DE4101841C2

DE4101841C2 - Verwendung von Sabal-Extrakten zum Behandeln von Mammakarzinomen

Info

Publication number: DE4101841C2
Application number: DE19914101841
Authority: DE
Inventors: Hans-Udo Prof Dr Schweikert; Eva Dr Dueker
Original assignee: Schaper und Bruemmer GmbH and Co KG
Current assignee: Schaper und Bruemmer GmbH and Co KG
Priority date: 1991-01-23
Filing date: 1991-01-23
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2011-01-24
Also published as: DE4101841A1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Sabal-Extrakten zum Behandeln von Mammakarzinomen, insbesondere zum Behandeln von Östrogen-abhängigen Mammakarzinomen.

Östrogene werden in den weiblichen Keimdrüsen und ferner auch in extragonadalen, d. h. peripheren Geweben gebildet, wobei die periphere Östrogenbildung bei Frauen nach der Menopause die einzige Östrogenquelle darstellt. Beim Mann werden ebenfalls Östrogene gebildet; dies geschieht unter physiologischen Bedingungen nahezu ausschließlich in peripheren Geweben. Beispielsweise konnte nachgewiesen werden, daß Östrogene im Fettgewebe, in quergestreifter Muskulatur, der Leber, den Haarfollikeln und in Hautfibroblasten gebildet werden. Östrogen bildung konnte aber auch bei der Pathogenese von Mammakarzinomen an zahlreichen Proben nachgewiesen werden.

Die Aromatisierung der Vorstufen Testosteron und Androstendion bildet den letzten Schritt im Biosyntheseweg der Östrogene. Der Begriff "Aromatase" bezeichnet ein Enzymsystem, das die Um wandlung (Aromatisierung) von Testosteron und Androstendion zu den Östrogenen Östradiol bzw. Östron bewirkt. Eine selektive Hemmung der Aromatase stört somit nicht die Bildung anderer wichtiger Sexualsteroide.

Hemmstoffe der Aromatase ermöglichen daher eine selektive Senkung der Östrogenproduktion und sind von besonderem klinischen Interesse für Prophylaxe und Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere von östrogenabhängigen Mammakarzinomen.

Synthetische steroidale und nicht-steroidale Aromatasehemmer sind bereits im Stand der Technik bekannt. Beispiele für entsprechende Substanzen sind in der DE-OS 37 20 234 und der dort zitierten Literatur (vgl. insbesondere Seite 5, Zeilen 6 bis 10) sowie in der EP-A-0 334 425 beschrieben. Nachteilig an diesen Substanzen sind deren Nebenwirkungen, die weitgehend auf sexual-spezifischen metabolischen oder auch hypophysen-hemmenden Wirkungen beruhen.

Erfindungsgemäß konnte erstmals gezeigt werden, daß ein reiner Pflanzenextrakt, nämlich ein Extrakt aus den Früchten der afrikanischen Zwergpalme Sabal serulatum (synonym Serenoa repens) stark hemmende Wirkung auf die Aromatase ausübt.

Die Herstellung alkoholischer, hydroalkoholischer und öliger Extrakte aus Sabalfrüchten und deren Verwendung zur Behandlung der Prostatahyperplasie ist seit langem bekannt.

Die Aromatase hemmende Wirkung von Sabal-Extrakten war jedoch bislang unbekannt.

Erfindungsgemäß hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß nach bekannten Verfahren hergestellte Sabal-Extrakte eine im Vergleich mit bekannten Hemmstoffen wie Testolacton deutliche Hemmaktivität aufweisen (vgl. Beispiel 4).

Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Extrakte kann nach bekannten Verfahren mit polaren (hydrophilen), wie bei spielsweise alkoholischen, apolaren (lipophilen) oder wenig polaren. Lösungsmitteln sowie mit Mischungen derselben oder mit überkritischen Gasen erfolgen.

Als alkoholische Extraktionsmittel können ein- oder mehrwertige Alkohole und deren Isomere, beispielsweise Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol oder Polyglykole eingesetzt werden.

Als apolare Extraktionsmittel kommen beispielsweise Pentan, Hexan, Heptan, Petrolether oder Ligroin sowie Gemische derselben und Halogenkohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Dichlormethan, Chloroform, Perchlorethylen und Fluor-Chlor-Kohlenwasserstoffe in Betracht.

Als wenig polare organische Lösungsmittel können aliphatische Ketone, wie beispielsweise Aceton, aliphatische Ether, wie beispielsweise Diethylether und aliphatische Ester, wie bei spielsweise Ethylacetat oder Mischungen derselben eingesetzt werden.

Die Extrakte werden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gewonnen, indem die Pflanzenteile vorzugsweise in zerkleinertem Zustand mit den jeweiligen Lösungsmitteln mazeriert oder perkoliert, die Extrakte gegebenenfalls aufkonzentriert, gereinigt und, falls gewünscht, getrocknet, beispielsweise gefriergetrocknet werden. Vorzugsweise werden die zerkleinerten Pflanzenteile bei 15 bis 25°C, insbesondere bei etwa 20°C und Normaldruck mazeriert.

Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens werden die zer kleinerten Früchte mit 60%-igem Ethanol extrahiert (vgl. Beispiel 1) und der Extrakt nach Filtrieren entweder als solcher oder nach Einengen gegebenenfalls bis zur Trockne für die pharmazeutische Verwendung formuliert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Extraktion mit 96%-igem Ethanol, wobei entweder der Gesamtextrakt nach Verdünnen oder Einengen verwendet werden kann, oder aber die polare und die unpolare Phase beispielsweise durch Destillation oder durch einfaches Stehenlassen voneinander getrennt werden können. Erfindungsgemäß hat sich gezeigt, daß in einem solchen Falle beide Phasen das aktive Wirkprinzip enthalten (vgl. Beispiel 2 in Verbindung mit Beispiel 5).

Gemäß einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein öliger Extrakt verwendet, welcher durch die Behandlung der zerkleinerten Früchte nach dem Verfahren der EP-A- 0 250 953 mit CO₂ bei hyperkritischen Bedingungen gewonnen wurde (vgl. Beispiel 3). Die Offenbarung der EP-A-0 250 953 ist erfin dungsgemäß ausdrücklich miteinbezogen.

In diesem Verfahren wird die Extraktion bei Temperaturen im Bereich von 30 bis 50°C und Drücken von 100 bis 300 bar und die Evaporation bei Temperaturen von 20 bis 30°C und Drücken von 50 bis 70 bar durchgeführt. Das Verfahren ist u. a. deswegen besonders vorteilhaft, weil das Extraktionsprodukt ohne weitere Aufreinigung pharmazeutisch angewendet werden kann. Nach diesem Verfahren hergestellte Extrakte bestehen, bezogen auf den Trockenstoffgehalt, zum überwiegenden Anteil (etwa 80 bis 95%) aus Fettsäuren und zu einem geringen Anteil (0,1 bis 0,4%) aus Fettalkoholen. Der Gesamtgehalt an Phytosteroiden beträgt etwa 0,1 bis 0,5%, bezogen auf das Gesamtprodukt (vgl. Beispiel 3). Die zuvor genannten Werte können selbstverständlich von Auf bereitung zu Aufbereitung variieren, insbesondere aufgrund der Schwankungung bezüglich der Inhaltsstoffe in den Ausgangs früchten.

Eine entsprechende Zusammensetzung des Extrakts wird erhalten, wenn man die Mazeration bzw. Perkolation mit lipophilen (apola ren) Lösungsmitteln, wie beispielsweise Hexan, Heptan oder Ligroin durchführt. Mit zunehmender Polarität des Extrations mittels ändert sich zwar die quantitative Zusammensetzung des Extrakts in dem Sinne, daß größere Mengen gesättigter Fettsäuren mit niedrigerer C-Zahl zu Ungunsten von ungesättigten Fettsäuren bzw. von Fettsäuren mit hoher C-Zahl erscheinen, die qualitative Zusammensetzung des Extrakts ändert sich dadurch jedoch nicht (vgl. Beispiele 1 und 3). Ferner werden bei Einsatz von alkohol haltigen Extraktionsmitteln Fettsäuren zumindest teilweise zu Estern umgesetzt.

Überraschenderweise hat es sich jedoch erfindungsgemäß gezeigt, daß das die Aromatase hemmende Wirkprinzip unabhängig von der polaren oder apolaren Natur der eingesetzten Lösungsmittel in dem Extrakt vorhanden ist (vgl. Beispiele 4 und 5) und daß selbst bei Auftrennung des Gesamtextraktes, wie er mit 96%-igem Ethanol gewonnen wird, in dessen lipophile und lipophobe Phase, beide Phasen die erfindungsgemäße Wirksamkeit aufweisen.

Für die erfindungsgemäße Verwendung können die Extrakte per se oder nach Einengen gegebenenfalls bis zur Trockne in den jeweils gewünschten Konzentrationen für die pharmazeutische Anwendung formuliert werden.

Vorzugsweise werden sie zusammen mit Trägerstoffen wie beispiels weise Calciumcarbonat und Lactose als Tabletten oder Kapseln oder mit beispielsweise Olivenöl oder anderen pflanzlichen Ölen als Weichgelatinekapseln oder auch in Mischungen aus beispielsweise Wasser/Ethanol mit Polyethylenglykol oder Propylenglykol als Säfte formuliert. Ferner können die Extrakte in an sich bekannten Trägersystemen für die transdermale Applikation eingesetzt werden.

Die Präparate sind zur Behandlung von Mammakarzinomen, ins besondere von Östrogen-abhängigen Mammakarzinomen geeignet.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von Sabal-Extrakt durch Extraktion mit 60%-igem Ethanol Präparat A

50 kg Sabal serulatae fruct. conc. wurden zerkleinert und die Droge nachfolgend in einem 400 l-Extrakteur dreimal durch 4- tägige Mazeration mit jeweils 300 l 60%-igem Ethanol extrahiert.

Die Extrakte der einzelnen Stufen wurden vereinigt und mit Ethanol bzw. entkeimtem Wasser auf ein Volumen von 1000 l und eine Konzentration von 60% Ethanol eingestellt.

Der so gewonnene Extrakt wurde abschließend klar filtriert und als Präparat A bezeichnet.

Es handelte sich um eine hellbraune, klare Flüssigkeit mit den nachfolgend angegebenen Eigenschaften:

1. Trockenstoffgehalt (bestimmt an 5 g über 2 Stunden bei 105°C)
0,6% (m/m)
pH-Wert	5,7
Relative Dichte (bei 20°C)	0,916

2. Quantitative Bestimmung der Fettsäureethylester

1. Die gaschromatographische Trennung der einzelnen geradkettigen Fettsäureethylester von den übrigen Bestandteilen erfolgte nach der Kapillar-GC-Methode mit Temperaturgradient bei Auswertung über internem Stan dard, die Ergebnisse der einzelnen Fettsäureethylester wurden addiert, die Fettsäuren wurden qualitativ durch Retentionszeit-Vergleich erfaßt (vgl. Tabelle I).
2. Gerät:
Kapillarsäulen-Gaschromatograph mit Flammenionisations detektor, HP 5880 A Level 4 mit Kapillar-Injektor und FID.
3. Stammlösungen:
- I. Fettsäureethylestergemisch: 10,00 ml enthalten je etwa 10 mg (exakt eingewogen) der folgenden geradkettigen Fettsäureethylester: Octansäureethylester (C₇H₁₅COOC₂H₅)
  Decansäureethylester (C₉H₁₉COOC₂H₅)
  Undecansäureethylester (C₁₀H₂₁COOC₂H₅)
  Dodecansäureethylester (C₁₁H₂₃COOC₂H₅)
  Tridecansäureethylester (C₁₂H₂₅COOC₂H₅)
  Tetradecansäureethylester (C₁₃H₂₇COOC₂H₅)
  Pentadecansäureethylester (C₁₄H₂₉COOC₂H₅)
  Hexadecansäureethylester (C₁₅H₃₁COOC₂H₅)
  Heptadecansäureethylester (C₁₆H₃₃COOC₂H₅)
  Octadecansäureethylester (C₁₇H₃₅COOC₂H₅)Als Lösungsmittel wird Methyl-tert.-butylether verwendet.
- II. Interner Standard: 100 mg geradkettiger Nonan säureethylester (C₈H₁₇COOC₂H₅) in 100 ml Methyl tert.-butylether
4. Prüflösung:
9,00 ml der zu untersuchenden Lösung wurden mit 1,00 ml internem Standard (Stammlösung II) versetzt.
5. Vergleichslösung:
9,00 ml der Stammlösung I wurden mit 1,00 ml internem Standard (Stammlösung II) versetzt.
6. GC-Bedingungen:
Trennkapillare: z. B. 15 m DB-1, 0,32 mm i.D.
Ofentemperatur: 50°C bis 250°C in 20 Minuten weitere 5 Minuten bei 250°C
Ofentemperatur post value: 270°C
Ofentemperatur post time: 5 Minuten
Ofentemperatur Limit: 280°C
Injektortemperatur: 250°C
Detektortemperatur: 280°C
Trägergas Helium: Vordruck ca. 4,5 psi
Aux. Gas Helium: 20 ml/min
Split Vent: 20 ml/min
FID (syhth. Luft): ca. 300 ml/min
FID (Wasserstoff): ca. 30 ml/min
Injektorvolumina: 3 × 1 µl Prüf- und Vergleichs lösung
Attenuation: 2¹

7. Beurteilung:
Retentionszeiten: (Lösungsmittelpeak 0,97 min)

Octansäureethylester
6,3 Minuten
Nonansäureethylester (IST)	7,7 Minuten
Decansäureethylester	9,1 Minuten
Undecansäureethylester	10,4 Minuten
Dodecansäureethylester	11,6 Minuten
Tridecansäureethylester	12,8 Minuten
Tetradecansäureethylester	14,0 Minuten
Pentadecansäureethylester	15,0 Minuten
Hexadecansäureethylester	16,0 Minuten
Heptadecansäureethylester	17,0 Minuten
Octadecansäureethylester	18,0 Minuten

Außer den Peaks des Lösungsmittels und der geradzah ligen Fettsäureethylester traten die Peaks der ent sprechenden unveresterten Fettsäuren auf, die sich leicht identifizieren ließen. Weiterhin enthält Präpa rat A Substanzen wie Phytostyrole, die im Gaschromato graphen als Peaks sichtbar werden, aber eine Auswertung der Fettsäureethylester nicht stören.
Die relativen Retentionszeiten der entsprechenden Peaks aus Prüf- und Vergleichslösung dürfen nicht mehr als 1% voneinander abweichen.

8. Gehaltsbestimmung:
Der Gehalt der einzelnen Fettsäureethylester wird nach folgender Formel berechnet: G = Gehalt in mg/ml Lösung
PF_Pr = Mittlere Peakfläche des Fettsäureethyl esters in der Prüflösung
PF_St = Mittlere Peakfläche des Fettsäureethyl esters in der Vergleichslösung
PF_IST/St = Mittlere Peakfläche des Internen Stan dards in der Vergleichslösung
PF_{IST/ Pr} = Mittlere Peakfläche des Internen Stan dard in der Prüflösung
EW_St = Einwaage des Fettsäureethylester-Stan dards in der StammlösungDer Gesamtgehalt an Fettsäureethylestern in der Lösung ist gleich der Summe der einzelnen Fettsäureethylester- Gehalte.

Tabelle I

Quantitative Bestimmung der Fettsäureethylester

Präparat A

Tabelle II

Qualitativer Nachweis der gesättigten Fettsäuren

Präparat A

Beispiel 2 Herstellung von Sabal-Extrakt durch Extraktion mit 96%-igem Ethanol Präparate C und D

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß die Mazeration (Extraktion) mit 96%-igem Ethanol durchgeführt wurde, wobei 1 kg Sabalfrüchte mit insgesamt 20 l Ethanol extrahiert wurden.

Die in den einzelnen Mazerationsstufen gewonnenen Extrakte wurden ebenfalls zu einem Gesamtextrakt vereinigt und das Ethanol abdestilliert. Der erhaltene Rückstand bestand aus zwei Phasen.

Die erste Phase enthielt die unpolaren Bestandteile des Gesamt extraktes. Die Phase wurde im Verhältnis 1 : 100 mit 96%-igem Ethanol verdünnt. Die so erhaltene Lösung wurde als Präparat B bezeichnet.

Die zweite Phase enthielt die polaren Komponenten des Gesamt extraktes. Sie wurde per se als Präparat C bezeichnet.

Beispiel 3 Herstellung von Sabal-Extrakt durch Extraktion mit CO₂ unter überkritischen Bedingungen (gemäß EP-A-0 250 953) Präparat D

1,2 kg Früchte von Serenoa repens wurden nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 der EP-A-0 250 953 bei -20°C fein vermahlen und in einem kontinuierlichen Rücklaufverfahren 2 Stunden lang bei 35°C und 250 bar mit 10 Litern CO₂ extrahiert. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde das extrahierte Material 24 Stunden lang bei 2 mm/Mg und 45°C getrocknet.

Auf diese Weise wurden 0,138 kg eines klaren, gelb-orange farbenen Öls mit den nachfolgend angegebenen Eigenschaften erhalten, welches als Präparat D bezeichnet wurde.

Dichte:\|0,896
Refraktionsindex:	1,46
nicht verseifbare Anteile:	2,52%
Verseifungsindex:	230
Anteil freier Fettsäuren:	86%

Die Fettsäuren wurden wie in Beispiel 1 angegeben gaschromatogra phisch bestimmt, mit dem Unterschied, daß eine mit Carbowax 20 M beschichtete Säule aus Quarz mit einer Länge 25 m und einem Durchmesser von 0,32 mm verwendet wurde und die Injektor- und Detektortemperaturen jeweils 350°C betrugen. Als interner Standard diente Methylheptadecanoat (MED).

Die Ergebnisse der Fettsäurenanalyse sind nachfolgend in Tabelle III wiedergegeben.

Tabelle III

Quantitavier Nachweis der Fettsäuren

Präparat D

Durch analoge, gaschromatographische Analyse konnte ferner nachgewiesen werden, daß der Extrakt Phytostyrole enthielt.

Beispiel 4 Hemmwirkung von Präparat A auf Fibroblastenaromatase

Die Fibroblasten wurden aus der Vorhaut eines 6 Jahre alten Jungen nach Zirkumzision wegen Phimose gewonnen. Die Kultivierung der Fibroblasten erfolgte wie in J. Clin. Endocrinolol. Metab. 43, 758-795 und Horm. Metab. Res. 11, 635-640 angegeben.

In Voruntersuchungen wurden die Fibroblasten parallel entweder mit (1,2,6,7-³H)-Androstendion oder (1β-³H)-Androstendion als Substrat inkubiert. Mit dem erstgenannten Verfahren wurde die (³H)-Östrogenbildung gemessen (vgl. a.a.Q.), während mit dem letztgenannten Verfahren die Bildung von tritiertem Wasser bestimmt wurde. Da beide Verfahren nahezu identische Ergebnisse lieferten, wurde das Verfahren mit tritiertem Wasser zur Verwendung in den nachfolgenden Untersuchungen ausgewählt.

Die Aromatase-Aktivität wurde in Fibroblastenhomogenaten in Gegenwart oder Abwesenheit steigender Konzentrationen von Präparat A gemessen (vgl. Tabelle IV). Das Inkubationsgemisch jeder Kontrollprobe enthielt Fibroblastenhomogenat (339 µg Protein bzw. 27,5 µg DNA), (1β-³H)-Androstendion (5 × 10^-8M), NADPH (10^-3M), Progesteron (5 × 10^-6M) in einem Endvolumen von 1050 µl Krebs-Ringer-Phosphat-Puffer bei pH 7,4. Die Präparat A enthaltenden Proben wurden wie die Kontrollen zusammengestellt, sie enthielten jedoch die in Tabelle IV angegebenen steigenden Mengen des Hemmstoffes. Die Kontrollen wurden dreifach, alle anderen Bestimmungen doppelt durchgeführt. Ferner ließ man zwei Leerproben mitlaufen, welche die Inkubationsmischung jedoch Puffer anstelle von Fibroblastenhomogenat enthielten.

Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle IV wiedergegeben.

Tabelle IV

Die Ergebnisse zeigen, daß Präparat A die Aromatase-Aktivität bei einer Konzentration von etwa 500 µg je Probe um etwa 50% hemmt. Dies ist um so bemerkenswerter, als in Vergleichsversuchen mit Testolacton (15α-Qxa-D-homo-1,4-androstadien-3,17-dion), dem derzeit einzigen klinisch zugelassenen steroidalen Aromatasehem mer, eine 50%-ige Hemmung in diesem Testsystem bei einer Konzentration von etwa 5 × 10^-6M erhalten wurde.

Beispiel 5 Hemmwirkung von Präparaten B, C und D auf Fibroblasten-Aromatase

Die Untersuchungen gemäß Beispiel 4 wurden wiederholt, mit dem Unterschied, daß anstelle des Präparats A die Präparate B, C und D in steigenden Verdünnungen eingesetzt wurden.

Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle V wiedergegeben.

Sie zeigen, daß die eingesetzten Präparate ebenfalls über ausgeprägte Hemmwirkung gegenüber Fibroblasten-Aromatase verfügen.

Tabelle V

Claims

1. Verwendung von Sabal-Extrakten zum Behandeln von Mammakar zinomen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sabal-Extrakte zusammen mit Trägerstoffen als Tabletten oder Kapseln formuliert sind.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sabal-Extrakte als Säfte formuliert sind.

4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sabal-Extrakte für die transdermale Applikation formuliert sind.