DE4018233C2 - - Google Patents

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Induktorschwellenkonzentration zur Auslösung von Gerinnungs- oder Aggregationsvorgängen im Plasma.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Induktorschwellenkonzentration zur Auslösung von Gerinnungs- oder Aggregationsvorgängen im Plasma.

300 µl plättchenreiches Plasma wird in geeigneten Küvetten 2 Minuten lang inkubiert. Anschließend wird bei ständigem Rührvorgang über ein Pipettiersystem, welches eine langsame Stoffzufuhr mit konstanter Geschwindigkeit ermöglicht, über 15 Minuten hinweg aggregationsauslösendes Agenz zugegeben. Bei ausreichender Konzentration dieser Substanz kommt es zur Anlagerung der Plättchen untereinander. Es entstehen zuerst kleine Aggregate, die unter der Wirkung einer zunehmenden Aggregationsinduktorkonzentration rasch heranwachsen. Hierbei tritt im Untersuchungsmaterial eine Änderung der optischen Dichte ein, die photometrisch als Zeit-Transmissionsdiagramm registriert werden kann. Zur Beurteilung des Aggregationsvermögens wird die Schwellenkonzentration des aggregationsinduzierenden Agenz (bei konstanter Geschwindigkeit der Stoffzufuhr proportional der Zeitspanne bis hin zum Reaktionsbeginn) und die maximale Transmissionsänderung ermittelt.

300 µl plättchenarmes Plasma wird in geeigneten Küvetten 2 Minuten lang inkubiert. Anschließend wird bei ständigem Rührvorgang über ein Pipettiersystem, welches eine langsame Stoffzufuhr mit konstanter Geschwindigkeit ermöglicht, über 15 Minuten hinweg gerinnungsinduzierendes Agenz (z. B. Thrombin) zugegeben. Bei ausreichender Konzentration dieser Substanz (abhängig von der Fibrinkonzentration und vom Inhibitorpotential) werden enzymatische Reaktionen eingeleitet, in deren Verlauf aus Fibrinogen Fibrinmonomere entstehen, die zu Fibrinfäden polymerisieren. Die entstehenden Fibrinfäden werden sofort vom Rührstäbchen des Magnetrührers heruntergerührt, so daß im Überstand eine Lichttransmissionsänderung eintritt, die photometrisch als Zeit-Transmissionsdiagramm registriert werden kann. Zur Beurteilung des Gerinnungspotentials wird die Schwellenkonzentration des gerinnungsinduzierenden Agenz (bei konstanter Geschwindigkeit der Stoffzufuhr proportional der Zeitspanne bis zum Reaktionsbeginn) ermittelt.

Nach G. V. R. Born (Aggregation of blood platelets by adenosine-diphosphate and its reversal, Nature, 1962) ist ein Verfahren zur Registrierung des Aggregationsvermögens von Blutplättchen bekannt. Dabei wird die Plättchenaggregation nach initialer Zugabe einer bestimmten Konzentration eines aggregationsinduzierenden Agenz photometrisch unter ständiger Durchmischung verfolgt.

Zur Beurteilung der plasmatischen Gerinnung werden bislang die mechanisierte Häkchenmethode nach Schnitger und Gross, die Kugelmethode sowie kalorimetrische und optische Verfahren verwendet. Bei allen Methoden wird immer die Gerinnungszeit nach einmaliger Zugabe einer bestimmten Konzentration eines gerinnungsauslösenden Agenz gemessen.

Bei der Häkchenmethode wird eine als Häkchen geformte Elektrode regelmäßig durch das Reaktionsgemisch bewegt. Diese Elektrode steht unter Spannung. Eine zweite, nicht stromführende Elektrode, befindet sich im Reaktionsansatz. Entsteht ein Fribinfaden, so bleibt er an der bewegten Elektrode hängen. Er schließt den Stromkreis zur zweiten Elektrode. Eine nachgeschaltete Elektronik registriert die leitende Verbindung zwischen den beiden Elektroden und beendet den Meßvorgang.

Nach DE-OS 35 23 906 befindet sich der Gerinnungsansatz bei der Kugelmethode in einem schräggelagerten Röhrchen, das sich langsam um die Längsachse dreht. Eine Kugel läuft vor dem Eintritt der Gerinnung durch die Schwerkraft exakt an vorgegebener Stelle. Beim Einsatz der Gerinnung wird die Kugel durch die sich bildenden Fibrinfäden mitgenommen. Ihre Lageänderung löst in einem magnetischen Sensor einen Impuls aus, der automatisch registriert wird.

D. Watt, R. L. Berger, D. Green und M. A. Marini (Thermal Titration: Application of Calorimetry to the Study of Plasma Coagulation, Clin. Chem., 1974) beschrieben eine Methode zur kalorimetrischen Registrierung des Gerinnungsablaufs. Dabei wurden 4 ml eines 10fach verdünnten Plasmas in eine Reaktionskammer eingefüllt. Gleichzeitig wurden 6 µl Thrombin-Reagenz (1000 units/ ml) in eine dünne Kapillare aufgezogen, die dann mit Dichtungsmaterial verschlossen wurde. Die verschlossene Kapillare mit dem reaktionsauslösenden Agenz wurde ebenfalls in der Reaktionskammer positioniert. Anschließend wurden das verdünnte Plasma und die thrombinreagenzhaltige Kapillare 10 Minuten bei 20 Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubationsphase wurde das Thrombin-Reagenz aus der Kapillaren in das verdünnte Plasma freigesetzt und mit diesem verrührt. Die teils endothermen, teils exothermen Phasen im Gerinnungsablauf wurden durch die begleitenden Temperaturänderungen über einen Thermistor erfaßt und über einen Schreiber aufgezeichnet.

Die Gerinnungszeit kann auch mit optischen Methoden turbidimetrisch oder nephelometrisch gemessen werden. Diese Methoden beruhen darauf, daß sich während des Gerinnungsvorgangs die optischen Eigenschaften der Plasmaprobe ändern.

Nach US-PS 40 74 971 ist ein lichtoptisches Gerinnungsmeßverfahren für Vollblutanalysen bekannt, wobei in einer Meßvorrichtung getrennte Kammern zur Aufnahme von Reagenz und Probe vorgesehen sind und wobei das Zusammenführen von Probe und Reagenz beim Aufstecken auf eine Luftzufuhrdüse erfolgt. Die Luftzufuhr übt sowohl eine Mischfunktion, eine Aktivatorfunktion und eine Indikatorfunktion aus. Kommt es nach Ablauf der Latenzzeit zur Gerinnselbildung wird das geronnene Blut durch die Luftblasen aufgeschwemmt. Dadurch kommt es zur Änderung der optischen Dichte. Dies wird durch eine Lichtschranke mit nachgeschalteter Elektronik registriert.

Nach US-PS 45 34 939 ist eine Weiterentwicklung des Verfahrens nach US-PS 40 74 971 bekannt. Dabei befindet sich in der Meßkammer von der Probe getrennt eine Papierkapsel mit trockenem Reagenz. Beim Aufstecken der Meßkammer auf eine Luftzufuhrdüse wird die Papierkapsel zerrissen und Probe und Reagenz zusammengeführt. Die Luftzufuhr übt sowohl eine Mischfunktion, eine Aktivatorfunktion und eine Indikatorfunktion aus. Kommt es nach abgelaufener Latenzzeit zur Gerinnselbildung, so wird das geronnene Blut durch die Luftblasen aufgeschwemmt. Dadurch ändert sich die optische Dichte. Dies wird durch eine Lichtschranke mit nachgeschalteter Elektronik registriert.

Sowohl die Aggregationsmethode nach Born als auch die genannten Methoden zur Erfassung des Gerinnungsendpunktes sind alle auf eine einmalige Zugabe einer bestimmten Induktorkonzentration ausgelegt. Das Aggregations- oder Gerinnungspotential der Probe wird anschließend an Sekundärphänomenen gemessen (max. Transmissionsänderung bei der Aggregation bzw. Gerinnungszeit bei der plasmatischen Gerinnung).

Dagegen wird im Rahmen des Anmeldungsgegenstands erstmalig eine Messung der Schwellenkonzentration bezüglich der minimalen Menge an aggregations- oder gerinnungsauslösendem Agenz möglich. Das Aggregations- oder das Gerinnungspotential der Probe (patientenindividuell) ist hierbei direkt proportional zur gemessenen Induktorschwellenkonzentration.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine automatische Registrierung der Induktorschwellenkonzentration bei Aggregations- oder Gerinnungsuntersuchungen zu ermöglichen.

Die Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 bzw. 2 angegebenen Merkmale gelöst. Dabei wird Plasma in geeigneten Küvetten 2 Minuten inkubiert. Anschließend wird unter ständigem Rührvorgang über ein Pipettiersystem, welches eine langsame Stoffzufuhr mit konstanter Geschwindigkeit ermöglicht, aggregations- oder gerinnungsauslösendes Agenz zugeführt. Bei Erreichen der Schwellenkonzentration bilden sich Aggregate bzw. Fibrinfäden aus. Sowohl die zunehmende Aggregation als auch die Ausbildung von Fibrinfäden, die durch den Rührer heruntergerührt werden, hat eine Zunahme der Lichttransmission zur Folge, die photometrisch als Zeit-Transmissionsdiagramm registriert werden kann. Bei konstanter Geschwindigkeit der Stoffzufuhr ist die Zeitspanne bis zum Reaktionseintritt (ausreichend langsame Reagenzienzufuhr vorausgesetzt) ein Maß für die Induktorschwellenkonzentration.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen in der Möglichkeit der Messung der Induktorschwellenkonzentration als metrisches Maß für das Aggregations- bzw. Gerinnungspotential einer Patientenprobe.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.

Fig. 1 zeigt das Schema einer beispielhaften Meßvorrichtung.

Fig. 2a deutet den wesentlichen Reaktionsschritt der Aggregationsreaktion an, und zwar die Ausbildung von Aggregaten und die damit verbundene Zunahme der Lichttransmission.

Fig. 2b deutet den wesentlichen Reaktionsschritt der Gerinnungsreaktion an, und zwar das Herunterrühren der sich ausbildenden Fibrinfäden und die damit verbundene Änderung der Lichttransmission.

In einer Meßvorrichtung (Fig. 1) ist eine Küvette (1), die ein Rührstäbchen (4) enthält, so positioniert, daß unterhalb der Küvette ein Magnetrührerantrieb, bestehend aus Motor (6) und Magneten (5), wirksam werden kann. Weiterhin sind beidseits der Küvette in Form einer Lichtquelle (3) und eines Lichtsensors (2) die optischen Voraussetzungen für eine photometrischen Messung gegeben. Darüberhinaus sind in die Meßvorrichtung ein Pumpenmechanismus, bestehend aus einer Schubvorrichtung (11), die motorgetrieben bzw. schrittmotorgetrieben einen Vorschub mit konstanter Geschwindigkeit ermöglicht, und einer Kolbenhubspritze (10), die in die Schubvorrichtung eingespannt einen konstanten Reagenzienzustrom gewährleistet, integriert. Zum Pumpenmechanismus gehören weiter ein Vorratsgefäß (9) für das Reagenz sowie ein Schlauchsystem (8) mit Dreiwegehahn (12), welches das Reagenz einem Pipettiersystem zuführt. Das Pipettiersystem besteht aus einer an einer Führungsschiene (13) befestigten dünnen Hohlnadel (7), wobei die Führungsschiene in einem Führungsblock (14) manuell oder motorgetrieben soweit auf und ab bewegt werden kann, daß die Hohlnadel zum einen bis unter den Flüssigkeitsmeniskus in die Küvette eintauchen zum anderen die Küvette freigeben kann. Weiter befinden sich im Führungsblock Kontakte (15), die das Eintauchen der Hohlnadel in die Küvette erfassen und sofort den Meßvorgang in Gang setzen.

In Fig. 2a ist die mit der Aggregationsreaktion verbundene Ausbildung von Aggregaten während der Zufuhr von aggregationsinduzierenden Agenzien angedeutet. Das primär trübe plättchenreiche Plasma wird während der Ausbildung der Aggregate zunehmend klar. Zuletzt befinden sich nur noch wenige größere Aggregate im Reaktionsansatz, so daß sich insgesamt eine Zunahme der Lichttransmission abzeichnet.

In Fig. 2b ist das mit der Gerinnungsreaktion verbundene Herunterrühren der Fibrinfäden angedeutet. Dadurch kommt es zu einer Lichttransmissionszunahme im Überstand. Zuletzt bilden die Fibrinfäden ein kompaktes rührstäbchenadhärentes Gerinnsel aus.

Claims (8)

1. Verfahren zur Bestimmung der Induktorschwellenkonzentration zur Auflösung von Gerinnungs- oder Aggregationsvorgängen im Plasma, dadurch gekennzeichnet, daß dem zu untersuchenden Plasma in einer beheizten Meßvorrichtung unter ständiger Durchmischung über einen längeren Zeitraum mit konstanter Geschwindigkeit gerinnungs- oder aggregationsaktivierendes Agenz zugeführt wird, und daß die Menge des zugeführten gerinnungs- oder aggregationsaktivierenden Agenz bis zum Zeitpunkt des mechanisch oder lichtoptisch meßbaren Gerinnungs- oder Aggregationsbeginns erfaßt wird.

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen beheizbaren Meßschachttrakt zur Aufnahme von Meßküvetten (1), wobei in das Meßschachtsystem ein Photometer (2, 3), ein basaler Rührerantrieb (5, 6) und ein Pumpen- (10, 11) und Pipettiermechanismus (7, 13, 14) für die Zufuhr von gerinnungs- oder aggregationsaktivierendem Agenz integriert sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Photometer aus einer monochromatischen Lichtquelle (3), z. B. in Form eines Lasers, und aus einem Lichtsensor (2), z. B. in Form einer Photozelle, eines Photowiderstands, eines Phototransistors oder eines Photo-Multipliers besteht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der basale Rührantrieb aus einem motorgetriebenen (6) Magneten (5) besteht.

5. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Pumpenmechanismus aus einer Schubvorrichtung (11) besteht, welche die Aufnahme einer Kolbenhubspritze (10) ermöglicht und wobei gerinnungs- oder aggregationsaktivierendes Agenz aus einem Vorratsgefäß (9) über ein Schlauchsystem (8) und einem Dreiwegehahn (12) dem Pipettiersystem zugeführt wird.

6. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Pumpenmechanismus aus einer Schlauchpumpe besteht, die gerinnungs- oder aggregationsaktivierendes Agenz aus einem Vorratsgefäß über ein Schlauchsystem dem Pipettiersystem zuführt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Pipettiersystem aus einer an einer Führungsschiene (13) befestigten dünnen Hohlnadel (7) besteht, und die Führungsschiene in einem Führungsblock (14) manuell oder motorgetrieben soweit auf und ab bewegt werden kann, daß die Hohlnadel zum einen bis unter den Flüssigkeitsmeniskus in die Küvette eintauchen zum anderen die Küvette freigeben kann.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß in den Führungsblock (14) Kontakte (15) integriert sind, die das Eintauchen der Hohlnadel in die Küvette registrieren und sofort den Meßvorgang in Gang setzen.