durch natürliche antioxidative Wirkstoffe erreichen läßt.

Stabilität von Chlorophyll im Komplex mit Apohämoglobin

Im folgenden wurde untersucht, wie sich die Stabilität des Chlorophyll/Proteinkomplexes unter verschiedenen Bedingungen gegenüber kolloidal gelöstem Chlorophyll verhält. Da bisher der Einsatz von konventionellem Chlorophyll in Lebensmitteln durch dessen mangelhafte Stabilität stark eingeschränkt war, interessiert die Chlorophyllstabilität des hier hergestellten Produktes besonders.

Der nicht hydrolysierte Komplex wurde in wäßriger Lösung bei verschiedenen Licht-, Temperatur- und pH-Bedingungen getestet. Um den Vergleich der Ergebnisse mit Literaturdaten über andere Chlorophyll/Proteinkomplexe zu ermöglichen, wurde die Stabilität bei 5 und 25°C untersucht. Zur Belichtung wurden die Proben unter Tageslichtlampen aufbewahrt. Zur Untersuchung der pH-Stabilität der Proben wurde der jeweils gewünschte pH-Wert eingestellt. Eine Pufferung war aufgrund der hohen Proteinkonzentration nicht notwendig. Zum Vergleich wurde die Stabilität in gleicher Weise für ein kolloidal in Wasser gelöstes Chlorophyll überprüft.

Die Bestimmung der Konzentration der Chlorophylle a und b erfolgte nach deren Auftrennung mittels der zuvor beschriebenen HPLC Methode.

Beispielhaft für die weiteren Untersuchungen soll die Chlorophyllstabilität bei pH 7,0, einer Temperatur von 25°C und unter Lichteinfluß und dunkler Lagerung dargestellt werden. Es ist festzustellen, daß Chlorophyll b in belichteten und unbelichteten Proben weitaus stabiler ist als Chlorophyll a. Im weiteren Verlauf soll daher nur noch die Stabilität von Chlorophyll a berücksichtigt werden. Der Einfluß des Lichtes auf die Stabilität von Chlorophyll wird hier drastisch deutlich. Die belichteten Proben sind wesentlich instabiler als die dunkel gelagerten.

In Abbildung 3 wird deutlich, daß der Chlorophyllabbau einer Reaktion erster Ordnung entspricht. Der Verlauf der Abbaureaktion kann daher durch folgende Gleichung beschrieben werden:
ct/co = e^-kt II

Demnach ergibt sich die Reaktionskonstante zu:

k = - ln(c_t/c₀) * t^-1 III

wobei:
c_t : Chlorophyll Konzentration zum Zeitpunkt t
c₀ : Chlorophyll Konzentration zum Zeitpunkt t = 0
k : Geschwindigkeitskonstante der Reaktion Chl a zu Phe a

Abbildung 3 Chlorophyllstabilität im Chl/ApoHb Komplex bei pH 7,0, 25°C, belichtet und unbelichtet

Aus Untersuchungen über die Chlorophyllstabilität in Gemüsen mit einem relativ hohen Chlorophyllgehalt ist bekannt, daß deutliche Einbußen an Farbqualität ab einem 50 %igen Chlorophyllabbau auftreten. Daher wird in Folge neben der Geschwindigkeitskonstante des Chlorophyllabbaus zur besseren Charakterisierung und Übersicht die Halbwertszeit der Reaktion angegeben.

Unter der Halbwertszeit, t₁/₂, ist in diesem Fall der Zeitpunkt zu verstehen, zu welchem die Chlorophyll konzentration die Hälfte der Ausgangskonzentration beträgt. Sie ergibt sich damit zu:

t_1/2 = -ln(0,5) _* k^-1 IV

Die Stabilität von Chlorophyll wurde unter den der Tabelle zu entnehmenden Temperatur- und pH-Bedingungen getestet. Die einzelnen Abbaukurven folgten wie zuvor den Charakteristiken einer Reaktion erster Ordnung. Die Abbauraten werden in Form der Geschwindigkeitskonstanten und der Halbwertszeit der Reaktion Chlorophyll a zu Pheophytin a angegeben. Untersucht wurden die folgenden Proben:
Chl/ApoHb Lösungen mit einer Proteinkonzentration von 1,2 gl^-1, gefriergetrocknetes Chl/ApoHb Pulver (Pulver GT), sowie kolloidal gelöstes Chlorophyll.

Die Daten zeigen eine eindeutige Abhängigkeit der Chlorophyllstabilität von pH und Temperatur. Obwohl man schon bei leicht sauren Verhältnissen einen erhöhten Chlorophyllabbau verzeichnen kann, ist offensichtlich mit einem verstärkten Abbau von Chlorophyll erst unterhalb einem pH Wert von 6 zu rechnen. Dies verdeutlicht die starke pH Abhängigkeit der Umsetzung von Chlorophyll zu Pheophytin.

Das gefriergetrocknete Produkt ist gegenüber den gelösten Produkten weitaus stabiler. Die Bindung von Chlorophyll an Apohämoglobin wirkt sich deutlich positiv auf die Stabilität aus. Bei pH 7 ist die Stabilität des Chl/ApoHb etwa doppelt so hoch, bei pH 5 ca. 6 mal so hoch wie bei kolloidalem Chlorophyll.

Tabelle 8

Chlorophyllstabilität von Chl/ApoHb und in kolloidal gelöstem Chlorophyll in Abhängigkeit von pH und Temperatur, dunkle Lagerung

Licht beschleunigt, wie aus Tabelle 9 zu entnehmen, den Chlorophyllabbau sehr stark. Besonders drastisch wirken sich gleichzeitiger Einfluß von niederem pH und Licht aus.

Dieser Einfluß tritt auch sehr deutlich bei niederen Lagertemperaturen auf.

Wie die Werte in der Tabelle zeigen, ist kolloidal in Wasser gelöstes Chlorophyll deutlich instabiler als an Protein gebundenes. Eine Erhöhung der Chlorophyllstabilität gegenüber niederem pH-Wert, Licht und Temperatur bei Bindung von Chlorophyll an Apohämoglobin läßt sich eindeutig feststellen.

Tabelle 9

Chlorophyllstabilität in Chl/ApoHb und in kolloidal gelöstem Chlorophyll in Abhängigkeit von pH und Temperatur, belichtet (3000 Lux)

Aufgrund der festgestellten Eigenschaften des Komplexes läßt sich erkennen, daß Apohämoglobin in bezug auf die Menge an gebundenem Pigment, der Lösungseigenschaften und seiner Chlorophyll stabilisierenden Wirkung ein geeigneter Trägerstoff für diesen Farbstoff sein kann.

Die Stabilität des Farbstoffes im Komplex mit Apohämoglobin, ist bezüglich pH-, Temperatur- und Lichteinflüssen gegenüber ungebundenem Chlorophyll wesentlich verbessert.

Zusatz von Lecithinen

Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, daß Lecithine Antioxidantien in ihrer Wirkung unterstützen. Mischungen aus Lecithinen und Antioxidantien zeigen eine größere Wirkung als diese alleine. Die synergistische Wirkung der Lecithine beruht in erster Linie darauf, daß sie katalytisch aktive Metallionen binden können, die Rückbil dung der Inhibitoren fördern und autokatalytisch wirkende Nebenprodukte der Autoxidation unschädlich machen können. Es ist daher zu vermuten, daß Lecithine zusammen mit Tocopherolen die Stabilität von Chlorophyll gegenüber oxidativen Einflüssen erhöhen.

Auswahl der Lecithine

Neben Eigenschaften, welche die Chlorophyllstabilität beeinflussen, interessieren beim Einsatz in Lebensmitteln auch die Emulgiereigenschaften der Lecithine. Da als mögliche Einsatzgebiete für Chlorophyll/Triglycerid- Produkte auch Lebensmittel mit mehr oder weniger hohem Wasseranteil in Frage kommen, sollte die stabile Bildung einer Öl in Wasser Emulsion mit berücksichtigt werden.

Das Fettsäurespektrum der zur Verfügung stehenden Soja- Lecithine entfiel als Auswahlkriterium, da alle ein annähernd gleiches Spektrum (9-11% Ölsäure, 60-64% Linolsäure und 6-8% Linolensäure) aufwiesen.

Die Säurezahl der Lecithine als weiterer Gesichtspunkt entfiel ebenso. Außer bei gereinigten Phosphatidylcholinen (AU < 95%), lag die Säurezahl meist zwischen 30 und 35 laut Herstellerangabe. Allerdings ist fraglich, inwieweit sich die SZ bei den üblichen Konzentrationen von Lecithin im Endprodukt überhaupt auf die Chlorophyllstabilität auswirkt.

Die Emulgierfähigkeit der Lecithine wurde ermittelt. Hierzu wurde ein Verfahren nach Pardun verwendet.

Meßgröße ist hierbei die Halbwertszeit, die vergeht, bis sich die Hälfte des zur Bereitung der Emulsion verwendeten Wassers abgesetzt hat.

Tabelle 13

Emulgierfähigkeit von Lecithinpräparaten (Handelsname, vgl. Tabelle 14)
Lecithin
Halbwertszeit [h]
Emulpur N\|5,0
Epikuron 200	<25
Epikuron 145 V	<25
Epicholin 60 P	18,2
Emulfluid E	1,5
Topcithine	0,4
Nathin 140	19,5
Nathin 3K	«0.1
Nathin 3KE	«0.1
Sterninstant	«0,1
Sternmuls M545*	0,2
Sternphil E*	0,5

*) Trotz Teilaufrahmung war noch eine Emulsion vorhanden. Ein völliger Zusammenbruch der Emulsion wurde in beiden Fällen nach 2,5 h beobachtet.

Chlorophyllstabilität bei Lecithinzusatz

Wie zuvor erwähnt kann sich der Zusatz von Lecithinen gemeinsam mit Antioxidantien positiv auf die Oxidations beständigkeit von Fetten auswirken. In den folgenden Versuchen sollte ermittelt werden ob diese Wir kung auch Chlorophyll schützt. Andererseits könnte der Ge halt an freien Fettsäuren in Lecithinpräparaten, sowie der hohe Anteil an Linol- und Linolensäure die Stabilität von Chlorophyll herabsetzen. Freie Fettsäuren würden dann, wie zuvor gezeigt, die Bildung von Pheophytin beschleunigen.

Die Lagerversuche wurden mit chromatographisch gereinigtem Chlorophyll in Kokosfett bei 40°C unter verschiedenen Lichtbedingungen durchgeführt.

Folgende Tabelle zeigt die hier verwendeten Lecithine und deren Konzentrationen im Öl. α-Tocopherol wurde in allen Ansätzen in einer Konzentration von 600 mgkg^-1 zugesetzt. Für die gereinigten Lecithine wird weiter die genaue Zusammensetzung laut Hersteller angegeben. Im weiteren Verlauf werden die Lecithine mit der in der Tabelle angegebenen Identifizierungsnummer, ID, bezeichnet.

Tabelle 14

Charakteristik der verwendeten Lecithine

Bei Lagerung im Dunklen zeigt sich, daß die Lecithine der Gruppe 1 (hohe SZ) abhängig von der Konzentration die Pheo phytinbildung erhöhen. Der stärkere Chlorophyllabbau bei höherer Lecithinkonzentration kann damit auf den höheren Gehalt an freien Fettsäuren zurückgeführt werden.

Abbildung 28 Chlorophyllstabilität in Kokosfett in Ab hängigkeit der zugesetzten Menge an Lecithin 1 laut Tabelle 14, 40°C, Dunkellagerung

Bei Lecithin 2 lagen keine Informationen über die genaue Zusammensetzung vor. Dadurch ist ein genauer Vergleich nicht möglich. Möglicherweise könnte das leicht saure Ver halten in Wasser für die schlechte Chlorophyllstabilität von Bedeutung sein. Das Produkt zeigt eine schlechtere Stabilität als Chl/Kokos ohne Zusatz (vgl.Abbildung 30).

Für die Lecithitte 3, 4 und 5, die in hohem Anteil Posphatidylcholin enthalten, wurde festgestellt:
Produkt 3 mit dem höchsten Anteil an Phosphatidylcholin besaß die größte Stabilität. Die Produkte 4 und 5 mit geringerem Anteil an Phosphatidylcholin waren weniger stabil als Produkt 3. Lecithin 5 zeigte mit dem geringsten PC-Gehalt dieser drei Lecithine dabei eine geringere Stabilität als Lecithin 4 (vgl. Abbildung 29).

Für Produkt 6 (vgl. Abbildung 30) konnte aufgrund fehlender Produktanalysen kein näherer Vergleich, bezüglich des Gehaltes an Phosphatidylcholin, mit den anderen Produkten vorgenommen werden. Dieses Lecithin/Kokos-Produkt war in seiner Chlorophyll-Stabilität ähnlich zu beurteilen, wie mit chromatographisch gereinigtem Chlorophyll gefärbtes Kokosfett.

Aus Abbildung 29 und 30 kann man entnehmen, daß sich die Reaktionsordnung des Chlorophyllabbaus ändert. Während der Abbau bei chromatographisch gereinigtem Chlorophyll in Kokosfett durch eine Reaktion erster Ordnung beschrieben werden kann, ändert sich anscheinend bei Zusatz von Lecithin und Tocopherol die Reaktionsordnung. Der Chloro phyllabbau läßt sich nun besser durch eine Reaktion zweiter Ordnung beschreiben. Diese Änderung der Reaktionsordnung war zuvor schon bei Tocopherolzusatz zu Chlorophyll rohextrakt/Kokos beobachtet worden. In wieweit Phosphati dylcholin zu dieser Änderung beitrug, war nicht zu ermitteln.

Für Produkt 3 zeigte sich, daß die Chlorophyllstabilität mit einem Zusatz von über 600 mgkg^-1 Lecithin nicht weiter erhöht wird. Deutlich wird dies im Vergleich der Halb wertszeiten der Reaktion zweiter Ordnung für die jeweiligen Konzentrationen (vgl. 3.3). Bei 300 mgkg^-1 ergab sich eine Halbwertszeit von 1370 h, bei 600 mgkg^-1 wurde die Halbwertszeit zu 1685 h berechnet. Eine weitere Erhöhung der Lecithinkonzentration bewirkte kein Veränderung der Halbwertszeit. Die Proben sind damit bedeutend stabiler, als die unter gleichen Bedingungen gelagerten nur α-Tocopherol enthaltenden Chlorophyll/Kokosfett-Produkte. Diese entsprachen, wie zuvor erwähnt, in ihrer Chlorophyll- Stabilität dem mit chromatographisch gereinigten Chloro phyll angefärbten Kokosfett. Tocopherol alleine zeigte, wie im vorigen Kapitel ermittelt, bei dunkler Lagerung und Verwendung von gereinigtem Chlorophyll als Färbemittel keinen Einfluß auf die Chlorophyllstabilität. Gemeinsam mit Phosphatidylcholin wurde dagegen die Stabilität verbessert. Da bei dunkler Lagerung photooxidative Einflüsse naturgemäß keine Rolle spielen, muß hier ein anderes stabilitätserhöhendes Prinzip zur Geltung kommen. Möglicherweise stabilisiert Phosphatidylcholin Magnesium im Zentrum von Chlorophyll.

Ein Vergleich der Abbaukurven ist in den Abbildungen 29 und 30 gegeben.

Abbildung 29 Chlorophyllstabilität in Kokosfett abhängig vom Lecithintyp (Tab.14), 40°C, Dunkellager ung, Lecithinkonzentration 600 mgkg^-1, Färbung mit chromatographisch gereinigtem Chlorophyll Abbildung 30 Chlorophyllstabilität in Kokosfett abhängig vom Lecithintyp (Tab.14), 40°C, Dunkellager ung, Lecithinkonzentration 600 mgkg^-1 Färbung mit chromatographisch gereinigtem Chlorophyll Abbildung 31 Vergleich der Chlorophyllstabilität in ver schiedenen Triglyceriden und in Kokosfett Zusatz von a-Tocopherol, α-Tocopherol und Phosphatidylcholin, 40°C, 3000 Lux (Zusatz von 630 mgkg^-1 α-Tocopherol, sowie 600 mgkg^-1 α- Tocopherol und 600 mgkg^-1 Phosphatidylcholin, Anfärbung mit chromatographisch gereinigtem Chlorophyll)

Mit dem erfolgsversprechendsten Lecithinprodukt 3 wurde abschließend noch ein Lagerversuch unter Belichtung vorgenommen. Abbildung 31 zeigt im Vergleich die Chlorophyll-Stabilität in den verschiedenen untersuchten Triglyceriden. Daraus geht hervor, daß Chlorophyll im mit α-Tocopherol und Phosphatidylcholin stabilisierten Kokos- Produkt die weitaus höchste Stabilität unter Belichtung besitzt. Durch Zusatz von Phosphatidylcholin enthält man ein Chlorophyllprodukt, welches eine hohe Lagerstabilität im dunkeln und eine stark verbesserte Stabilität unter Lichteinfluß besitzt. Einem möglichen industriellen Produkt sollte demnach zur Verbesserung der Chlorophyllstabilität Phosphatidylcholin und α-Tocopherol zugesetzt werden.

Gemäß der Erfindung wurde mittels zweier unterschiedlicher Chlorophyll-Trägerstoffe dessen Stabilität gegenüber pH-, Temperatur- und Lichteinflüssen verbessert. Als erster Trägerstoff wurde das Apoprotein von Hämoglobin untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die mit Häm nahe verwandten hydrophoben Chlorophylle a und b mit dem Protein Apohämoglobin Komplexe eingehen können. Apohämoglobin bindet damit auch andere, als die in der Literatur beschriebenen polareren Tetrapyrrole. Die Chlorophylle liegen dabei nicht nur in den 4 Häm- Bindungszentren gebunden vor, sondern sind noch an weitere Strukturen des Proteins gebunden. Das daraus gewonnene Produkt enthält 32,5% (w/w) bzw. 24 Mol Chlorophyll pro Mol Protein. Bezüglich seines pKi entspricht dieses Produkt Hämoglobin. Der Komplex bildet in Wasser eine trübe stabile Lösung. Durch enzymatische Hydrolyse mit Endopeptidasen erhielt man ein Produkt, welches nur noch geringe Trübung in Wasser und einen nur schwach ausgeprägten pKi-Wert besaß. Abhängig von der Hydrolysedauer wurde eine verminderte Chlorophyllbindung beobachtet. Im hydro lysierten Chlorophyll/Apohämoglobinkomplex wurde im Durchschnitt 28% (w/w) Chlorophyll gebunden. Das hydrolysierte Produkt war gegenüber thermischer Denaturierung stabiler als das nicht veränderte Protein und stellt damit bei immer noch hohem Chlorophyllanteil eine Alternative zum nicht veränderten Komplex dar.

Die Stabilität von Chlorophyll im Komplex mit Apohämoglobin, war gegenüber Temperatur, Licht und pH deutlich höher als bei nicht gebundenem Chlorophyll. Bei Dunkellagerung war gebundenes Chlorophyll bei pH 7 und 25 °C mit einer Halbwertszeit von 121 Tagen zweimal stabiler als ungebundenes Chlorophyll. Bei einem pH-Wert von 5 war der Komplex mit einer Halbwertszeit von 35 Tagen fünfmal stabiler als nicht gebundenes Chlorophyll. Unter Belichtung war Chlorophyll bei 25 °C, pH 7, etwa fünf-, bei pH 5, dreimal stabiler als das ungebundene Chlorophyll. Die Stabilität gegenüber Licht betrug mit einer Halbwertszeit von 37 Tagen bei pH 7 etwa ein Viertel der Stabilität der unbelichteten Proben.

Man erhält durch die Bindung von Chlorophyll an Apohämoglobin einen neuen Trägerstoff, welcher sich bezüglich seinen Lösungseigenschaften, seinem Chlorophyll gehalt und seiner Stabilität gegenüber herkömmlichen Trägern für den Einsatz in Lebensmitteln eignet.

Bei der Bindung des Chlorophylls an Hämoglobin wird dieses Protein in Wasser gelöst, der pH-Wert auf 6,8 bis 7,0 eingestellt und das Chlorophyll in fester oder in gelöster Form zugegeben.

Die Bindung von Chlorophyll an das Protein wird durch Einwirkung hoher Scherkräfte im Verfahren hervorgerufen. Bei Zugabe von gelöstem Chlorophyll geschieht dies mittels eines Homogenisators (Rührzeit 5 Minuten).

Bei festem Chlorophyll wird die Homogenisierungswirkung durch Rühren von Glasperlen im Reaktionsgefäß erreicht (Rührzeit 60 Minuten).

Der Komplex kann durch Fällung bei pH 7,1 gewonnen werden. Gleichzeitig wird dadurch nicht gebundenes Chlorophyll vom Produkt abgetrennt.

Da auch in Lipiden gelöstes Chlorophyll für manche Lebensmittel-Kompositionen geeignet ist, wurden als zweiter Trägerstoff für Chlorophyll drei Triglyceride untersucht. Die Stabilität des Chlorophylls hängte dabei in hohem Maß vom Gehalt der Triglyceride an Linol- und Linolensäure ab. In Sonnenblumenöl mit einem hohen Anteil dieser Fettsäuren war die Stabilität geringer, als in Kokosfett und dem daraus hergestellten Miglyol. In Kokosfett konnte beobachtet werden, daß zusammen mit Chlorophyll extrahierte Stoffe die Chlorophyllstabilität herabsetzen. Durch Abtrennung dieser Stoffe mittels chromatographischer Methoden oder durch Kälteverfahren konnte die Stabilität verbessert werden. Eine weitere Erhöhung der Chlorophyllstabilität in Kokosfett konnte durch Zusatz von α-Tocopherol und Phosphatidylcholin erreicht werden. Ein Anstieg der Chlorophyllstabilität wurde bis zu einer Tocopherolkonzentration von 630 mgkg^-1 beobachtet. Eine weitere Erhöhung der Konzentration hatte nur noch geringen Einfluß auf die Chlorophyllstabilität. Zusammenfassend läßt sich für den Zusatz von Lecithinen feststellen, daß die Chlorophyllstabilität ab einer Konzentration von 360 mgkg^-1 für reines Phosphatidylcholin eindeutig höher war als in nur mit α-Tocopherol versetztem Öl. Eine Steigerung der Konzentration über 600 mgkg^-1 hatte keine weitere Stabilitätserhöhung zur Folge. Bei 40°C betrug die maximal erreichte Halbwertszeit 70 Tage. Je höher der Phosphatidylcholingehalt des verwendeten Lecithins war, umso größer war in diesen Versuchen die Stabilität von Chlorophyll. Unter Belichtung unterstützte Phosphatidyl cholin α-Tocopherol in seiner Schutzwirkung auf Chloro phyll. Allerdings war die Stabilität des Chlorophylls gegenüber unbelichteten Proben stark herabgesetzt. Durch Zugabe von Phosphatidylcholin und dem natürlichen Antioxidants α-Tocopherol zu einem linol- und linolensäure armen Triglycerid, erhält man bei Zugabe von gereinigtem Chlorophyll ein neuartiges Produkt, welches sich bezüglich seiner Chlorophyllstabilität gegenüber konventionellen Chlorophyll/Öl-Produkten sehr gut zum Einsatz in Lebensmitteln eignet.

Bei der Färbung dieses Öl/Fetts mit dem zuvor gereinigten Chlorophyll wird der Lösungsmittelextrakt von Grünpflanzen auf -20°C abgekühlt und 4 Stunden bei dieser Temperatur gehalten.

Die ausgefällten Lipide werden dann durch Zentrifugation abgetrennt.

Das Lösungsmittel wird unter Vakuum bei einer Verdampfungstemperatur von 25°C abgetrennt.

Ausgefallenes Chlorophyll wird abzentrifugiert und mit einem linol- oder linolensäurearmen Fett (Kokos-, Palmkernfett oder ähnliche), welches 800 mg/kg α-Tocopherol und Phosphatidylcholin enthält, gelöst. Die Menge an zugesetztem Fett entspricht der gewünschten Endkonzentration von Chlorophyll im Produkt.

Der Einsatz dieses Produktes bei Lebensmitteln ist besonders beispielsweise bei Hart-, Weichkaramel, Eiskrem, gelartigen Produkten, Marzipan, Kakaobutter und davon abgeleitete Produkte geeignet.

Sowohl das Protein als auch das Fettprodukt erwiesen sich unter UHT-Bedingungen und Temperaturen unterhalb 80°C als stabil.

Weniger geeignet ist das Produkt für Lebensmittel, die längere Zeit höheren Temperaturen (größer 60°C) ausgesetzt werden.

Gewinnung von Chlorophyll im Labormaßstab

Als Lösungsmittel wurden falls nicht anders erwähnt Aceton oder Ethanol verwendet. Die Extraktion wurde wie folgt durchgeführt:

- 200 g Pflanzenmaterial in einem Waring Blender, Model 32 BL 80, mit 800 ml LM versetzen,
- 1 min auf höchster Stufe homogenisieren,
- Feststoffe über Faltenfilter abtrennen,
- Filter nachwaschen bis Filter farblos,
- Filtrat in einem Rotationsverampfer, bei einer Verdampfungstemperatur von 20°C aufkonzentrieren,
- ausgefallenes Chlorophyll durch Zentrifugation abtrennen Kühlzentrifuge, Drehzahl 10000 min-1, Zeit 10 min, Temperatur 20°C,
- Rohchlorophyll für weitere Versuche verwenden.

Gewinnung von Chlorophyll im Technikumsmaßstab

Bei der Gewinnung des Chlorophylls wurde als Lösungsmittel Ethanol verwendet.

Dafür wurden folgende Apparate verwendet:

- Kutter,
- Monopumpe,
- Siebmantelzentrifuge, Trommeldurchmesser 500 mm
- Zahnradpumpe,
- Rotationsverdampfer,
- Vakuum Controller,
- Vakuumpumpe,
- Kühlung Extrakt: Tiefkühlkammer Lebensmitteltechnikum
Kühlung Rotationsverdampfer: Leitungswasser
Chlorophyll/Apohämoglobin
Herstellung des Apoproteins.

Verfahren nach Rossi/Fanelli

- 1,5 g Haemoglobin Bovine (Sigma) in 50 ml H2O, pH = 3 lösen
- Aceton mit 5 ml, 1 moll-1 HCl ansäuern
- auf -20°C kühlen
- Haemoglobinlösung unter Rühren eintropfen
- nach Eintropfen, 15 min weiterrühren
- über Faltenfilter filtrieren
- 3 mal mit neutralem Aceton nachwaschen
- Apohaemoglobin trocknen

Verfahren nach Unilever

- 200 ml Methanol mit 2 g 35% HCl versetzen auf 35°C erwärmen
- 10 g Haemoglobin unter Rühren zugeben
- nach 15 min zentrifugieren
- Verfahren zweimal wiederholen
- Präzipitat mit 100 ml 0,45 moll-1 Methanol/Natronlauge waschen, zentrifugieren, weiterer Verwendung zuführen

Herstellung des Komplexes Analytisches Verfahren

- die gereinigte Chlorophyll-Lösung in einen Rundkolben geben, ausreichende Menge (10% der Flüssig keitsmenge) an Glasperlen (d = 1 mm) zugeben, im Vakuumrotationsverdampfer bei mittlerer Drehzahl Lösungsmittel abdampfen, so daß Chlorophyll auf die Glasperlen aufgetragen wird
- Proteinlösung in Rundkolben geben, am Rotationsverdampfer 60 min bei höchster Drehzahl (120 Upm) rühren, Glasperlen und nicht gebundenes Chlorophyll durch Filtration über Faltenfilter abtrennen
- aus dem Filtrat über Fällung am pKi, oder chromatograph ische Verfahren Chlorophyll/ApoHb für weitere Versuche gewinnen.
z. B.: 1 l Acetonextrakt mit 1 g/l Chlorophyll, 100 ml Glasperlen, 3 g Protein in 200 ml Wasser lösen und zugeben, gewonnenes Protein enthält 30% Chlorophyll

Präparatives Verfahren

- Konzentration der Protein- und der Chlorophyllösung bestimmen
- Proteinlösung auf 4°C kühlen
- mit Hilfe eines Homogenisators (Ultraturrax) Chlorophyll- Lösung zur ApoHb-Lösung zumischen, bis gewünschtes Verhältnis Chlorophyll/ApoHb erreicht ist.
- Gewinnung des Chlorophyllkomplexes durch Fällung am pKi,
z. B. 1 l Proteinlösung mit 9 g/l Protein, + 100 ml Chlorophyllösung mit 3% Chlorophyllgehalt, 5 min homogenisieren, Produkt enthält 30% Chlorophyll.

Überprüfung der Chlorophyllbindung

Die Überprüfung der Bindung von Chlorophyllen an ApoHb- Präparate wurde mit Hilfe eines von Stryer entwickelten Verfahrens durchgeführt. Die einzelnen Präparate wurden mit 1-Anilino-8-Naphthylsulfonat bei pH = 6,8 in 0.1 mol/l Phosphatpuffer versetzt. Das Molverhältnis ApoHb/ANS sollte dabei kleiner 0,25 sein. Das weitere Verfahren ergibt sich aus den folgenden Ausführungen.

Dialyse

- 1ml ApoHb/Chlorophyll Präparat mit ANS-Lösung in einen Dialyse-Schlauch, 16000 D, geben,
- 36 h gegen 2 l bidest. Wasser bei 5°C dialysieren, alle 12 h Wasser austauschen,
- gleiches Verfahren für Nullprobe aus ApoHb und ANS durchführen,
- Messung der Extinktion der dialysierten Probe im Absorptionsmaximum von ANS bei 350 nm,
- parallel dazu Protein- und Chlorophyllkonzentration bestimmen
- Nullprobe mit reiner ApoHb-Lösung nach gleichem Muster durchführen.

Gelchromatographie

Chromatographische Bedingungen:

- Trennsäule: Glassäule, 1 = 150 mm, d = 12 mm
- mobile Phase: 0.01 M Phosphatpuffer, pH = 6,8
- stationäre Phase: Sephadex® G-25.

Verfahren im einzelnen:

- Probe/Nullprobe mit ANS Lösung versetzen,
- 1 ml der Mischung auf die Trennsäule auftragen,
- eluierte Banden auffangen und Extinktion bei 350 nm messen
- parallel dazu Protein- und Chlorophyllkonzentration bestimmen.

Dieses Verfahren wurde auch zur Reinigung von hydrolysiertem ApoHb/Chlorophyll-Präparaten herangezogen, da diese nicht mehr durch Fällung am pKi von überschüssigem Chlorophyll zu trennen waren.

Reinigung des Rohchlorophylls Chromatographisches Verfahren

Das Chlorophyllkonzentrat wurde säulenchromato graphisch gereinigt. Dadurch sollte ausgeschlossen werden, daß mit Chlorophyll extrahierte Lipide die Stabilität von Chlorophyll in den Lagerversuchen beeinflußt. Auch sollten eventuell vorhandene Chlorophyllabbauprodukt entfernt werden. Das genaue Verfahren wurde von Omata und Murata übernommen. Die Chlorophylle a und b wurden gemeinsam von der Trennsäule eluiert und der weiteren Verwendung zugeführt:

- Lösungsmittel Aceton/Wasser (80/20)
- Säule: Glassäule, d = 60 mm, h = 250 mm
- stationäre Phase: Cellulose DEAE-SH, Kapazität 0,85, Fa. Serva

Kälteverfahren

Zur Abtrennung mitextrahierter Lipide wurde in einem zweiten Verfahren Kälte angewendet.

Die zur Abtrennung der Lipide notwendige Temperatur wurde ermittelt. Dazu wurde Rohextrakt in Zentrifugengläser gefüllt, auf die gewünschte Temperatur abgekühlt, 4 h gehalten und anschließend zentrifugiert. Das Trennergebnis wurde über die Bestimmung der Säurezahl im Überstand ermittelt.

Für das Technikumsverfahren wurde das Rohextrakt auf -20°C abgekühlt, die Temperatur mindestens 4 h gehalten und die ausgefallenen Lipide durch Zentrifugation entfernt verwendet. Die Temperatur wurde auf ebenfalls -20°C festgelegt. Eine vollständige Abtrennung wurde bei einer Drehzahl von 5000 min^-1 nach 5 min erreicht.

Herstellung der Produkte

Die Triglyceride wurden entsprechend der gewünschten Kon zentration von Chlorophyll im Endprodukt während der Kon zentrierung dem Extrakt zugesetzt oder mit dem Chloro phyllpräzipitat nach der Konzentrierung vermischt. Eventu ell mitgeschlepptes Wasser konnte durch Zentrifugation und Dekantieren abgetrennt werden. Daneben wurden zur Verbes serung der Stabilität die im folgenden Kapitel beschrie benen Zusätze zugesetzt.

Beispiel: 20 l gereinigter Extrakt mit einem Chlorophyllgehalt von 400 mg/l bei 25°C Verdampfungstemperatur in einem Rotationsverdampfer konzentrieren bis Chlorophyll ausflockt. Chlorophyll aus den verbleibenden 6 l Flüssigkeit durch Zentrifugation abtrennen und in mit je 800 mg/kg α-Tocopherol und Phosphatidylcholin versetztem Kokosfett lösen. Aus der Konzentrationsstufe wurden 10 g Chlorophyllprodukt entnommen, welches mit 70 g des Kokosfettes versetzt wurde. Das Endprodukt enthielt 9,5% Chlorophyll.

Stabilitätsverbessernde Zusätze

Kokosfett wurden zur Verbesserung der Chlorophyllstabilität folgende Komponenten zugesetzt:

- α-Tocopherol <98%
- Lecithine entsprechend folgender Tabelle

Tabelle 19

Bezeichnung und Charakteristik der verwendeten Lecithine, Herstellerangaben

Lagerversuche

Die Chlorophyllpräparate wurden unter den unten aufgeführten definierten Bedingungen gelagert und in regelmäßigen Abständen auf ihre Pigmentzusammensetzung untersucht. Bedingt durch ihre Wasserlöslichkeit konnten die Chl/ApoHb-Proben zusätzlich zu unterschiedlichen Temperatur- und Lichtbedingungen, auch bei verschiedenen pH-Werten auf ihre Stabilität untersucht werden.

Die Bedingungen waren im einzelnen:

- belichtet: Hg-HD Lampen, Abstand der Proben: 600 mm, 3000 Lux vor Probe, Temperaturen: 20 und 40°C,
- unbelichtet: Temperaturen: 20 und 40°C.

Geräte:

- belichtet: Klimakammern des Lebensmitteltechnikums, TUM Weihenstephan, Luxmeter,
- unbelichtet: thermostatisierte Wasserbäder,
- Bestimmung der Chlorophylle und deren Abbauprodukte mittels HPLC.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines natürlichen, stabilen grünen Farbstoffes auf Basis von Chlorophyll für die Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie, dadurch gekennzeichnet, daß Chlorophyll an entfärbtes Hämoglobin (Apohämoglobin), welches als Komplex stabilisator fungiert, in wäßriger Lösung gebunden wird, wobei insbesondere das Protein (Apohämoglobin) in Wasser gelöst, der pH-Wert auf 6,8-7,0 eingestellt und das Chlorophyll in fester oder gelöster Form zugegeben wird.

2. Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruches 1, dadurch gekennzeichnet, daß einem linol- oder linolen säurearmen Öl/Fett Lecithine als Komplexstabilisatoren zugesetzt werden und daß dieses Öl/Fett mit zuvor gereinigtem Chlorophyll gefärbt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem linol- und linolensäurearmen Öl/Fett Phosphatidylcholin zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß einem linol- und linolensäurearmen Öl/Fett Antioxidantien, insbesondere α-Tocopherol zugesetzt wird.