DE4024937C1

DE4024937C1 - Microbial fermentation using continuously regenerated redox mediator - where microbe is anaerobic,facultative anaerobe, or is micro-aerophilic or aero:tolerant

Info

Publication number: DE4024937C1
Application number: DE19904024937
Authority: DE
Inventors: Rainer 7400 Tuebingen De Emde; Walter 7000 Stuttgart De Troesch; Wolfgang 7402 Kirchentellinsfurt De Krischke; Beate 7128 Lauffen De Schuppert
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1990-08-06
Filing date: 1990-08-06
Publication date: 1992-04-02
Anticipated expiration: 2010-08-07

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung organi scher Produkte unter Verwendung anaerober, fakultativ anaero ber, mikroaerophiler oder aerotoleranter Mikroorganismen durch biologischen Abbau organischer Substrate gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Die oben genannten Mikroorganismen und insbesondere anaerobe Mikroorganismen können eine Vielzahl organischer Kohlen stoffverbindungen vergären und dabei die nötige Ener gie gewinnen. Man kann eine Gärung als eine Redoxreaktion zwischen zwei Kohlenstoffverbindungen definieren. Ein Teil des Substrats wird oxidiert, wobei die hierbei freiwerdende Energie in Form von ATP konserviert wird. Die bei den Oxida tionsreaktionen anfallenden Elektronen (Reduktionsäquivalente) müssen auf einen Akzeptor, der aus dem Substrat gebildet wird, übertragen werden. Es entstehen so immer oxidierte und redu zierte Gärendprodukte, die ins Medium ausgeschieden werden. Dieses Prinzip liegt jeder Gärung anaerober Mikroorganismen zugrunde. Bei vielen Gärungen, insbesondere unter Verwendung anaerober Mikroorganismen mit verzweigtem Gärstoffwechsel, entstehen wertvolle oxidierte und reduzierte Produkte simul tan. Oft besteht jedoch nur Bedarf für eines der Produkte. Es wäre daher von Vorteil, wenn die Stoffwechselvorgänge so beeinflußt werden könnten, daß nur das gewünschte, d. h. entweder das oxidierte oder das reduzierte Produkt ge bildet wird.

Bei bisherigen Experimenten zur Manipulation des Produkt spektrums bei Mikroorganismen wurde direkt in den zellulären Stoffwechsel eingegriffen, z. B. mit Kohlenmonoxid (Appl. Environ. Microbiol. 48, 764 (1984) oder mit Wasserstoff (Zeikus, US-Patent, Nr. 47 32 855, 22. 3. 88) oder es wurden dem Kulturmedium Redoxsysteme, z. B. Viologenfarbstoffe (Appl. Environ. Microbiol. 53, 1232 (1987)) zugegeben.

Elektrochemische Systeme im Zusammenhang mit Mikroorganismen wurden seit längerem erforscht, z. B in Brennstoffzellen (Umwandlung chemischer Energie in elektrische mit Hilfe biologischer Systeme), bei der Entwicklung von Biosensoren und bei der Unterstützung enzymatischer Reaktionen (Co- Faktor-Regenerierung, Übersicht in: Biotechnol. Eng. Symp. 12, 401 (1982)). Ähnliche Experimente befaßten sich mit der Verbesserung der Substratverwertung bei anaeroben Mikro organismen (Appl. Microbiol. Biotechnol. 32 : 170 (1989)).

Die bisherigen Versuche zur Einflußnahme auf das Produkt spektrum anaerober Mikroorganismen waren nur für spezielle Fälle geeignet (H₂, CO) oder nicht kontinuierlich durch führbar.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit der dem Stoffwechsel anaerober, fakultativ anaerober, mikroaerophiler und aero toleranter Mikroorganismen mit verzweigtem Gärstoffwechsel so gesteuert werden kann, daß überwiegend oder nur die stär ker oxidierten oder die stärker reduzierten Produkte gebil det werden. Das Verfahren soll auf einfache Weise die Gewin nung des gewünschten Produktes ermöglichen. Das Verfahren soll industriell in großem Maßstab durchführbar sein und insbesondere die Gewinnung von Gärprodukten, wie Propion säure, Acetat, Butyrat, Isopropanol, Butanol, Lactat, Aceton 2,3-Butandiol, 1,3-Propandiol und Ethanol als Massenrohstoffe für die chemische Industrie und als Substituenten für fossile Brennstoffe ermöglichen. Das Verfahren soll hohe Wirtschaft lichkeit besitzen, d. h. insbesondere sollen die Aufarbeitungs kosten gering sein. Die Aufarbeitungskosten steigen mit der Zahl der Reinigungsschritte, d. h. wenn Produkte in Gemischen vorliegen, wie bei allen heterofermentativen Gärungen, läßt sich eine Wirtschaftlichkeit kaum erreichen. Deshalb soll die Gärung so gesteuert werden, daß die gewünschten oben genannten Gärprodukte, wie insbesondere Propionsäure, Aceton, Butanol, Lactat als alleinige Produkte anfallen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur gezielten Herstellung organischer Produkte unter Verwendung von anaeroben, fakultativ anaeroben, mikroaerophilen oder aerotoleranten Mikroorganismen mit verzweigtem Gärstoffwechsel durch biologischen Abbau organischer Substrate durch Beeinflussung der Gärung auf solche Weise, daß das jeweils stärker oxidierte oder stärker reduzierte Gärprodukt in einer Ausbeute über 90%, bezogen auf die Gesamtmenge der gebildeten Produkte, erhalten wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Kulturmedium ein Redoxmediator in Form einer Substanz, die keine oder geringe Toxizität aufweist, wasserlöslich ist, eine polare Struktur besitzt und in oxidierter und reduzierter Form stabil ist, zugesetzt und der Redoxmediator an einer potentialgesteuerten Arbeitselektrode zur Steuerung der Gärung in Richtung der gewünschten Produktbildung kontinuierlich regeneriert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen der o. g. Art mit verzweigtem Gärstoffwechsel anwendbar, bei denen jeweils stärker oxidierte und jeweils stärker reduzierte Produkte simultan gebildet werden. Es bietet die Möglichkeit, durch Regulation einer physikalischen Größe, des Redoxpotentials, außerhalb der Zelle im Kulturmedium, den zellulären Stoffwechsel zu verändern. Die Veränderung erfolgt über Einspeisung oder Entfernung von Elektronen mit Hilfe geeigneter Mediatormoleküle im Medium und entsprechenden Elektrodenvorgängen. Dadurch wird das Redoxgleichgewicht im Zellinneren verändert und Menge und Spektrum der gebildeten Endprodukte beeinflußt. So bietet sich die Möglichkeit, den Anteil gewünschter Produkte zu erhöhen, bzw. die Bildung unerwünschter zu unterdrücken und damit höhere Ausbeuten zu erzielen und die Produktgewinnung zu vereinfachen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für alle bekannten Gä rungen mit verzweigtem Gärstoffwechsel anwendbar. Es kann beispielsweise für folgende Gärungen verwendet werden:

- Heterofermentative Milchsäuregärung
Bifidobacterium bifidum bildet aus Glucose Lactat und Acetat. Das Produktspektrum kann durch die Anwendung des Verfahrens (reduzierende Bedingungen) in Richtung des kommerziell wichtigeren Produktes Milchsäure ver schoben werden. Als Substrate können auch technische Substrate, wie z. B. Molke und Molkepermeat eingesetzt werden.
- Propionsäuregärung
Substrate wie Zucker (Saccharose, Glucose, Lactose, Pentosen) oder Lactat, Glycerin, Malat werden zu Pro pionsäure und Essigsäure umgesetzt. Mikroorganismen sind Propionibakterien (z. B. Propionibacterium acidi propionici, Propionibacterium freudenreichii shermanii); Selenomonas ruminantium, Clostridium propionicum, Mega sphaera elsdenii, Bacteroides ruminicola. Die Anwendung des Verfahrens (reduzierende Bedingungen) führt zur überwiegenden Bildung des wirtschaftlich interessanteren Produktes Propionsäure.
- Buttersäure-Butanolgärung
Beteiligte Mikroorganismen sind Clostridien, die je nach Art unterschiedliche Substrate nutzen und unterschiedliche Produkte bilden.

Buttersäure-Acetat-Bildung durch C. butyricum, C. tyro butyricum, C. pasteurianum, C. pectinovorum aus Kohlen stoffquellen wie Glucose, Stärke, Dextrin, Lactat, Mannit, Pectin, Glycogen. Es wird neben Kohlendioxid und Wasser stoff Buttersäure und Essigsäure gebildet, durch Anwendung des Verfahrens (reduktive Bedingungen) wird die Bildung von Essigsäure verhindert.

Butanolbildung durch C. butylicum und C. acetobutylicum aus Glucose, Glycerin und Pyruvat. Neben Kohlendioxid und Wasserstoff bildet C. butylicum Butter-, Essigsäure, Butanol und Propanol, C. acetobutylicum Butter-, Essigsäure, Butanol, Aceton, Acetoin, Ethanol. Auch hier kann durch reduzierende Bedingungen die Bildung von Essigsäure und Aceton zugunsten der höherwertigen reduzierenden Produkte verringert werden.

Aus technischen Substraten werden für die Buttersäure-Buta nol-Gärung auch Melasse und Holzhydrolysate eingesetzt.

- Eubacterium-Gärung
Eubacterium limosum verwendet Glucose, Lactat, Pyruvat, aber auch Methanol und Kohlendioxid als Substrat, um daraus neben Gasen Buttersäure und Acetat zu produzieren. Auch hier ist eine Verschiebung der Gärbilanz durch reduktive Bedingungen auf die Seite der Buttersäure möglich.
- Gemischte Säuregärung durch Enterobacteriaceen
Als Substrat kommen eine Vielzahl von Kohlenhydraten in Frage, aus denen über zwei Gärungstypen eine Vielzahl von Gärprodukten gebildet wird.

Escherichia coli-Typ: gebildet werden neben Wasserstoff und Kohlendioxid Acetat, Lactat, Succinat und Ethanol.

Enterobacter aerogenes-Typ: neben Wasserstoff und Kohlen dioxid werden hauptsächlich 2,3-Butandiol, Ethanol und Formiat produziert. Auch hier kann durch Anwendung des Verfahrens die Bildung der oxidierten Produkte wie Acetat und Formiat verringert werden.

- Fumarat-Reduktase
Organismen wie Citrobacter freundii. Wolinella succino genes, Escherichia coli, Desulfovibrio gigas können Fuma rat mit Wasserstoff oder Formiat zu Succinat umsetzen. Durch Einspeisen von Elektronen nach dem beschriebenen Ver fahren kann auf Wasserstoff oder Formiat verzichtet werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muß zur Verbesserung des Elektronenaustausches zwischen Elektrode und Zellen dem Medium ein Redoxmediator mit einem solchen Standardredox potential zugegeben werden, daß Elektronen von den Zellen zur Elektrode bzw. in umgekehrter Richtung übertragen werden können. Hierzu eignen sich alle Substanzen, die sich oxidieren und reduzieren lassen und folgende Eigenschaften erfüllen:

- keine oder geringe Toxizität
- wasserlöslich
- polare Struktur
- in oxidierter und reduzierter Form stabil.

Als Redoxmediatoren kommen folgende Substanzgruppen in Be tracht:

- Viologenfarbstoffe, wie z. B. Methylviologen, Benzylviologen, Propylviologensulfonat
- Metallkomplexe, wie z. B. Kobaltsepulchrat, Kaliumhexa cyanoferrat
- Chinonfarbstoffe, wie z. B. Anthrachinon-2,6-disulfonsäure, Anthrochinon-2-sulfonsäure
- Triphenylmethanfarbstoffe, wie z. B. Metallviolett, Kristallviolett
- Methinfarbstoffe, wie z. B. Astraphloxin
- Pyrrolfarbstoffe und Porphyrinderivate
- Pteridine
- Flavine, wie z. B. Acriflavin, Riboflavin

Die jeweiligen Standardredoxpotentiale der Mediatoren sind der Fachliteratur zu entnehmen. Die einzelnen Mediatoren werden in einer Konzentration von 0,1 mM bis 10 mM, vorzugsweise 0,5 mM bis 5 mM, besonders bevorzugt 0,5 mM bis 3 mM, eingesetzt, wobei der optimale Konzentrationsbereich für den jeweiligen Mikroorganismus in einfachen Vorversuchen vom Fachmann bestimmt werden kann.

Im Fall der Propionsäuregewinnung wurde vorzugsweise das Kobaltsepulchrat verwendet, das ein Standardredoxpotential E₀ bei pH 7,0 von -350 mV besitzt. Die eingesetzte Konzentration ist dabei von der Zahl der Mikroorganismen im Kulturgefäß abhängig und reicht von 0,1 mM bis 10 MM, vorzugsweise von 0,1 mM bis 2 mM, besonders bevorzugt von 0,4 mM bis 1 mM, wobei bei einer Endkonzentration von 1,5 g/l Biotrockenmasse 0,5 bis 1 mM, bevorzugt 0,8 mM, Kobaltsepulchrat verwendet wurden.

In der beigefügten Fig. 1 ist ein Versuchsaufbau schematisch dargestellt. In der beigefügten Fig. 1 bedeutet 1 ein Potentiostat, 2 der Schreiber, 3 ein Rührkesselreaktor, 4 eine Gegenelektrode, 5 eine Referenzelektrode, 6 eine Arbeitselektrode und 7 ein Magnetrührer.

Die Arbeits-, Gegen- und Referenzelektrode werden an einen Potentiostaten angeschlossen. Als Arbeitselektrode können beispielsweise Platin- oder Kohlenstoffelektroden eingesetzt werden, als Gegenelektrode Elektroden aus edlen Metallen, vor zugsweise Platin, als Referenzelektroden werden Standardbe zugselektroden mit definierten Potential, beispielsweise Kalomelektroden oder Silber/Silberchloridelektroden ver wendet. Der Bereich der Gegenelektrode muß über eine leit fähige Grenzschicht, wie z. B. eine Membran oder eine Glas fritte, vom Arbeitselektrodenbereich abgetrennt sein. Um die Leitfähigkeit im Medium zu erhöhen, werden Salze zugesetzt, vorzugsweise Natriumchlorid oder Kaliumchlorid in einer Kon zentration von 0,1 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0,3 Gew.-%, bezogen auf das Reaktionsmedium.

Im Fermentationsmedium wird nun ein Sollpotential eingestellt, das so gewählt wird, daß,

1) wenn die jeweils stärker oxidierten Gärendprodukte gewonnen werden sollen, ca. 99% des eingesetzten Mediators in der oxidierten Form vorliegen
2) wenn die jeweils stärker reduzierten Gärendprodukte gewonnen werden sollen, ca. 99% des eingesetzten Mediators in der reduzierten Form vorliegen.

Der Potentiostat regelt die Einstellung des Sollpotentials im Medium, wobei als Bezugssystem die Referenzelektrode dient.

1) Wird das Sollpotential positiver als das Standardpotential des Mediators gewählt, wird der Mediator an der Arbeits elektrode oxidiert, an der Gegenelektrode laufen die Re duktionsprozesse ab.
2) Wird das Sollpotential negativer als das Standardpotential des Mediators gewählt, wird der Mediator an der Arbeits elektrode reduziert, an der Gegenelektrode laufen die Oxi dationsprozesse ab.

Man erhält hierbei einen Stromfluß zwischen Arbeits- und Gegenelektrode, der mit dem Potentiostaten gemessen werden kann. Der Stromfluß ist proportional zur Menge des 1) reduzierten oder 2) oxidierten Mediators, d. h. er geht gegen Null, wenn das Istpotential im Medium mit dem Sollpotential übereinstimmt.

Ist das eingestellte Sollpotential erreicht, was am Poten tiostaten abgelesen werden kann, kann das Medium mit den Mikroorganismen angeimpft werden.

Ist das Potential so gewählt, daß fast ausschließlich die oxidierten Gärendprodukte gebildet werden sollen, werden Elektronen aus dem Stoffwechsel der Zellen abgezogen und der Mediator im Medium reduziert. Der Mediator wird kon tinuierlich an der Arbeitselektrode wieder oxidiert, so daß der Stromfluß zwischen Arbeits- und Gegenelektrode proportional zur Re-oxidation des Mediators, bzw. zum Wachstum der Zellen ist.

Ist das Potential so gewählt, daß fast ausschließlich die reduzierten Gärendprodukte gebildet werden sollen, nehmen die Mikroorganismen Elektronen in ihren Stoffwechsel auf und der Mediator im Medium wird oxidiert. Der Mediator wird kontinuierlich an der Arbeitselektrode wieder redu ziert, so daß der Stromfluß proportional zur Re-reduktion des Mediators, bzw. zum Wachstum der Zellen ist.

Der Stromfluß kann über einen an den Potentiostaten an geschlossenen Schreiber aufgezeichnet werden.

An der Gegenelektrode tritt bei Stromfluß Gasentwicklung auf, bei oxidativen Vorgängen wird Chlorgas, bei reduk tiven Vorgängen Wasserstoff gebildet. Die Gase können bei Anwendung des Verfahrens in größerem Maßstab aufgefangen und einer weiteren Verwendung zugeführt werden.

Als Substrat werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jeweils die von den genannten Organismen oder anderen Or ganismen verwertbaren Substrate eingesetzt. Prinzipiell lassen sich Polysaccharide, Hexosen, Pentosen, Tetrosen, Triosen, Polyole, organische Säuren und Aminosäuren sowie Purine und Pyrimidine vergären. Neben synthetischen Sub straten wie Glucose oder Lactose können auch komplexe Me dien eingesetzt werden, wie beispielsweise Molke, Molke permeat, das als Abfallprodukt bei der Käseherstellung anfällt und Lactose als verwertbare C-Quelle enthält, wie auch Malzextrakt oder Holzhydrolysate. Ebenso einsetzbar sind andere zuckerhaltige Abfälle, gegebenenfalls nach entsprechender Aufbereitung.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Produktion von Propionsäure mit Lactose als C- und Energiequelle eignen sich insbesondere käufliche Stämme der Gattung Propioni bacterium, so zum Beispiel:

- Propionibacterium acidi-propionici, DSM 20270, 20273
- Propionibacterium freudenreichii shermanii, ATCC 9616, 9615, 13763, 8262

Als Wachstums- und Produktionsmedium kann jedes Medium, das dem herkömmlichen Stand der Technik entspricht, ein gesetzt werden. Als Fermentationstemperatur wird die für den jeweiligen Organismus günstigste Wachstumstemperatur gewählt.

Es wurde die Abhängigkeit des Produktspektrums von Pro pionibacterium freudenreichii shermanii vom Redoxpotential untersucht.

Propionibacterium sp. vergären Zucker zu Acetat, Propionat und CO₂. Dabei werden Acetat und Propionat in einem Ver hältnis von 1 : 2 gebildet.

Bei Versuchen mit Kobaltsepulchrat als Mediator und mit geregeltem Redoxpotential von -420 m V zeigt sich, daß ab einer Netzoberfläche der Arbeitselektrode von 300 cm² und einer Mediatorkonzentration von 0,4 mM das Redoxpotential während der Fermentation so negativ gehalten werden kann, daß mehr als 90% des Kobaltsepulchrats in reduzierter Form vorliegen. Unter diesen Bedingungen werden Elektronen von den Zellen aufgenommen, so daß der reduktive Gärzweig vermehrt abläuft. Propionsäure und Essigsäure werden in einem Verhältnis von 12 : 1 gebildet, das entspricht einem Propionsäureanteil von 93%.

Dagegen bewirkt eine Erhöhung der Zahl der Gegenelektroden ohne gleichzeitige Vergrößerung der Arbeitselektrodenober fläche keine wesentliche Verschiebung der Gärbilanz.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von Propionsäure mit Propionibacterium Freudenreichii shermanii ATCC 9616

Für alle Versuche mit geregeltem Redoxpotential wurde ein 1-l-Glasfermenter aus Normteilen verwendet.
Zusammensetzung des Vorkultur- und Fermentationsmediums:

Destilliertes Wasser
ad 1000 ml
Trypton	10 g
Hefeextrakt	5 g
CaCl₂×2 H₂O	0,02 g
MgSO₄×7 H₂O	0,02 g
NaCl	3 g/l
K₂HPO₄	8,71 g
NaHCO₃	1 g

Der pH-Wert wurde mit 4 N HCl auf pH 6,8 eingestellt. Nach dem Autoklavieren wurde das Medium unter N₂-Begasung abge kühlt. Dann wurde Lactose als C-Quelle (3 g/l) und Kobalt sepulchrat als Redoxmediator (0,5 mM) steril zugegeben. Als Sollpotential wurden -420 mV vorgegeben. Nachdem im Medium ein konstantes Potential erreicht worden war, wurde angeimpft. Hierzu wurden 50 ml einer Vorkultur, die sich in der exponentiellen Wachstumsphase befand, abzentrifugiert (Here aus Christ Zentrifuge, 5000 rpm, 15 min) und in 10 ml steriler Saline mit einer Spritze aufgenommen. Diese 10 ml Inokulum wurden durch ein Septum in das Medium gegeben. Die Zell konzentration im Laborfermenter betrug am Beginn der Fer mentation 0,05 g/l BTM (Biotrockenmasse). Alle Fermenta tionen mit 1 l Arbeitsvolumen wurden bei 30°C unter N₂- Atmosphäre durchgeführt, der pH-Wert wurde mit 4N NaOH und 4N HCl bei pH 7 konstant gehalten.

Die Potentialregelung erfolgte über eine Arbeitselektrode, die aus einem Platinnetz (10×10 cm Seitenlänge, 3600 Ma schen/cm², 0,04 mm Drahtdurchmesser) bestand und einer Gegenelektrode aus Platindraht (0,5 mM Durchmesser, 20 cm Länge). Der Gegenelektrodenbereich war durch eine Glasfritte vom Arbeitselektrodenbereich abgetrennt und mit 20 ml Me dium gefüllt. Arbeits- und Gegenelektrode wurden vor dem Einbau in den Fermenter durch Ausglühen über einer Bunsen brennerflamme gereinigt und aktiviert. Als Referenzelektrode diente eine Ag/AgCl-Bezugselektrode (Ingold, +207 m V Span nung gegen H₂-Elektrode bei 25°C). Alle Elektroden waren an einen Potentiostaten (Bank Elektronik, STP 84) angeschlossen.

Während des Wachstums der Bakterien wurde in regelmäßigen Abständen über ein Septum steril 2 ml Kulturbrühe ent nommen. Es wurde die optische Dichte bei 578 nm im Photo meter bestimmt und aus einer Eichkurve die entsprechende Biotrockenmasse errechnet. Die Lactose-Abnahme wurde über einen enzymatischen Test bestimmt. Die Produktion von Acetat und Propionat wurde im Gaschroma tographen verfolgt (Methode nach Dehning, I., Schink, B., Arch. Microbio. 151: 427-433, 1989).

Beim Wachstum mit 3 g/l Lactose als C- und Energiequelle erreichte der Stamm Propionibacterium freundenreichii shermanii ATCC 9616 eine optische Dichte von 3,5, was einer Biotrockenmasse von 1,5 g/l entsprach. Dabei wurde die Lactose vollständig innerhalb von 120 h zu Acetat und Pro pionat umgesetzt, wobei die beiden Fettsäuren in einem Verhältnis von Acetat : Propionat von 1 : 12 gebildet wurden, wenn die Arbeitselektrodenfläche 300 cm² betrug. Beim Einsatz kleinerer Elektrodenflächen war das Verhältnis Acetat - Propionat größer, da nicht genügend Mediator in reduziertem Zustand gehalten werden konnte, was sich in einem Anstieg des Redoxpotentials während des Wachstums in den Zellen zeigt. Die Zahl der Gegenelektroden dagegen hatte keinen Einfluß auf die Verschiebung der Gärbilanz.

In den Fig. 2 und 3 ist der Verlauf der optischen Dichte des in der Kulturbrühe gemessenen Redoxpotentials und der Produktion von Acetat und Propionat dargestellt.

In der Fig. 2 ist die optische Dichte bei 578 nm und Ver lauf des Potentials während des Wachstums mit 3 g/l Lactose dargestellt. Das Sollpotential war -420 mV. Es wurden drei Arbeits- und drei Gegenelektroden eingesetzt bei einer Mediatorkonzentration von 0,5 mM.

In der Fig. 3 ist die Bildung von Acetat und Propionat beim Wachstum mit 3 g/l Lactose dargestellt. Es wurden drei Arbeits- und drei Gegenelektroden verwendet, die Mediatorkonzentration betrug 0,5 mM.

Beispiel 2 Beeinflussung der Gärbilanz in Richtung der oxidierten Gärendprodukte: Bildung von Essigsäure durch Propioni bacterium freundenreichii

Zusammensetzung des Wachstums- und Fermentationsmediums und der verwendeten Zusatzlösungen:

Das Carbonat-gepufferte Mineralsalzmedium enthielt (An gaben pro Liter Medium): 0,2 g KH₂PO₄, 0,25 g NH₄Cl, 3,0 g NaCl, 0,4 g MgCl₂×6 H₂O, 0,5 g KCl und 0,15 g CaCl₂×2 H₂O und 0,07 g Na₂SO₄ (modifiziert nach Widdel und Pfennig 1981). Die Mineralsalze wurden in der entsprechenden Menge bidestillierten Wassers gelöst und die Lösung in einem speziellen Mediumkolben (Widdel 1980) autoklaviert. Danach wurde das Medium unter einer N₂/CO₂ (90%/10%)- Gasatmosphäre (0,05 bar Überdruck) unter ständigem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt und folgende sterile Lösungen zugegeben (Angaben pro Liter Medium): 30 ml 1 M NaHCO₃- Lösung (in einer fest verschlossenen, dickwandigen Schraub deckelflasche unter CO₂-Gasatmosphäre autoklaviert), 1 ml Spurenelement-Lösung SL 10, 1 ml Selenit-Wolframat-Lösung, 0,5 ml 10fach konzentrierte 7-Vitamine-Lösung und 20 ml Hefeextrakt-Lösung [5% w/v; 5 g Hefeextrakt (Difco) in 100 ml Wasser gelöst und unter CO₂- Gasatmosphäre autoklaviert]. Der pH-Wert wurde mit 1 M HCl oder 0,5 M Na₂CO₃-Lösung auf 7,2-7,4 eingestellt.

Spurenelement-Lösung

Zur Herstellung der Spurenelementlösung SL 10 wurde zuerst 1,5 g FeCl₂×4 H₂O in 10 ml HCl (25%) gelöst und dann zusammen mit den folgenden Komponenten zu insgesamt 1 l Lösung autoklaviert (Angaben pro Liter Lösung): 70 mg ZnCl₂, 100 mg MnCl₂×4 H₂O, 190 mg CoCl₂×6 H₂O, 2,0 mg CuCl₂×2 H₂O, 24 mg NiCl₂×6 H₂O, 6,0 mg H₂BO₃ und bidest. H₂O (ad 1000 ml).

Selenit-Wolfram-Lösung

Die Selenit-Wolfram-Lösung enthielt die folgenden Kom ponenten (Angaben pro Liter Lösung): 500 mg NaOH, 3,0 mg Na₂SeO₃×5 H₂O, 4,0 mg Na₂WO₄ × 2 H₂O und bidest. H₂O (ad 1000 ml). Ebenso wie die Spurenelementlösung SL 10 konnte die Lösung durch Autoklavieren sterilisiert werden.

7-Vitamine-Lösung

Die 7-Vitamine-Lösung (10fach konzentriert) enthielt folgende wasserlösliche Vitamine (Angaben pro Liter Lösung): 100 mg Cyanocobalamin, 80 mg p-Aminobenzoesäure, 20 mg D(+)-Biotin, 200 mg Nicotinsäure, 100 mg Ca-D(+)- Pantothenat, 300 mg Pyridoxamin-Dihydrochlorid und 200 mg Thiamin-Dihydrochlorid. Mit bidest. H₂O zu 1000 ml auf gefüllt, wurde die Lösung sterilfiltriert und bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.

Zur Herstellung einer 0,5-M-Cystein · HCl-Lösung wurde die entsprechende Menge L-Cystein · HCl unter N₂-Begasung in bidestilliertem Wasser gelöst und in eine N₂-begaste 60-ml-Serumflasche sterilfiltriert.

Alle anderen Versuchsbedingungen waren gleich wie in Beispiel 1.

Ausgehend von einer Kultur (Anfangs-OD = ca. 0,3; anaerob vorgewachsen mit 10 mM Lactat), wurde das ein gesetzte Substrat vollständig abgebaut. Mit 5 mM Glycerin (500 µmol) waren Wachstum und Stromfluß strikt korreliert, wobei ein elektrischer Strom von bis zu 12 mA registriert wurde (Fig. 4). Große Mengen an Elektronen (6760 µmol e^- nach 22 h Inkubation) wurden dabei von den wachsenden Zellen zur Arbeitselektrode übertragen, während das Elektronenpotential des Mediums infolge der kontinuierli chen Mediator-Reoxidation nahezu konstant gehalten wurde (Fig. 4). Die Konzentration an oxidiertem Mediator blieb dabei ständig hoch genug, um das eingesetzte Glycerin vollständig abbauen zu können (Fig. 4). Doch obwohl der Glycerinabbau bereits nach 11 h beendet war und zu diesem Zeitpunkt auch der maximale Stromfluß registriert wurde, wuchsen die Bakterien in der Folgezeit mit einer geringeren Wachstumsrate weiter und der Stromfluß ging erst einige Stunden später deutlich zurück. Nach 22 h Inkubation wurde im Medium nur noch Acetat als einziges Gärprodukt gefunden; anscheinend war neben dem Glycerin auch das gesamte Pro pionat im Medium abgebaut worden.

Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit Lactat als Sub strat erzielt (Fig. 5). Lactat wurde innerhalb von 3 h vollständig abgebaut, wobei aufgrund der hohen Stoffwechsel aktivität der Zellen in diesem Zeitraum ein Stromfluß von ca. 11 mA registriert wurde. Nach diesen ersten 3 h wuchsen die Zellen anscheinend wiederum mit Propionat als Substrat weiter; ebenso wie bei den Versuchen mit Glycerin wurde nach 22 h Inkubation Acetat als einziges Gärprodukt im Medium wiedergefunden. Innerhalb von 22 Stunden wurden dabei insgesamt 6750 µmol Elektronen zur Arbeitselektrode über tragen.

Experimente mit Glycerin und Lactat als Substrate in Gegen wart geregelter Elektroden wurden auch bei einer Mediator- Konzentration von 1 mM Hexacyanoferrat(III) durchgeführt (Ergebnisse nicht dargestellt). Dabei wurden im Prinzip die gleichen Resultate erzielt wie mit 5 mM Hexacyano ferrat(III), doch konnte das Elektronenpotential des Mediums während des Zellwachstums nicht konstant gehalten werden und die Reoxidation von Hexacyanoferrat(III) wurde zum wachstumslimitierendem Schritt.

Claims

1. Verfahren zur gezielten Herstellung organischer Produkte unter Verwendung von anaeroben, fakultativ anaeroben, mikroaerophilen oder aerotoleranten Mikroorganismen mit verzweigtem Gärstoffwechsel durch biologischen Abbau organischer Substrate durch Beeinflussung der Gärung auf solche Weise, daß das jeweils stärker oxidierte oder stärker reduzierte Gärprodukt in einer Ausbeute über 90%, bezogen auf die Gesamtmenge der gebildeten Produkte, erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium ein Redoxmediator in Form einer Substanz, die keine oder geringe Toxizität aufweist, wasserlöslich ist, eine polare Struktur besitzt und in oxidierter und reduzierter Form stabil ist, zugesetzt und der Redoxmediator an einer potentialgesteuerten Arbeitselektrode zur Steuerung der Gärung in Richtung der gewünschten Produktbildung kontinuierlich regeneriert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Redoxmediator

1) zur Herstellung der jeweils stärker reduzierten Produkte wieder reduziert wird oder
2) zur Herstellung derjeweils stärker oxidierten Produkte wieder oxidiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Reduktion an die Arbeitselektrode ein Potential angelegt wird, das 10 bis 120 mV negativer ist als das Standard-Redoxpotential des Redoxmediators, bei pH 7 oder bei der Oxidation an die Arbeitselektrode ein Potential angelegt wird, das 10 bis 120 mV positiver ist als das Standard- Redoxpotential des Redoxmediators bei pH 7 (Eo'), wobei das Standard- Redoxpotential bei pH 7 des Redoxmediators definiert ist als Potentialdifferenz zwischen einer Halbzelle, in der das Oxidations- und Reduktionsmittel bei 25°C und pH 7,0 in jeweils 1,0 M Konzentration vorliegen und dem Normpotential der Wasserstoffelektrode (0 V bei 1 bar H₂, pH 0,0 und 25°C).

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Redoxmediator ein Viologenfarbstoff, ein Metallkomplex, ein Chinonfarbstoff, ein Triphenylmethanfarbstoff, ein Methinfarbstoff, ein Pyrrolfarbstoff, ein Pteridin, ein Flavin oder deren Gemische verwendet werden.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Regeneration des Redoxmediators durch Stromfluß zwischen einer Arbeits- und Gegenelektrode erfolgt.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Arten der Gattung Clostridium und Propionibacterium, Propionispira arboris, Megasphaera elsdenii, Bacteroides ruminicola, Bifidobacterium bifidus, Eubacterium limosum oder Citrobacter freundii verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Clostridium acetobutylicum, Clostridium butylicum, Clostridium butyricum, Clostridium propionicum, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii verwendet werden.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat Melasse, Molke, Molkepermeat, Malzextrakt, Lignocellulose-Hydrolysate, ein Polysaccharid, eine Hexose, eine Pentose, eine Textrose, ein Triose, ein Polyol, eine organische Säure, eine Aminosäure, ein Purin oder Pyrimidin verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat Glucose oder Lactose verwendet wird.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung von Butanol, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat Melasse, als Organismus Clostridium acetobutylicum verwendet wird und durch Einstellung des Redoxpotentials derart, daß der Redoxmediator in reduzierter Form vorliegt, vorwiegend Butanol als Produkt gebildet wird.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von Propionsäure, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat Molke oder Molkepermeat, als Organismus Propionibacterium freudenreichii, als Mediator Kobaltsepulchrat, das bei einem Arbeitselektrodenpotential von -420 mV in reduzierter Form vorliegt, verwendet wird, und vorwiegend Propionsäure als Produkt entsteht.