Patentansprüche:
1. Hin D .'!A-F ragment, umfassend eins .'!uklsot i dsequenz wie
in Fig. 10 Cg)-Cj) gezeigt, die ain Pasteurella "uitociaa
Toxin codiert,, oder eine Teilsequenz oder ein Analcgon
ciavon, die eine inmunocene Tei Lsequenz oder ein Analogen
des Toxins codieren.
2. Ein DNA-Fragment nach Anspruch 1, worin die
i'.'uk L eot idsequenz von einen Paste ure I la rau I tee i da Ge &eegr; on
abs t atnmt.
3. Ein Df!A-Fragment nach Anspruch 1, worin die
iJukleotidsecuenz von einem für P~steurella nultociciä
infektiöser: 'akterioohagen oder von oinem PLasrnia
abstammt.
4. Ein DMA-Fragment nach Anspruch 1, worin die
r.'uk L ecu idsequenz eine synthetiscne Sequenz ist.
5. Ein 0.'!A-F ragment nach Anspruch 1, worin die
""jL k L sot idsscuenz eine gemiscnte genomische und
synthetische Sequenz ist.
6. Ein OMA-F ragment nacn Anspruch 1 .. das durch
Substitution,- Addition, Insertion oder DeLetiün von. einen
oder mehreren f'uk I eot iden in der Sequenz modifiziert
werden ist.
7. Ein DHA-F ragment risen Anspruch 6. das eine OMA-Teilsequenz ist.» aus ge wühlt aus den codierenden
Regionen A-R., wie in Seispiel 9 beschrieben und in Fig.
gezeigt.
S. Ein DNA-Fragment nach einem cc-r Ansprüche 1^-6 oder 7,
das '.; eitern in umfaßt eine r.'u I k leot i dsecusnz / cie sin
anderes Polypeptid ccciert, das an eis "u!<
L eot i ^sequenz, :Jie das Toxin oder Toxin-Analog on codiert., fusioniert
ist.
v. ein Expressionsvektor, der in einen
'Jirtsnikroorgsnisraus replizieren kann unc oer ein
inseriertes &iacgr;&Ggr;&Aacgr;-Frsgnent nach einem der Ansprüche 1 bis
träct.
10. Ein Exoressionsvektor nach Anspruch 9, in dem das
inserierte DuA-F ragr.?nt eine der codierenden Regionen &Lgr;-R, wie in Eeispiel ? beschrieben und in Fig. 13 rezeigt,
ist.
11. Ein >' i k roorgani srr.us, der ein D'!A-F ragneot nach einem
der Ansprüche 1 bis G expr i ir. ie ren kann und einen Vektor
nach Anspruch 9 oder 11 enthält.
12. Ein ;". i k roornani S.T1US nach Anspruch 11, r-sr pin
L-akteriuti ist.
13. Ein ;:ik reorganise; us nach Anspruc.i 12, der ein
Gran-negatives Sakteriun, insbesondere E. coli, ist.
14. Ein Verfahren zum Herstellen eines Fasteure L la
;i u I &tgr; &ogr; c i d a Toxins oder einer iamunogenen Teilsequenz oder
iines Analcgons davon, wobei die Methode umfaßt:
Kultivieren eines Mikroorganismus, enthaltend einen
Expressionsvektor nach Anspruch 9 oder 10, unter
geeigneten cedingungen zum Exprirr.ieren des Toxins oder
der irnmunogenen Teilsequenz oder des Analcgons davon,
Ernten des Toxins oder der Tox i n-Te i I sequa nz oder riss
Ar. a L eg ons von cer .Ku L tu r und
ggf. Aussetzen dc-s Toxins einer posttranslatinnaLen
,■" od ifik ation, um das "rntgiftete Toxin oder Toxinanalc.-cn
zu erzeugen.
15. Ein Verfahren nach Anspruch 14, umfassend die Anfc.ncsschritte des
a) IsoLierens sines DfJ &Lgr;-Fragments, umfassend eine
!■'ukLecricsequenz wie in Fig. 10 (a) -. Cj) gezeigt,
cas ein Toxin codiert, cder einer Teilsequenz caer
eines &Lgr; r, a L c r. &ogr; &pgr; s des ^:! A-Fragment:, die die irnuncgene
Tc &khgr; i n-Te i L sequenz oder das An a Logon codieren,·
b) Inseriorens ces DiJA-Fragments, ggf. in geeigneter
modifizierter Form, die zu der Expression des
entgifteten Toxins oder Tcx i &eegr;-Ana L ogons führt., oder
einer TeiLsequenz oder eines AnaLogons davon, die
fC·r eine immunooene Teilsecuenz des Toxins cder ein
Tcxi&eegr;-Ana Lcgon codieren, in einen &Xgr;&khgr;&rgr;ressionsvektor,
c ) Trsnsfcrnicrens s i &eegr; c- s gseignetc-n W i r t s ~ i k r &ogr; &ogr; r c ~ &pgr; i s m u s
rr.iz dem in Schritt &ogr;) erzeugten Vektor.
16. Ein Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin die für
das Tcxin oder Toxi&eegr;-Ana Logon codierence Sequenz
modifiziert ist durcn Substitution.· Addition.. Insertion
oder Deletion einer oder mehrerer üuklectice in der Sequenz.
17. Ein Verfahren nach Anspruch 14 cder 15, worin die ggf.
posttranslationalen Modifikationen ausgewählt werden aus
'•ä rrr.eoe hand I ung, Behandlung mit iiner Chemikalie und
Substitution.. Addition, Insertion oder Deletion einer cder
mehrerer Aminosäuren in dem Toxin oder Toxin-Analoqcn.
13. Ein Verfahren nach Anspruch 17, '.,or in die Chemikalie
ausgewählt wird aus Formaldehyd,. Gtutcraldehyd und einem
geeigneren protoolytischen Enzym.
19. Ein Verfahren nacr, Anspruch 14,. worin der
Expres&zgr;ionsvektor eine der codierenden Regionen A-R. wie
in Eeispiel 9 beschrieben und in Fig. 13 gezeigt, trägt.
20. Ein Verfahren nach Anspruch 14, worin cer
&Xgr;&khgr;&rgr; r es s i cnsvektcr die codierende Region G, :■: i e in Beispiel
? gez?iot und in Fig. 13 beschrieben, zräcjt.
21. &Xgr; i &eegr; '"'erfahren nach Anspruch 14, worin ce r
Expressionsvektcr die codierende Region L , ^; ie in Beispiel
9 beschrieben und in Fig. 13 gezeigt., trägt.
22. &Xgr;&idiagr;&eegr; Verfahren nacn Anspruch 14, worin der
Expressionsvektor die codierende Region 0, wie in Eeispiel
9 beschrieben und in Fig. 13 gezeigt, trägt.
23. Ein '/erfahren nach Anspruch 14, worin &uacgr;&bgr; r
Expres sionsvekior die codierende Region £.. wie in Beispiel
9 beschrieben und in Fig. 13 gezeigt, tragt.
24. Ein nicht-pathogener Mikroorganismus, der ein
inseriertes DiIA-F ragment nach Anspruch 1, das für ein immuncgenes entgiftetes Pasteurella r-.ulticoda Tcxin oder
ein Toxin-AnaLogon codiert, trägt und exprimieren kann,
zum Veruenaen als Lebendimpfst off zur Immunisierung eines
Tiers regen Krankheiten, cie von i'ikrocrgsnismen
verursacht werden, die ein osteolytisches Toxin erzeugen.
25. Sin Mikroorganismus nach Anspruch 24, worin ei ie
!"uk I eot icsequenz , die für das Toxin coer Tex i &eegr;-Ana L ogon
codiert, rr.cdifiziert ist durch Subs t i t ut i on,- Addition,
Insertion oder Deletion eines oder /.ie &eegr; re re r '"ukLeotioe
in ce r Sequenz.
26. Ein Mikroorganismus nach Anspruch 24, worin die
:!uk Lee t id secuenz, die für das Toxin oder Toxin-Anaioqon
codiert, auf aer äußeren Oberflüche cer Hirtsze I Le
■?xp r i &zgr; i e rt v: i rcl.
27. Ein ?·" i k rocrg an i smus nach Anspruch 26, wer in die
:uk I eotidsequenz, die für das Toxin saer Toxin-;naLcgcn
cociert, an eine andere 'luk Leot i csecuenz fusioniert ist,
uie ein Obe rf L ä c henp rote i &eegr; oder eine Te i L secuer.z davor,
codiert, ei i e verursacht, daß das Toxin oder Tox i &eegr;-Ana L ogon
auf cer -:iui5eren Oberfläche der '.'. i r t s ze I Ie e.x pri &pgr; i e rt v.irc,
ggf. als Fusionspclypeptid.
22. Ein ."ikrcorcanisnus nach Anspruch 27, worin das
CberflächenDrotein ausgewählt '.-.'ird aus Firr.brienproteinen
oder "·. dhäsinen ccer dem LamS-Protein &ngr; cn &Xgr; . c &ogr; I i .
29. Ein Diacnoser;ittel für den NacnweiE von Pasteurei-La
nuLtocida Tox i n-e rzeugenden iii k roorran i seien oder
Bakteriophagen, die ein &ogr; nt -Gen enthalten, ei a s c- i &eegr;
DiIA-F ragment wie in Anspruch 1 definiert, an das sine
Markierungssubstanz gebunden worden ist, enthält.
30. Ein Diagnosemittel nach Ansprucr, 29, worin die
Markierung ausgewählt wird aus r~dioaktiven Isotopen,
Enzymen und Kor; &rgr; I ex i e rmi 11 &egr; I &eegr;, wie Biotin.
31. Ein Verfahren zur; M ach weis der Anwesenheit eines
Pasteurella rultccida Toxin erzeugenden ":i k rocrg ani smus in
einer Probe, wobei das Verfahren umfaßt Amp Iifi&zgr;ieren
einer D &Ggr;.'A-Sequenz,, die für Paste urel la nultocida To:: in
OGer Toxin-Analogon, die in den Mikroorganismus enthalten
sind, cociert, durch Verwenden von Ol i gonuk leot i dsequenzc*r, die beträchtlich komplementär zu
rnincestens einem Teil eines DMA-Fragmsnts , wie in "einem
der Ansprüche 1 bis 3 definiert, sind, in der
Po Iymerase-Kettenreaktion (PCR) gefolgt vom Nachweis unter
Verwendung eines DMAFragments nach Anspruch 1.
32. Ein Verfahren nach Anspruch 31, i;orin das nachweisende
DNA-Fragment r.it einer Markierung ausgestattet ist.
33. Ein Verfahren nach Anspruch 32, worin &agr; ie "ark is rung
ausgewählt ist aus radioaktiven Isotopen, Enzymen und ''.ompiexierr.itteln, wie Biotin.
34. Ein Impfstoff, enthaltend ein Pasteur el la nultocida
Toxin-Deri vat, ausgewählt aus den Derivaten, die durch
eine der codierenden Sequenzen A-R, wie in Beispiel 9 beschrieben und in Fig. 13 gezeigt, codiert werden
kennen.
35. "in Impfstoff nach Anspruch 34, bei dem das
Toxin-Derivat ein Derivat von ungefähr 135 kD ist, das
durch das Plasmid oSPE S, wie in Beispiel 9 beschrieben
und in Fig. 13 gezeigt, codiert werden kann.
36. Sin Impfstoff nach Anspruch 34, bei dem das Toxin-Derivat ein Derivat von ungefähr 124 kD ist, das
durch das Plasmid pSPE L, wie in Beispiel 9 beschrieben
und in Fig. 13 gezeigt, codiert werden kann.
37. Ein Impfstoff nach Anspruch 34, bei dem das
Toxin-Derivat ein Derivat von ungefähr 133 kD ist, das
durch das Plasmid pSPE 0, wie in Beispiel 9 beschrieben
0409885
und in Fig. 13 gezeigt, codiert were an kann'.
38. Ein Impfstoff nach Anspruch 34, bei dsm das Toxin-Deri
&ngr; at ein derivat von ungefähr 127 !;D ist, das durch
ca 3 Plasmid pSPE Q, wie in Beispiel ? beschrieben 'und
in Fig. 13 gezeigt, codiert werden kann.
39. .= in Impfstcff nach einem der Ansprüche 34 bis 3S,
worin das Derivat an ein anderes Pol/peptid fusionierist.
40. &Xgr;&idiagr;&eegr; Impfstoff nach Ansoruch 39, worin das Pclypeptid,
3 &eegr; das aas Dsrivat fusioniert ist,, a u s &zgr; e '.-.· &zgr; r. L t i 31 3 u s
&Ggr;; i nde rs 3 rurna I bum in .. "'valbumin, !CLH und Lysozym.
41. Verwendung einer immuncgenen Tsi Lsequer\z euer ^ i &eegr; e s
AnaLogons des 12S5 Aminosäuren Pasteurel La nultocida
Toxins,, w i e durch die i &eegr; F i g . 10 C« ) - (j ) g e &zgr; &ogr; i g t e
DMA-Sequenz codiert, '.vobei die Teilsequenz oder das
Analogon selche sind, die codiert wercen kennen euren
ein Deri &ngr; at de r in Fig. 10 Ca) - (j) gezeigten
d'.l A-Secuen:, das eurer, Substitution,- Addition, Insertion
oder De L et i on "ei nes oder mehrerer -'!ukleo-ide in der
Se q u 3PZ he rc,:· stellt wurae, zum Herstellen eines Impfstoffs
für die Immunisierung eines Tieres gegen atrophische
Rhinitis.
42. Ein rnonoklonaler Antikörper... der mit dem
Pasteurella nultoci da Toxin reaktionsfähig ist, ,7! it dem
ein Antikörper, hergestellt durch die Kybridom-Zellinie
P3F37, ECACC C712C301 oder P3F51, ECACC "71203C2
reaktionsfähigist.
43. Ein monoklonaler Antikörper nach Anspruch 42,
jer ein Antikörper, hergestellt durch die Hybridom-
Zellinie P3F37, ECACC 37120301 ccer ?3F51, ECACC C7120302,
ist.