DE4016260A1

DE4016260A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung der biomasse und des stoffwechselzustandes von mikroorganismen

Info

Publication number: DE4016260A1
Application number: DE4016260A
Authority: DE
Inventors: Lorenz Dr Schild; Wolfram Dr Kunz; Eberhart Findeisen; Dietmar Eckert
Original assignee: LEIPZIG CHEMIEANLAGEN
Current assignee: MASCHINEN- UND ANLAGENBAU GRIMMA GMBH (MAG), O-724
Priority date: 1989-05-29
Filing date: 1990-05-19
Publication date: 1990-12-13
Also published as: DD300253A5

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Biomasse und des Stoffwechselzustandes von Mikroorganismen. Sie kann zur Führung biotechnologischer Prozesse angewendet werden. Insbesondere bietet die Erfindung die Möglich keit, mit der quantitativen Bestimmung der Biomasse und des Stoffwechselzustandes Steuerparameter für die Automatisierung von Fermentationsprozessen von Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen sowie anderer Zellen zu liefern.

Die in der Literatur beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Biomasse und des Stoffwechselzustandes von Bakterien und Hefen basieren auf der ausschließlichen Messung der Biofluoreszenz. Die dazu verwendeten Geräte sind Einkanalgeräte (z. B. EP 01 22 741). Diese Verfahren erlauben nicht, die Biomasse und den Stoff wechselzustand eindeutig zu bestimmen. In der Literatur vorge stellte Mehrkanalfluorimeter und -Photometer (GB 14 47 312, GB 14 82 096, US 38 85 879, DD-PS 2 17 887, DD-PS 2 16 323, DD 2 48 879) sind für einen Langzeitbetrieb ungeeignet, da sie Änderungen in der Empfindlichkeit der Geräte nicht berücksichtigen oder durch Verwendung von mehreren Lichtquellen ein höheres Ausfallrisiko besitzen. Andere faseroptische Mehrkanalverfahren nutzen mehrere Analysatorwellenlängen, aber gewährleisten entweder keine freie Wählbarkeit der Exitationswellenlängen oder sind durch die Viel zahl von Analysatoren schlecht handhabbar (EP 54 292).

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu entwickeln, mit deren Hilfe gleichzeitig die Biomasse und der Stoffwechselzustand von Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen u. a. Zellen eindeutig bestimmt werden kann, um auf der Basis von Reflexions- und Fluoreszenzlichtmessungen die Kultivierung bzw. Fermentation dieser Mikroorganismen zu beeinflussen und zu auto matisieren.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Licht von zwei Wellenlängen getrennt auf die Probe über den Teil des Lichtweges, über den auch das Reflexions- bzw. Fluoreszenzlicht geführt wird, geleitet und das von der Probe kommende Licht einer getrennten Wellenlängenselektion unterzogen und dem fotosen sitiven Teil zugeführt wird.

Dabei wird

a) Reflexionslicht und Fluoreszenzlicht von Mikroorganismen gleichzeitig über größere Zeiträume gemessen,
b) durch den Vergleich mit Meßwerten unter Standardbedingungen aus den Reflexionsdaten die Biomasse bestimmt,
c) durch den Vergleich mit Meßwerten unter Standardbedingungen aus den Fluoreszenzdaten und der Biomasse der Fluorochromge halt bestimmt,
d) durch den Vergleich mit Meßwerten unter Standardbedingungen aus den Fluoreszenzdaten und der Biomasse der Stoffwechselzu stand bestimmt.

Die Meßsignale werden entstört, indem der Quotient aus dem Meß signal und dem Meßsignal ohne Probe gebildet wird, wobei die In tensität der Lichtquelle, die Empfindlichkeit des optoelek trischen Wandlers und des Verstärkers berücksichtigt werden. Als Standardbedingungen zur Bestimmung der Biomasse werden Verdün nungsreihen benutzt. Zur Bestimmung des Fluorochromgehaltes werden ebenfalls Verdünnungsreihen bei definiertem Stoffwechsel zustand benutzt. Als Standardbedingungen für die Bestimmung des Stoffwechselzustandes wird ein Standardzüchtungsprozeß verwendet. Bei den Stimmungen des Fluorochromgehalts und des Stoffwechsel zustandes aus Fluoreszenzmeßwerten und Fluoreszenzwerten unter Standardbedingungen wird die Differenz dieser Werte unter Berück sichtigung der Biomasse verwendet. Alle Meßsignale werden mit tels Computer durch glatte Funktionen beschrieben.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Vor richtung verwendet, die aus einer Lichtquelle, einem Linsensy stem, einem Filtersystem, einer Maske, einer Lochscheibe, einem Schrittmotor, einem dreifach verzweigten Lichtleitkabel, einem Meßkopf, einem weiteren separaten Lichtleitkabel, einem weiteren Filter, einem Wandler, einem Verstärker und einem Mikroprozessor besteht. Die Trennung des Lichts erfolgt durch eine mechanische Chopperung. Bei der Anordnung der Vorrichtung werden nur eine Lichtquelle und ein optoelektrischer Wandler verwendet. Das Licht der Lichtquelle wird in zwei Teilstrahlen aufgeteilt, wobei die Wahl der Wellenlängen durch Filter erfolgt und die Teilstrahlen durch ein Linsensystem gebündelt werden. Eine Variation der In tensität beider Teilstrahlen wird durch Graufilter erreicht. Zur alternierenden Chopperung des Lichts beider Teilstrahlen wird eine sich drehende Lochscheibe verwendet. Nach der Chopperung wird das Licht beider Teilstrahlen zusammengeführt, wofür ein dreifach verzweigtes Lichtleitkabel verwendet wird. Die Verbin dung zwischen dem dreifach verzweigten Lichtleitkabel und der Probe wird durch ein Verbindungsstück realisiert, durch das so wohl das Anregungslicht als auch das von der Probe kommende Licht geleitet wird. Dieses Verbindungsstück ist hitzesteri lisierbar ausgeführt. Es besteht aus einem gefaßten Quarzkörper, wobei ein hitzbeständiger Silikonkleber verwendet wird. Das von der Probe kommende Reflexions- und Fluoreszenzlicht wird durch denselben Teil des dreifach verzweigten Lichtleitkabels über ein Kantenfilter dem optoelektrischen Wandler zugeführt. Außerdem wird Licht der Lichtquelle gepulst durch ein separates Lichtleit kabel dem optoelektrischen Wandler zugeführt. Die elektrischen Signale des optoelektrischen Wandlers werden elektronisch geglät tet. Nach der Verstärkung und Digitalisierung der elektrischen Signale des optoelektrischen Wandlers erfolgt eine Zuordnung der Signale und eine Datenbereitstellung mittels eines Mikroprozes sors.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel und einer Zeichnung, die eine schematische Darstellung der erfinder gemäßen Vorrichtung zeigt, näher erläutert.

Das von der Lichtquelle 1 emittierte Licht wird mittels eines Linsensystems 2 in zwei gebündelte Teilstrahlen aufgeteilt. Im Strahlengang beider Teilstrahlen befinden sich Filter 3 zur Se lektion von zwei gewünschten schmalen Wellenlängenbändern und zur Variation der Lichtintensität. Den Filtern 3 ist eine Maske 4 nachgeschaltet. Eine sich drehende Lochscheibe 5 gibt alternierend den Strahlengang für die Teilstrahlen frei. Diese Art der Strahlenführung erlaubt die Verwendung einer leichten, einfach herzustellenden Lochscheibe 5. Als Antrieb für die Lochscheibe 5 wird ein Schrittmotor 6 verwendet, der eine einfache Steuerung der Drehzahl mit einem Computer 7 gestattet. Durch Verwendung eines dreifach verzweigten Lichtleitkabels 8 werden nach Pas sieren der Lochscheibe 5 beide Teilstrahlen zusammengeführt. Das Lichtleitkabel 8 stellt eine flexible Verbindung zwischen Meß objekt und fester Strahlenführung dar. Auf diese Weise ist es möglich, beliebig orientierte Proben zu untersuchen. Die Ankopp lung des Lichtleitkabels 8 an die Probe 9 über einen Meßkopf 10, der ein gefaßter Glaskörper ist und in seiner Geometrie variiert bzw. ausgetauscht werden kann, erlaubt eine problemorientierte Strahlengeometrie in der Probe 9. Das von der Probe 9 kommende Licht gelangt durch den Meßkopf 10 und den dritten Strang des Lichtleitkabels 8 nach Passieren eines Kantenfilters 11 zum opto elektrischen Wandler, für den ein SEV 12 verwendet wird. Auf einem separaten, durch ein weiteres Lichtleitkabel 13 realisier ten Weg wird Licht der Lichtquelle 1, ebenfalls durch die Loch scheibe 5 gepulst, auf den SEV 12 geführt. Dieses Licht erzeugt ein Signal, das die Intensität der Lichtquelle 1, die Empfind lichkeit des SEV 12 und der Elektronik widerspiegelt. Darüber hin aus wird das Dunkelsignal gemessen. Dadurch ist eine Korrektur von Schwankungen in diesem Parameterfeld möglich und die Voraus setzung für einen stabilen Langzeitbetrieb gegeben. Die im SEV 12 erzeugten elektrischen Signale werden in einem Verstärker 14 ver stärkt und geglättet. Ein Mikroprozessor 7 wird zur Zuordnung der elektrischen Signale zu den optischen Kanälen, zur Korrektur der Meßsignale und zur Datenbereitstellung genutzt.

Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen

1 - Lichtquelle
2 - Linsensystem
3 - Filter
4 - Maske
5 - Lochscheibe
6 - Schrittmotor
7 - Computer/Mikroprozessor
8 - Lichtleitkabel
9 - Probe
10 - Meßkopf
11 - Kantenfilter
12 - Wandler/SEV
13 - Lichtleitkabel
14 - Verstärker

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Biomasse und des Stoffwechsel zustandes von Mikroorganismen mittels Fluoreszenz und Re flexion, dadurch gekennzeichnet, daß Licht von zwei Wellen längen getrennt auf die Probe über den Teil des Lichtweges, über den auch das Reflexions- und bzw. Fluoreszenzlicht ge führt wird, geleitet und das von der Probe kommende Licht einer getrennten Wellenlängenselektion unterzogen und dem fotosensitiven Teil zugeführt wird, wobei

a) Reflexionslicht und Fluoreszenzlicht von Mikroorganismen gleichzeitig über größere Zeiträume gemessen wird,
b) durch den Vergleich mit Meßwerten unter Standardbedin gungen aus den Reflexionsdaten die Biomasse bestimmt wird,
c) durch den Vergleich mit Meßwerten unter Standardbedin gungen aus den Fluoreszenzdaten und der Biomasse der Fluorochromgehalt bestimmt wird,
d) durch den Vergleich mit Meßwerten unter Standardbedin gungen aus den Fluoreszenzdaten und der Biomasse der Stoffwechselzustand bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für a) die Meßsignale entstört werden, dazu die Intensität der Lichtquelle und die Empfindlichkeit des optoelektrischen Wandlers und des Verstärkers berücksichtigt werden und der Quotient aus Meßsignal und Meßsignal ohne Probe gebildet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Standardbedingungen für b) Verdünnungsreihen und für c) Ver dünnungsreihen bei definiertem Stoffwechselzustand benutzt werden und für d) ein Standardzüchtungsprozeß verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für c) und d) die Differenz zwischen Meßsignal und Meßsignal unter Standardbedingungen bei der entsprechenden Biomasse benutzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Daten mittels Computer durch eine glatte Funktion repräsen tiert werden.

6. Vorrichtung zur Bestimmung der Biomasse und des Stoffwechsel zustandes von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Lichtquelle (1), einem Linsensystem (2), einem Filtersystem (3), einer Maske (4), einer Lochscheibe (5), einem Schrittmotor (6), einem dreifach verzweigten Lichtleit kabel (8), einem Meßkopf (10), einem weiteren separaten Licht leitkabel (13), einem Filter (11), einem Wandler (12), einem Verstärker (14) und einem Mikroprozessor (7) besteht, wobei das Licht der Lichtquelle (1) in zwei Teilstrahlen, die durch das Linsensystem (2) gebündelt werden, aufgeteilt wird; durch die Filter (3) die Wahl der Wellenlängen erfolgt und mittels Graufiltern die Intensität der beiden Teilstrahlen variiert wird; durch die mechanische Chopperung das Licht in Licht unterschiedlicher Wellenlängen getrennt und durch die sich drehende Lochscheibe (4) das Licht beider Teilstrahlen alter nierend gepulst wird; nach der Chopperung beide Teilstrahlen in dem Meßkopf (10), der über der Probe (9) angeordnet ist und durch den sowohl das Anregungslicht als auch das von der Probe (9) kommende Licht geleitet wird, zusammengeführt werden; das von der Probe (9) kommende Reflexions- und Fluoreszenzlicht über den Meßkopf (10) und einen Kantenfilter (11) dem opto elektrischen Wandler (12) zugeführt wird, dem gleichzeitig über das separate Lichtleitkabel (13) gepulstes Licht der Lichtquelle (1) zugeleitet wird; die elektrischen Signale des optoelektrischen Wandlers (12) elektronisch geglättet, an schließend verstärkt und digitalisiert werden und mittels des Mikroprozessors (7) die Signale zugeordnet und die Daten be reitgestellt werden.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßkopf (10) aus einem gefaßten Quarzkörper besteht und durch die Verwendung eines hitzebeständigen Silikonklebers hitze sterilisierbar ausgeführt ist.