DE4037838C1 - Micro-titration of coagulation reactions of plasma - subjected to delay phases but continuously mixed in heated measuring shaft - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mikrotitration verzögerungsphasenbehafteter Gerinnungsreaktionen von Plasma gemäß Hauptpatent P 40 18 233.

Sowohl die Aggregation, die Gerinnung und die Fibrinolyse sind verzögerungsphasenbehaftete Reaktionen. Das heißt, daß eine Reaktion selbst bei maximaler initialer Aktivierung durch ein reaktionsauslösendes Agenz erst nach Ablauf einer reaktionsspezifischen Verzögerungsphase in Gang kommt. Bei der kollageninduzierten Aggregation beträgt die Verzögerungsphase etwa 50 Sekunden, bei der Thrombinzeit etwa 15 Sekunden und bei der partiellen Thromboplastinzeit etwa 40 Sekunden. Aus diesem Grunde erscheint die Möglichkeit zur titrimetrischen Gerinnungsbestimmung nicht direkt offensichtlich; denn man erwartet bei derartigen Reaktionen bedingt durch den verzögerten Reaktionsablauf eine Übertitration. Im Test erreicht man durch die stufenweise Verlangsamung der Reagenzienzufuhr eine asympthotische Annäherung der gemessenen Schwellenkonzentration an einen Plateau-Wert, so daß durch eine weitere Verlangsamung der Reagenzienzufuhr keine weitere Abnahme der Schwellenkonzentration eintritt. Vermutlich hat im Plateau-Bereich die reaktionsspezifische Verzögerungskinetik keinen Einfluß mehr auf die Schwellenkonzentrationsbestimmung, so daß eine Übertritration mit fälschlicherweise zu hoch bestimmten Schwellenkonzentrationen hier nicht zu erwarten ist. Als Konsequenz für gerinnungstitrimetrische Bestimmungen ergibt sich die Notwendigkeit der Wahl einer Stoffzufuhrgeschwindigkeit im reaktionsspezifischen Plateaubereich.

Da allgemein für Gerinnungsuntersuchungen nicht mehr als zirka 300 µl Plasma pro Test veranschlagt werden, ergeben sich hieraus entsprechend kleine Reagenzienmengen, die ihrerseits über einen längeren Zeitraum mit konstant langsamer Geschwindigkeit und tropfenfrei zugegeben werden müssen.

Weitere Besonderheiten gegenüber anderen titrimetrischen Verfahren ergeben sich aus der strengen Temperaturabhängigkeit von Gerinnungsuntersuchungen, aus dem Einsatz des unverdünnten Probenmaterials im µl-Bereich, aus dem Einsatz spezieller elektromechanischer bzw. lichtoptischer Registrierungsmechanismen zur Erfassung von Gerinnungsreaktionen, sowie aus der Meßgröße selbst, denn während gängige titrimetrische Verfahren auf die Konzentrationsbestimmung eines Parameters in einer Gleichgewichtsreaktion ausgerichtet sind, wird bei der Gerinnungstitration die Menge bzw. die Schwellenkonzentration des reaktionsauslösenden Agenz bestimmt.

150 µl plättchenarmes Plasma werden in einer Rundküvette, die um ihre Längsachse rotiert, 2 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Anschließend wird eine an einer Führungsschiene aufgehängte Zufuhrkapillare, die mit einem kleinen Metallblock versehen ist, in das Plasma eingetaucht. Bedingt durch das Gewicht der Zufuhrkapillare und des kleinen Metallblocks, steht die Zufuhrkapillare senkrecht und wird selbst durch das rotierende Plasma nicht ausgelenkt. Durch die Zufuhrkapillare erfolgt die kontinuierliche tropfenfreie Zufuhr gerinnungsreduzierender Agenzien. Gleichzeitig erfolgt durch die stationär eintauchende Zufuhrkapillare ins rotierende Plasma ein Mischvorgang. Wird die Schwellenkonzentration zur Gerinnungsaktivierung erreicht, steigt die Plasmaviskosität und damit verbunden die wirksamen Scherkräfte an der Zufuhrkapillaren an, so daß nun eine Seitauslenkung der Zufuhrkapillaren und des Metallblocks eintritt, die über einen magnetischen Detektor erfaßt wird. Die Menge an zugeführtem reaktionsaktivierenden Agenz bis zum Eintritt der Gerinnung dient als Meßgröße und wird aus der Zufuhrgeschwindigkeit und der Gerinnungszeit berechnet.

Zur Beurteilung der plasmatischen Gerinnung werden bislang die mechanisierte Häkchenmethode nach Schnitger und Gross, die Kugelmethode sowie kalorimetrische und optische Verfahren verwendet. Bei allen Methoden wird immer die Gerinnungszeit nach einmaliger Zugabe einer bestimmten Konzentration eines gerinnungsauslösenden Agenz gemessen.

Bei der Häkchenmethode wird eine als Häkchen geformte Elektrode regelmäßig durch das Reaktionsgemisch bewegt. Diese Elektrode steht unter Spannung. Eine zweite, nicht stromführende Elektrode, befindet sich im Reaktionsansatz. Entsteht ein Fibrinfaden, so bleibt er an der bewegten Elektrode hängen. Er schließt den Stromkreis zur zweiten Elektrode. Eine nachgeschaltete Elektronik registriert die leitende Verbindung zwischen beiden Elektroden und beendet den Meßvorgang.

Nach DE-OS 35 23 906 befindet sich der Gerinnungsansatz bei der Kugelmethode in einem schräggelagerten Röhrchen, das sich langsam um die Längsachse dreht. Eine Kugel läuft vor dem Eintritt der Gerinnung durch die Schwerkraft exakt an vorgegebener Stelle. Beim Einsatz der Gerinnung wird die Kugel durch die sich bildenden Fibrinfäden mitgenommen. Ihre Lageänderung löst in einem magnetischen Sensor einen Impuls aus, der automatisch registriert wird.

D. Watt, R. L. Berger, D. Green und M. A. Marini (Thermal Titration: Application of Calorimetry to the Study of Plasma Coagulation, Clin. Chem., 1974) beschrieben eine Methode zur kalorimetrischen Registrierung des Gerinnungsablaufs. Dabei wurden 4 ml eines 10fach verdünnten Plasmas in eine Reaktionskammer eingefüllt. Gleichzeitig wurden 6 µl Thrombin-Reagenz (1000 units/ml) in eine dünne Kapillare aufgesogen, die dann mit Dichtungsmaterial verschlossen wurde. Die verschlossene Kapillare mit dem reaktionsauslösendem Agenz wurde ebenfalls in der Reaktionskammer positioniert. Anschließend wurden das verdünnte Plasma und die thrombinreagenzhaltige Kapillare 10 Minuten bei 20 Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubationsphase wurde das Thrombin-Reagenz aus der Kapillaren in das verdünnte Plasma freigesetzt und mit diesem verrührt. Die teils endothermen, teils exothermen Phasen im Gerinnungsablauf wurden durch die begleitenden Temperaturänderungen über einen Thermistor erfaßt und über einen Schreiber aufgezeichnet.

Die Gerinnungszeit kann auch mit optischen Methoden turbidimetrisch oder nephelometrisch gemessen werden. Diese Methoden beruhen darauf, daß sich während des Gerinnungsvorgangs die optischen Eigenschaften der Plasmaprobe ändern bzw. die Spaltung eines chromogenen Substrats unter Thrombinwirkung bei 405 nm photometrisch verfolgt wird.

Nach US-PS 40 74 971 ist ein lichtoptisches Gerinnungsmeßverfahren für Vollblutanalysen bekannt, wobei in einer Meßvorrichtung getrennte Kammern zur Aufnahme von Reagenz und Probe vorgesehen sind und wobei das Zusammenführen von Probe und Reagenz beim Aufstecken auf eine Luftzufuhrdüse erfolgt. Die Luftzufuhr übt sowohl eine Mischfunktion, eine Aktivatorfunktion und eine Indikatorfunktion aus. Kommt es nach Ablauf der Latenzzeit zur Gerinnselbildung, wird das geronnene Blut durch die Luftblasen aufgeschwemmt. Dadurch kommt es zur Änderung der optischen Dichte. Dies wird durch eine Lichtschranke mit nachgeschalteter Elektronik registriert.

Nach US-PS 45 34 939 ist eine Weiterentwicklung des Verfahrens nach US-PS 40 74 971 bekannt. Dabei befindet sich in der Meßkammer getrennt von der Probe eine Papierkapsel mit trockenem Reagenz. Beim Aufstecken der Meßkammer auf eine Luftzufuhrdüse wird die Papierkapsel zerrissen und Probe und Reagenz zusammengeführt. Die Luftzufuhr übt sowohl eine Mischfunktion, eine Aktivatorfunktion und eine Indikatorfunktion aus. Kommt es nach abgelaufener Latenzzeit zur Gerinnungsbildung, so wird das geronnene Blut durch die Luftblasen aufgeschwemmt. Dadurch ändert sich die optische Dichte. Dies wird durch eine Lichtschranke mit nachgeschalteter Elektronik registriert.

Alle genannten Methoden zur Erfassung des Gerinnungsendpunktes sind auf die einmalige Zugabe einer bestimmten Induktorkonzentration ausgelegt (in der Regel durch eine Kolbenhubpipette). Das Gerinnungspotential der Probe wird anschließend durch die Messung der Gerinnungszeit bestimmt.

Nach Hauptpatent P 40 18 233 ist ein Verfahren zur Bestimmung der Induktorschwellenkonzentration zur Auslösung von Gerinnungs- oder Aggregationsvorgängen im Plasma bekannt. Dabei wird dem Plasma in einer beheizten Meßvorrichtung unter ständiger Durchmischung über einen längeren Zeitraum mit konstanter Geschwindigkeit gerinnungs- oder aggregationsaktivierendes Agenz zugeführt und die Menge des zugeführten gerinnungs- oder aggregationsaktivierenden Agenz bis zum Zeitpunkt des mechanisch oder lichtoptisch meßbaren Gerinnungs- oder Aggregationsbeginns erfaßt.

Im Rahmen des Anmeldungsgegenstands wird die Messung der Schwellenkonzentration zur Auslösung von Gerinnungsreaktionen durch einen speziellen mechanischen Gerinnungsdetektor ermöglicht. Das Gerinnungspotential der Probe (patientenindividuell) ist hierbei direkt proportional der gemessenen Induktorschwellenkonzentration.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine automatische Registrierung der Induktorschwellenkonzentration bei Gerinnungsuntersuchungen durch ein mechanisches Detektionssystem zu ermöglichen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Hierbei wird dem Plasma in einer Rundküvette, die um ihre Längsachse rotiert, über ein Pipettiersystem mit einer feinen senkrecht aufgehängten ins Plasma reichende Zufuhrkapillaren, welche mit dem Metallblock eines magnetischen Sensors versehen ist, kontinuierlich und tropfenfrei gerinnungsaktivierendes Agenz zugeführt. Bei ausreichender Konzentration dieser Substanz wird die Fibrinbildung angestoßen. Es kommt so über eine Erhöhung der Plasmaviskosität zur Zunahme der rotationsbedingten Scherkräfte an der Zufuhrkapillaren. Die dadurch bedingte Auslenkung der Zufuhrkapillaren wird durch den magnetischen Sensor erfaßt. Die Menge an zugeführtem reaktionsaktivierenden Agenz bis zum Eintritt der Gerinnung dient als Meßgröße und wird aus der Zufuhrgeschwindigkeit und der Gerinnungszeit berechnet.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen in der Möglichkeit der Messung der Induktorschwellenkonzentration als metrisches Maß für das Gerinnungspotential einer Patientenprobe. Außerdem wird eine gerinnungsphysiologische Monitorisierung der niedrig dosierten Heparintherapie ermöglicht.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.

Fig. 1 zeigt das Schema einer erfindungsgemäßen Meßvorrichtung.

In einer Meßvorrichtung (Fig. 1) ist eine Rundküvette (3) in einem beheizbaren mit konstanter Geschwindigkeit drehbaren (1) Meßschachttrakt (2) positioniert. Weiter ist in die Meßvorrichtung ein Pumpenmechanismus, bestehend aus einer Schubvorrichtung (7), die motorgetrieben bzw. schrittmotorgetrieben einen Vorschub mit konstanter Geschwindigkeit ermöglicht, und ein Kolbenhubzylinder (8), der eingespannt in die Schubvorrichtung einen konstanten Reagenzienzustrom gewährleistet, integriert. Zum Pumpenmechanismus gehören weiter ein Vorratsgefäß (9) für das Reagenz sowie ein Schlauchsystem (10) mit Dreiwegebahn (11), welches das Reagenz einem Pipettiersystem zuführt. Das Pipettiersystem besteht aus einer an einer Führungsschiene (12) befestigten dünnen Zufuhrkapillaren (6), wobei die Führungsschiene in einem Führungsblock (13) manuell oder motorgetrieben soweit auf und ab bewegt werden kann, daß die Zufuhrkapillare zum einen bis unter den Flüssigkeitsmenikus in das Plasma eintauchen zum anderen die Rundküvette freigeben kann. Weiter befinden sich im Führungsblock Kontakte (14), die das Eintauchen der Zufuhrkapillaren in das Plasma indirekt erfassen und über einen Steuerkreis den Start des Meßvorganges ermöglichen. Der Detektionsmechanismus besteht aus einem zufuhrkapillaradhärenten Metallblock (4) und einem magnetischen Sensor (5), der jegliche Auslenkung der Zufuhrkapillaren erfaßt.

Claims (10)

1. Verfahren zur Mikrotitration verzögerungsphasenbehafteter Gerinnungsreaktionen von Plasma, bei dem dem beheizten Untersuchungsmaterial unter ständiger Durchmischung über eine fein ausgezogene ins Untersuchungsmaterial reichende Zufuhrkapillare kontinuierlich und tropfenfrei mit jeweils auf die reaktionsspezifische Verzögerungskinetik abgestimmte Stoffzufuhrgeschwindigkeit reaktionsauslösendes und/oder reaktionsbeeinflussendes Agenz zugeführt wird der Gerinnungsbeginn mechanisch erfaßt wird und die verbrauchte Menge an reaktionsauslösendem Agenz als Meßgröße dient, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung durch die gerinnungsabhängige viskosimetrisch bedingte Auslenkung einer randständigen Zufuhrkapillare in einer rotierenden Rundküvette erfolgt.

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen beheizbaren, geradstehenden und mit konstanter Geschwindigkeit drehbaren (1) Meßschachttrakt (2), der zur Aufnahme von Rundküvetten (3) dient, und durch einen Pumpen(7, 8, 9, 10, 11)- und Pipettiermechanismus (6, 12, 13, 14) für die Zufuhr reaktionsaktivierender und/oder reaktionsbeeinflussender Agenzien, wobei eine küvettenrandnahe Zufuhrkapillare (6) mit einem Detektor (4, 5) ausgestattet ist, der jegliche Seitauslenkung der Zufuhrkapillaren erfaßt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Pumpenmechanismus aus einer Präzisionsschubvorrichtung (7) besteht, welche durch Aufnahme eines kleinvolumigen Kolbenhubzylinders (8) minimale Stoffzufuhrgeschwindigkeiten von 2 µl/min ermöglicht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Pumpenmechanismus aus einer Präzisionsschlauchpumpe besteht, die durch Verwendung entsprechend niedrig dimensionierter Schläuche mit nur geringer Materialermüdung minimale Stoffzufuhrgeschwindigkeiten von 2 µl/min ermöglicht.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Pumpenmechanismus reaktionsaktivierendes Agenz aus einem Vorratsgefäß (9) über ein Schlauchsystem (10) und einen Dreiwegehahn (11) dem Pipettiersystem (6, 12, 13, 14) zuführt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufnahme des Vorratsgefäßes eine beheizte schachtartige Vertiefung existiert, an deren Basis ein motorgetriebener Magnet als Antrieb für einen Rührmagneten vorgesehen ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das kapillarnahe Schlauchsystem durch einen Wärmetauscher geführt wird, der für die nötige Reagenztemperierung sorgt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Pipettiersystem aus einer an einer Führungsschiene (12) befestigten Zufuhrkapillare (6) besteht, und die Führungsschiene in einem Führungsblock (13) manuell oder automatisch soweit auf und ab bewegt werden kann, daß die Zufuhrkapillare einerseits bis unter den Flüssigkeitsmeniskus in die Küvette (3) eintauchen, andererseits alternierend ein- und austauchen bzw. die Küvette ganz freigeben kann.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in den Führungsblock (13) Kontakte (14) integriert sind, die indirekt das Eintauchen der Kapillaren in das Plasma registrieren und über einen Steuerkreis den Meßvorgang in Gang setzen.

10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in den Führungsblock eine Lichtschranke integriert ist, die indirekt das Eintauchen der Kapillaren in das Plasma registriert und über einen Steuerkreis den Meßvorgang in Gang setzt.