DE4040364C1

DE4040364C1 - Determn. of glucose, fructose and sorbitol - by use of a NADP coenzyme in an adenine-di:nucleotide dependent enzyme reaction

Info

Publication number: DE4040364C1
Application number: DE19904040364
Authority: DE
Inventors: Oliver Thordsen; Thomas Dr. 3000 Hannover De Scheper; Bert Dr. 6233 Kelkheim De Rehr; Hermann Prof. 5170 Juelich De Sahm
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1990-12-17
Filing date: 1990-12-17
Publication date: 1992-09-10
Anticipated expiration: 2010-12-18

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glucose oder Fructose oder Sorbit durch adenin-dinukleotid-abhängig enzymatische Umsetzung in einem Durchflußreaktor, in dem in der Reaktionsflüssigkeit enthaltenes Enzym und Coenzym durch eine Filtrationsmembran zurückgehalten werden und Messung der Fluoreszenzänderung aufgrund der die Umsetzung begleitenden Umwandlung des Coenzyms in die reduzierte bzw. oxidierte Form.

Glucose, Fructose und Sorbit werden üblicherweise entweder durch HPLC-Technik (Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie) oder enzymatisch bestimmt. In der HPLC-Analytik werden die Zucker bzw. Sorbit lediglich anhand der Elutionszeiten (Zeit, nach welcher das Signal detektiert wird) identifiziert. Diese Analytik ist somit nicht hochspezifisch. Zucker, Zuckeralkohole oder auch andere Verbindungen mit ähnlichem Elutions-Verhalten können die Analytik stören bzw. unmöglich machen. Die Verwendung von Enzymen ermöglicht hingegen eine hochspezifische Bestimmung von Glucose, Fructose und Sorbit, und zwar wird Glucose nach Umsetzung mit Glucokinase mittels Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD⁺ bestimmt, dessen entsprechende Umsetzung zum NADH fluorimetrisch oder photometrisch gemessen werden kann.

Analog ist auch Fructose bestimmbar, jedoch in dem vorab eine Umsetzung mit Fructokinase und Isomerase vorgenommen wird. Die Bestimmung von Sorbit erfolgt mit Sorbit-Dehydrogenase.

Die vorgenannten enzymatischen Analysen sind Einzelbestimmungen, die mit Endpunktsermittlung durchgeführt werden und mit jeweiligem Verlust des zugesetzten Coenzyms ablaufen.

Um den Coenzymverbrauch bei solchen enzymati schen Bestimmungen über die Fluoreszenz des re duzierten Adenin-dinukleotid-Coenzyms zu vermin dern und die Bestimmung zu optimieren, wurde be reits in der PCT-Anmeldung WO 90/03 425 ein quan titatives Bestimmungsverfahren für Verbindungen, deren Konzentration durch adenin-dinukleotid-ab hängige enzymatische Reaktion bestimmbar sind, vorgeschlagen, das nach dem Flow-Injektion-Prin zip funktioniert und bei dem das jeweilige Enzym und molekulargewichts-vergrößertes Coenzym im Nachweisraum durch eine Ultrafiltrationsmembran zurückgehalten werden. Unmittelbar an den Nach weisraum angeschlossen ist ein Fluoreszenzdetek tor mit Glasfaseroptik, mit dem reduzierte Ade nin-dinukleotide (NADH, NADPH) bei einem Anre gungslicht der Wellenlänge 360 nm über das Fluoreszenzmaximum bei 450 nm ermittelt werden können.

Dieses Verfahren, das auch für die Bestimmung von Glucose, Fructose und Sorbit anwendbar ist, hat allerdings den gewissen Nachteil, daß Enzyme im allgemeinen zu molekulargewichts-vergrößertem NAD-bzw. NADP-Coenzym niedridere Affinitäten haben können. Ferner muß im System ein zusätzliches Enzym für die Coenzym-Regenerierung vorhanden sein.

Ziel der Erfindung ist daher eine diesbezüglich optimierte Verfahrensweise.

Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art ist dadurch gekennzeichnet, daß für die Umsetzung Glucose- Fructose-Oxidoreduktase (GFOR) mit fest daran gebundenem NADP-Coenzym verwendet wird.

Bei der Bestimmung von Glucose, Fructose oder Sorbit wechselt das an die GFOR gebundene Coenzym NADP Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat je nach gewünschter Umsetzung, in bekannter Weise, von einem seiner beiden Redoxzustände (NADP⁺/NADPH) in den anderen.

Bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren wird lediglich für Glucose, Fructose und Sorbit substratspezifische Glucose-Fructose-Oxidoreduktase mit fest gebundenem Coenzym (NADP) aus Zymomonas mobilis verwendet. Isolierung und Eigenschaften des (GFOR)-NADP-Coenzym Komplexes werden u. a. von M. Zachariou u. a. im J. Bacteriol. 167 (1986) 863-869 beschrieben.

Alternativ können permeabilisierte Zellen von Zymomonas mobilis verwendet werden. Durch die Permeabilisierung wird die Zellmembran der ansonsten morphologisch intakten Zellen für niedermolekulare Verbindungen (bis ca. 1000 Dalton) durchlässig. Die das erfindungsgemäße Verfahren störenden isolierten ("freien") Coenzyme NAD und NADP werden aus der Zelle gewaschen bzw. entfernt. Die Glucose-Fructose-Oxidoreduktase mit daran fixiertem NADP-Coenzym bleibt intakt und für die fluorimetrischen Messungen zugänglich. Die Permeabilisierung erfolgt z. B., wie in Patentanmeldung P 39 36 757.6 beschrieben, durch Behandlung mit kationischen Tensiden.

Im einzelnen laufen bei der Bestimmung mittels (GFOR)-NADP-Coenzym folgende Reaktionen ab:

1) Glucose wird zu Gluconolacton oxidiert, und die abgegebenen Elektronen werden auf das NADP⁺übertragen unter Bildung von NADPH. Die zu ermittelnde Glucose-Menge kann über die auf das NADPH zurückgehende Zunahme der Fluo reszenz quantifiziert werden.
2) Fructose wird zu Sorbit reduziert; die Elek tronen werden von (zuvor reduziertem) enzymge bundenem NADPH (Reduktion z. B. durch Glucose) auf die Fructose übertragen; die eingesetzte Menge Fructose kann durch die Abnahme der Fluoreszenz quantifiziert werden.
3) Sorbit wird enzymatisch zu Fructose oxidiert; das enzymgebundene NADP⁺ wird hierbei wiede rum reduziert und die Fluoreszenz des gebil deten NADPH gemessen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand prakti scher Beispiele unter Bezugnahme auf die ange fügten Zeichnungen näher erläutert;

Es zeigen

Fig. 1 und 2 schematische Skizzen für den Meß aufbau und die Meßzelle für den erfindungsgemäßen fluorimetri schen Nachweis;

Fig. 3 bis 5 Eichkurven für den Nachweis von Glucose, Fructose, Sorbit mit permeabilisierten Zellen von Zy momonas mobilis und

Fig. 6 eine Eichkurve für den Nachweis von Glucose mit gereinigter (GFOR)-NADP-Coenzym.

Für die Messungen wurde ein Meßaufbau verwendet, wie er in Fig. 1 skizziert ist: In eine als En zymmembranreaktor ausgebildete Meßzelle 1 ragt als Sensor eine kommerziell erhältliche Fluores zenzsonde (Ingold-Fluorosensor) als Detektor. Durch die Meßzelle wird in kontinuierlichem Strom Pufferlösung mittels einer Peristaltikpumpe 2 geschickt, in den zu Beginn jeder Meßreihe das Enzym mit fest gebundenem NADP-Coenzym oder permeabili sierte Zellen von Zymomonas mobilis, die (GFOR)- NADP-Coenzym enthalten, über die Enzyminjektion 3 gege ben wurden, um so die Meßzelle zu beladen. Die Untersuchungsproben wurden über die Probeninjek tion 4 in den Trägerstrom injiziert. Das resul tierende Fluoreszenzsignal wurde vom Sensor em pfangen und durch die Elektronikeinheit verar beitet und auf einen Schreiber gegeben.

A) Nachweis von Glucose, Fructose und Sorbit mit permeabilisierten Zellen von Zymomonas mobilis

Die Zellen wurden, wie in der DE-Patentanmeldung P 39 36 757.6 beschrieben, mit 0,1% CTAB (Cetyl trimethylammoniumbromid) permeabilisiert. Die permeabilisierten Zellen wurden in den Träger strom bei 3 injiziert und in die Meßzelle gela den. Die Biotrockenmasse-Konzentration in der Messzelle betrug 20 g/l. Für die Messungen wur den Mikrofiltermembranen mit einem Porendurch messer von 0,3 µm (Filtron Typ Omega) verwendet. In den Trägerstrom wurden Substratpulse (Glucose, Fructose oder Sorbit) von 25 µl injiziert.

Die beigefügte Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Glucosekonzentration (Probenkonzentration).

Fig. 4 zeigt die Abnahme der relativen Fluores zenz in Abhängigkeit von der Fructosekonzentra tion (Probenkonzentration). Der (GFOR)-NADP-Coenzym Kom plex in den permeabilisierten Zellen wurde vor jedem Fructosepuls durch einen Glucosepuls (25 µl einer Glucoselösung mit 100 g/l) in den redu zierten Zustand versetzt.

Fig. 5 zeigt die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Sorbitkonzentration (Probenkonzentra tion).

Wie man sieht, ist die relative Fluoreszenzin tensität proportional zu den injizierten Sub stratkonzentrationen.

B) Nachweis von Glucose mit gereinigter Glucose- Fructose-Oxidoreduktase mit gebundenem NADP-Coenzym

Das Enzym wurde, wie oben angegeben, aus Zymomo nas mobilis mittels proteinchemischer bzw. chro matographischer Methoden isoliert. Bei einem En zymgehalt in der Meßzelle entsprechend 40 U wur den in den Trägerstrom bei 4 Glucosepulse von je 25 µl mit steigender Konzentration (0,001 bis 0,1 g/l) injiziert. Für die Messungen wurden Ul trafiltrationsmembranen mit einem cut-off von 5000 und 10000 Dalton eingesetzt (Filtron, Typ Omega).

Fig. 6 zeigt die erhaltene Meßkurve: Wie man sieht, ist die relative Fluoreszenz direkt pro portional zur injizierten Glucosekonzentration.

Analoge Kurven können, wie oben für die permeabi lisierten Zellen angegeben, für Fructose bzw. Sorbit ermittelt werden.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glu cose oder Fructose oder Sorbit durch adenin-di nukleotid-abhängig enzymatische Umsetzung in einem Durchflußreaktor, in dem in der Reaktions flüssigkeit enthaltenes Enzym und Coenzym durch eine entsprechende Filtrationsmembran zurückge halten werden und Messung der Fluoreszenzände rung aufgrund der die Umsetzung begleitenden Um wandlung des Coenzyms in die reduzierte bzw. oxidierte Form, dadurch gekennzeichnet, daß für die Umsetzung Glucose-Fructose-Oxidore duktase (GFOR) mit fest daran gebundenem NADP-Coenzym verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Umsetzung permeabilisierte Zellen von Zymomonas mobilis mit GFOR-NADP-Coenzym verwendet wer den.