DE4120139A1 - Enzymimmunoassay-verfahren und testset hierzu - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein heterogenes Festphasen Enzymim­ munoassay-Verfahren für die Routinediagnostik und ein Testset hierzu.

In der Patentliteratur sind derartige Verfahren und Vorrich­ tungen mit unterschiedlichen Schwerpunkten und Anwendungsge­ bieten bekanntgeworden.

Beispielsweise zeigen die Offenlegungsschriften
- DE 35 24 451
- DE 37 31 227
- DE 38 42 125
den Ausgangspunkt der Erfindung entsprechend folgenden Schritten, wobei man

• a1) eine Mikrotestplatte mit rasterförmig eingeteilten Reak­ tionsflächen, gebildet durch die Innenwandungen der Kavi­ täten, mit hierauf gebundenem, gegen ein zu messendes An­ tigen spezifischen Antikörper oder hierauf gebundenes, gegen einen zu messenden Antikörper spezifisches Antigen verwendet
• b1) das in unterschiedlichen Konzentrationen enthaltene Anti­ gen oder den in unterschiedlichen Konzentrationen enthal­ tenen Antikörper von Proben- und/oder Kontrollösungen an den, auf den Reaktionsflächen gebundenen Antikörper oder an das, auf den Reaktionsflächen gebundene Antigen anla­ gert
• c1) die Reste der auf den Reaktionsflächen anhaftenden Pro­ ben- und Kontrollösungen abwäscht
• d1) ein an Antikörper oder Antigengekoppeltes, voll wirksa­ mes Enzym einer Enzym-Antikörper- oder Enzym-Antigen-Lö­ sung an das zuvor fixierte Antigen oder an den zuvor fixierten Antikörper anlagert
• e1) die Reste der auf den Reaktionsflächen anhaftenden Enzym- Antikörper- oder Enzym-Antigen-Lösung abwäscht
• f1) die Enzymaktivität des zuvor fixierten Enzym-Antigens oder Enzym-Antikörpers mißt.

Neben der im Verfahrensschritt a1) beschriebenen Mikrotest­ platte enthält ein Testset für die Routinediagnostik noch verschiedene Lösungen, wie beispielsweise
- eine Antigen oder einen Antikörper enthaltende Kontrollösung
- eine Substratlösung im Falle der fotometrischen Auswertung.

Eine der Nachteile des vorgenannten Enzymimmunoassays zeigt sich beim vorhergehenden Verfahrensschritt b1) im Rahmen der Anlagerung des Antigens oder Antikörpers der Proben- und Kontrollösungen an den auf den Reaktionsflächen gebundenen Antikörper oder an das auf den Reaktionsflächen gebundene Antigen.

Für diesen Vorgang müssen die einzelnen Proben- und Kontrollösungen in die entsprechenden, beschichteten Kavitäten der Mikrotestplatte pippetiert werden.

Da üblicherweise in einer Mikrotestplatte 12×8 bzw. 96 Ka­ vitäten eingeformt sind, benötigt man für die Pipettierung eine Zeitdauer von ca. 20 Minuten. Dies bedeutet, daß bei der zuerst einpipettierten Probe- bzw. Kontrollösung eine um ca. 20 Minuten verlängerte Inkubationszeit, bezogen auf die zuletzt einpipettierte Probe vorliegt, und dieses bei größen­ ordnungsmäßig häufig geforderten Inkubationszeiten von nur 60 Minuten. Dadurch ist eine exakte Standardisierbarkeit dieses Gesamtsystems nicht gewährleistet.

Ein weiterer Nachteil der beschichteten Mikrotestplatte liegt in den erforderlichen hohen Inkubationszeiten, da die in Lö­ sung von Reaktanten zurückzulegenden Wegstrecken in den ein­ zelnen Kavitäten einer Mikrotestplatte konzeptbedingt lang sind.

Da der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Reaktion in erster Linie durch die diffusionsgeschwindigkeitsbedingte Konzentrationsabnahme der Reaktanten in Lösung bestimmt wird, nimmt der benötigte Zeitbedarf für die Inkubation bei definierten Randbedingungen (Temperatur = konstant, etc.) exponentiell zur Strecke zu. Hierbei liegt die Formel zugrunde, wobei

mit
=mittlere Konzentration des gelösten Reaktanten im gesamten Lösungsvolumen
C_s=Anfangskonzentration des gelösten Reaktanten
t=benötigte Zeit

h=Planck'sches Wirkungsquantum
D=Diffusionskoeffizient der gelösten und diffundierenden Spezies.

In einem anderen Konzept entsprechend einem Teilaspekt der DE-OS 35 24 451 verwendet man Kugeln, welche mit dem spe­ zifischen Antikörper oder Antigen beschichtet sind. Wie in der DE-OS 38 42 125 dargelegt, so versieht man die Kavitäten von unbeschichteten Mikrotestplatten mit derartigen Kugeln. Bei diesem Konzept sind die Inkubationszeiten aufgrund der reaktionsbestimmenden kurzen Wegstrecken (Kugeloberfläche­ Innenwandung der Kavität) gering.

Weiterhin sind im allgemeinen Stand der Technik unbeschich­ tete, nicht für Enzymimmonoassays konzipierte Pinplatten mit rasterförmig eingeteilten Pins bekannt.

Der im Anspruch 1 (Verfahren) bzw. im Nebenanspruch 5 (Vor­ richtung) angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, die Reproduzierbarkeit hinsichtlich der Inkubation des in den jeweiligen Proben- und Kontrollösungen enthaltenen Antigens oder Antikörpers bei kurzen Inkubationszeiten zu verbessern.

Einer der mit der Erfindung erzielten Vorteile besteht darin, daß der Inkubationszeitraum bezogen auf das in den jeweiligen Proben- und Kontrollösungen enthaltene Antigen oder den in dem jeweiligen Proben- und Kontrollösungen enthaltenen Anti­ körper für alle Reaktionsflächen auf den Pins einer Pinplatte aufgrund des Aufsteckvorgangs absolut gleich ist.

Weiterhin sind die Inkubationszeiten gering, da die zurückzu­ legenden Wegstrecken (Pinoberfläche-Innenwandung der Kavität) für die Reaktanten gering sind.

Gemäß den Ausgestaltungen der Erfindung entsprechend den Ansprüchen 2 und 3, sieht man zur Abwaschung der Reste von Lö­ sungen in überraschend einfacher und kostengünstiger Weise vor, die beschichtete Pinplatte in einer Waschlösung einzu­ tauchen und hierin zu bewegen. Dagegen gibt der Stand der Technik in umständlicher und zeit- und geräteaufwendiger Weise im Falle der beschichteten Mikrotestplatten vor, ent­ weder ein ELISA-Waschgerät oder eine mehrkanalige Multipi­ pette zu verwenden.

Entsprechend dem Anspruch 4 ergeben sich durch das Aufstecken der Pinplatte auf die Komplementärplatte ebenfalls nahezu gleich lange und damit reproduzierbare Reaktionszeiten für die Substratlösung.

Mit der Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Testsets ent­ sprechend dem Anspruch 6 erzielt man, daß die jeweiligen Re­ aktionsflächen auf den Pins unverwechselbar beim Aufstecken der Pinplatte auf die Komplementärplatte in die vorgesehenen Kavitäten der Komplementärplatte eintauchen.

Nach dem Anspruch 7 ist die Pinplatte modular aus einzeln entnehmbaren Streifen zu 8 Pins aufgebaut. Diese Reaktions­ streifen ermöglichen ein ökonomischeres Arbeiten, da bei wenigen zu untersuchenden Patientenseren nicht eine gesamte, beispielsweise mit 12 Reihen mit je 8 Pins versehene, starre Pinplatte verwendet werden muß. Weiterhin erlaubt es das Mo­ dulsystem, durch Aufstecken von 8er-Reaktionsstreifen mit verschiedener Spezifität (d. h. mit verschiedenen zu unter­ suchenden Antikörpern oder Antigenen beschichtet) Parallel­ untersuchungen simultan auf einem Pindeckel durchzuführen.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden an Hand der Zeichnungen beschrieben.

Es zeigen die

Fig. 1 eine erf indungsgemäß ausgebildete Pinplatte perspek­ tivisch dargestellt,

Fig. 2 eine erf indungsgemäße Komplementärplatte perspek­ tivisch dargestellt,

Fig. 3 die Pinplatte und die Komplementärplatte ineinander gesteckt in der Seitenansicht im Schnitt dargestellt,

Fig. 4 einen Pin einer Pinplatte eingetaucht in die ent­ sprechende Kavität einer Mikrotestplatte als Aus­ schnitt der Seitenansicht im Schnitt vergrößert dar­ gestellt

Fig. 5 eine verkleinerte Pin- und Komplementärplatte perspektivisch dargestellt,

Fig. 6 ein System mit modulartig miteinander verbundenen Platten perspektivisch dargestellt.

Das für die Erfindung ausgewählte Beispiel betrifft ein hete­ rogenes Festphasen Enzymimmunoassay-Verfahren für die Rou­ tinediagnostik zum Nachweis von Antikörpern gegen Helico­ bacter pylori. Dieses Bakterium ist für die B-Gastritis ver­ antwortlich und stellt auch einen wesentlichen Cofaktor bei der Entstehung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren dar.

Die Fig. 1 zeigt eine als Untersuchungsplatte dienende Pin­ platte 10, wobei die einzelnen Pins 11 rasterförmig ange­ ordnet sind. Beispielhaft weist diese Pinplatte 10 sechs­ undneunzig Pins 11 auf, wobei pro Reihe zwölf und pro Spalte acht Pins 11 enthalten sind. Wie aus der Darstellung hervor­ geht, ist die Pinplatte aus einzelnen, entnehmbaren Streifen entsprechend einer Spalte zu 8 Pins aufgebaut.

Die Oberflächen der Pins 11 bilden hierbei die Reaktions­ flächen, worauf das gegen den zu messenden Antikörper spezifische Antigen oder der gegen das zu messende Antigen spezifische Antikörper gebunden ist.

Die Fig. 2 stellt eine mit der Pinplatte zusammenpassende Mikrotestplatte (Komplementärplatte) 20 dar. Bei dieser Komplementärplatte 20 korrespondieren die Kavitäten 21 hinsichtlich des rasterförmigen Aufbaus mit den Pins der zu­ vor dargestellten Pinplatte.

Wie in der Fig. 3 dargestellt, ist die Pinplatte 10 derart in die Komplementärplatte 20 steckbar, daß die Reaktionsflächen der Pinplatten 10 in die entsprechenden Kavitäten 21 der Komplementärplatte 20 eintauchen.

Auf konstruktive Einzelheiten des Testsets eingehend, zeigt die Fig. 4 ausschnittsweise eine modifizierte Formgebung der Pins und der Kavitäten. Statt einer Kugelform entsprechend der Fig. 3 sind der Pinkopf und die Kavität nun in ferti­ gungsgünstiger Weise zylindrisch ausgebildet.

Wie die Fig. 1 und die Fig. 2 zeigt, weisen die Ecken sowohl der Pinplatte, als auch der Komplementärplatte, geometrische Formgebungen auf. Die abgerundeten und abgeschrägten Ecken 14 bis 17 der Pinplatte und die hierzu entsprechenden abgerunde­ ten und abgeschrägten Ecken 24 bis 27 der Komplementärplatte bezwecken, daß beide Platten in unverwechselbarer Stellung ineinander steckbar sind.

In der Fig. 5 ist eine rasterförmige Einteilung dargestellt, bei der die Pins 11 der Pinplatte 10 und die hierauf abge­ stimmten Kavitäten 21 der Komplementärplatte 20 in einer ein­ zigen Linie und voneinander beabstandet angeordnet sind. Die außen an der Pinplatte angebrachte Rändelung 19 verbessert die Handhabung.

Während die vorhergehende Lösung eine reduzierte Anzahl von Pins bzw. Kavitäten pro Platte betrifft, geht es nachfolgend um das modulartige Verbinden einzelner Platten, so daß gleichzeitig und rationell mehrere Pinplatten in die zuge­ hörigen Komplementärplatten steckbar sind.

Hierzu weisen entsprechend der Prinzipskizze in der Fig. 6 die Platten 10 bzw. 20 Halterungen 18 bzw. 28 auf, so daß diese übereinander und voneinander beabstandet an den Ständern 30 bzw. 40 befestigbar sind.

Nicht mit dargestellt ist das Konzept zum modulartigen Verbinden, wobei die einzelnen Platten in einer Ebene nebeneinander verbindbar sind.

In der nachfolgenden Gegenüberstellung wird entsprechend dem gewählten Ausführungsbeispiel ein handelsüblich erhältlicher Routinetest mit der Erfindung verglichen.

handelsüblicher Routinetest
erfindungsgemäßer Routinetest
1) Verwendung einer Mikrotestplatte, wobei die Innenflächen der Kavitäten beschichtet sind mit abgetötetem Antigen (Helicobacter pylori)
1) Verwendung einer Pinplatte 10 entsprechend der Fig. 1, wobei die Oberfläche der Pins 11 beschichtet sind mit abgetötetem Antigen (Helicobacter pylori)
2) Pipettierung der Serum- und Kontrollösungen in die Kavitäten der beschichteten Mikrotestplatte. Dauer: 20 min	2) Pipettierung der Serum- und Kontrollösungen in die Kavitäten 21 einer Komplementärplatte 20 entsprechend der Fig. 2. Dauer: 20 min
3) Inkubation. Dauer: 60 min (keine Temperaturangabe)	3) Inkubation, wozu man für einen bestimmten Zeitraum die Pinplatte 10 auf die Komplementärplatte 20 steckt, wobei sich die jeweiligen Reaktionsflächen mit den entsprechenden Lösungen benetzen. Dauer: 15 min (37°C)
4) Abwaschung der in den Kavitäten enthaltenen Serum- und Kontrollösungen mit einem ELISA-Waschgerät oder einer Mehrkanal-Multipipette. Dauer: 10 min	4) Abwaschung der auf den Pins 11 haftenden Serum- und Kontrollösungen, wozu man in einfacher Weise die Pinplatte 10 in ein Behälter mit einer Waschlösung eintaucht und hierin bewegt. Dauer: 0,15 min
5) Pipettierung einer Enzym-Konjugatlösung in die zuvor ausgewaschenen Kavitäten der Mikrotestplatte mit einer Multikanalpipette. Dauer: 1 min	5) Pipettierung einer Enzym-Konjugatlösung in eine weitere, unbenutzte Komplementärplatte 20 mit einer Multikanalpipette. Dauer: 1 min
6) Inkubation. Dauer: 45 min	6) Inkubation, wozu man wie schon zuvor dargelegt, die Pinplatte 10 auf die zuvor vorbereitete Komplementärplatte 20 aufsteckt. Dauer: 15 min, 37°C
7) Abwaschung der in den Kavitäten enthaltenen Enzym-Antikörperlösung wie schon zuvor mit einem Waschgerät oder einer Pipette. Dauer: 10 min	7) Abwaschung der auf den Pins haftenden Enzym-Antikörperlösung wie schon zuvor mittels einfachem Eintauchen und Bewegen in einer Waschlösung. Dauer: 0,15 min
8) Pipettierung einer Substratlösung in die zuvor ausgewaschenen Kavitäten mit einer Multikanalpipette. Dauer: 1 min	8) Pipettierung einer Substratlösung in eine dritte, unbenutzte Komplementärplatte mit flachem Boden mittels einer Multikanalpipette. Dauer: 1 min
9) Inkubation. Dauer: 10 min	9) Inkubation wozu man wieder die Pinplatte auf die dritte Komplementärplatte aufsteckt. Dauer: 5 min
10) Fotometrische Auswertung, (Verfärbung der Substratlösung ist ein Maß für die Enzymaktivität) der Mikrotestplatte mit einem ELISA-Reader. Dauer: 10 min	10) Fotormetrische Auswertung, (Verfärbung der Substratlösung ist ein Maß für die Enzymaktivität) der flachbodenen Komplementärplatte mit einem ELISA-Reader. Dauer: 10 min

Resultierend aus dem zuvor konkret dargelegten Ausführungs­ beispiel wird nachfolgend der mit der Erfindung und deren Ausgestaltungen erzielte hohe technologische Fortschritt zu­ sammenfassend dargestellt:

• - Zeitersparnis von ca. 100 min resultierend aus
  • - den verkürzten Inkubationszeiten entsprechend den Schrit­ ten 3, 6 und 9 aufgrund der verkürzten diffusionsrelevan­ ten Wegstrecken
  • - der vereinfachten und schnelleren Abwaschung entsprechend den Schritten 4 und 7
• - Reproduzierbare und standardisierbare Ergebnisse, da die Inkubationszeiträume entsprechend den Schritten 3, 6 und 9 für die einzelnen Reaktionsflächen einer Untersuchungsplat­ te absolut gleich sind (nach dem dargelegten Stand der Technik verfälscht die Zeit für die Pipettierung die fest­ gelegten Inkubationszeiträume)
• - Einfache Anbringung der Beschichtung auf die Pinober­ flächen.

Bezugszeichenliste

10 Pinplatte
11 Pin
12 Pinhals
13 Pinkopf
14, 15 abgerundete Ecke
16, 17 abgeschrägte Ecke
18 Halterung
19 Rändelung
20 Komplementärplatte
21 Kavität
24, 25 abgerundete Ecke
26, 27 abgeschrägte Ecke
28 Halterung
30 Ständer für Pinplatten
40 Ständer für Komplementärplatten

Claims (7)

1. Heterogenes Festphasen Enzymimmunoassay-Verfahren für die Routinediagnostik, bei dem man

• a1) eine Untersuchungsplatte mit rasterförmig eingeteilten Reaktionsflächen mit hierauf gebundenem, gegen ein zu messendes Antigen spezifischem Antikörper oder hierauf gebundenes, gegen einen zu messenden Antikörper spezi­ fisches Antigen verwendet
• b1) das in unterschiedlichen Konzentrationen enthaltene Antigen oder den in unterschiedlichen Konzentrationen enthaltenen Antikörper von Proben- und/oder Kontrollösungen an den, auf den Reaktionsflächen gebundenen Antikörper oder an das, auf den Reaktionsflächen ge­ bundene Antigen anlagert
• c1) die Reste der auf den Reaktionsflächen anhaftenden Proben- und Kontrollösungen abwäscht
• d1) ein an Antikörper oder Antigen gekoppeltes, voll wirk­ sames Enzym einer Enzym-Antikörper- oder Enzym-Anti­ gen-Lösung an das zuvor fixierte Antigen oder an den zuvor fixierten Antikörper anlagert
• e1) die Reste der auf den Reaktionsflächen anhaftenden Enzym-Antikörper oder Enzym-Antigen-Lösung abwäscht
• f1) die Enzymaktivität des zuvor fixierten Enzym-Antigens oder Enzym-Antikörpers mißt, dadurch gekennzeichnet, daß man
• a2) als Untersuchungsplatte eine Pinplatte (10) verwendet, wobei die Oberflächen der Pins (11) die Reaktionsflä­ chen bilden
• g) eine mit der Pinplatte (10) zusammenpassende Mikro­ testplatte (Komplementärplatte) (20) vorsieht, wobei
  • - die Pins (11) der Pinplatte (10) hinsichtlich des rasterförmigen Aufbaus mit den Kavitäten (21) der Komplementärplatte (20) korrespondieren
  • - die Pinplatte (10) derart in die Komplementärplatte (20) steckbar ist, daß die Reaktionsflächen der Pinplatten (10) in die entsprechenden Kavitäten (21) der Komplementärplatte (20) eintauchen
• b2) zur Anlagerung des Antigens oder Antikörpers die Pro­ benlösungen und/oder Kontrollösungen in die entsprech­ enden Kavitäten (21) der Komplementärplatte (20) ein­ gibt und die Pinplatte (10) auf die Komplementärplatte (20) für einen definierten Zeitraum steckt, wobei sich die jeweiligen Reaktionsflächen mit den entsprechenden Lösungen benetzen.

2. Enzymimmunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

• c2) man zur Abwaschung der Reste der auf den Reagenzflä­ chen anhaftenden Proben- und Kontrollösungen die Pin­ platte (10) in eine Waschlösung eintaucht und hierin bewegt.

3. Enzymimmunoassay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

• e2) man zur Abwaschung der Reste der auf den Reagenzflä­ chen anhaftenden Enzym-Antikörper- oder Enzym-Antigen­ Lösung die Pinplatte (10) in eine Waschlösung ein­ taucht und hierin bewegt.

4. Enzymimmunoassay-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,

• f2) wobei man zur Messung der Enzymaktivität des zuvor fixierten Enzym-Antigens- oder Enzym-Antikörpers die einzelnen Reaktionsflächen mit einer Substratlösung versieht und die sich hierbei einstellende Verfärbung bei den einzelnen Substratlösungen fotometrisch in einer mit einem Flachboden versehenen Mikrotestplatte auswertet, dadurch gekennzeichnet, daß man
• f3) die Substratlösung in die einzelnen Kavitäten (21) einer mit einem Flachboden versehenen Komplementär­ platte (20) eingibt
• f4) die Pinplatte (10) auf die Komplementärplatte (20) für einen definierten Zeitraum steckt, wobei sich die je­ weiligen Reaktionsflächen mit den entsprechenden Sub­ stratlösungen benetzen,
• f5) die Komplementärplatte (20) mit den einzelnen verfärb­ ten Substratlösungen fotometrisch auswertet.

5. Testset für die Routinediagnostik zur Durchführung eines heterogenen Festphasen Enzymimmonoas sy-Verfahrens, enthal­ tend

• - eine Untersuchungsplatte mit rasterförmig eingeteilten Reaktionsflächen, woran der gegen das zu messende Antigen spezifische Antikörper oder das gegen den zu messenden Antikörper spezifische Antigen gebunden ist
• - eine Antigen oder Antikörper enthaltene Kontrollösung, dadurch gekennzeichnet, daß
• - die Oberfläche von Pins (11) einer Pinplatte (10) die Reaktionsflächen der Untersuchungsplatte bilden
• - das Testset weiterhin mindestens eine mit der Pinplatte (10) zusammenpassende Mikrotestplatte (Komplementärplat­ te) (20) aufweist, wobei man zumindest eine Komplemen­ tärplatte zur Aufnahme des in unterschiedlichen Konzen­ trationen enthaltenen Antigens oder Antikörpers der ein­ zelnen Proben- und Kontrollösungen vorsieht, wobei
• - die Pins (11) der Pinplatte (10) hinsichtlich des ra­ sterförmigen Aufbaus mit den Kavitäten (21) der Komple­ mentärplatte (20) korrespondieren
• - die Pinplatte (10) derart in die Mikrotestplatte (20) steckbar ist, daß die Reaktionsflächen der Pinplatte (10) in die entsprechenden Kavitäten (21) der Komplemen­ tärplatte (20) eintauchen.

6. Testset nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß aufgrund von geometrischen und einander entsprechenden Formgebungen der Ecken (14-17) der Pinplatte (10) in bezug auf die Ecken der Mikrotestplatte (24-27) beide Platten (10 und 20) in unverwechselbarer Stellung ineinan­ der steckbar sind.

7. Testset nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Pinplatte (10) modular aus einzeln entnehmbaren Strei­ fen zu 8 Pins aufgebaut ist.