DE3918533C2 - Verfahren zur Bestimmung von Gerinnungseigenschaften gerinnender Flüssigkeiten wie Blut oder Blutplasma - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Gerinnungseigenschaften gerinnender Flüssigkeiten wie Blut oder Blutplasma, bei dem die Flüssigkeit in einem Probengefäß durch einen relativ zu dem Probengefäß schwingenden Tauchkol­ ben in eine die natürliche Blutbewegung simulierende Fließbe­ wegung versetzt wird, wobei der Tauchkolben mit einer konstanten Frequenz angeregt und die Amplitude des schwingen­ den Tauchkolbens in Abhängigkeit von der Zeit gemessen wird.

Aus der DE 27 41 060 C2 ist ein Verfahren zur Erfassung der Zustandsänderung einer Flüssigkeit, insbesondere der Gerinnung von Blut, bekannt, bei dem ein elastisches, von der Flüssig­ keit beaufschlagtes Schwingsystem zu Schwingungen in der Nähe seiner Eigenfrequenz angeregt wird, wobei die Schwingungs­ anregung mit einer konstanten Anregungsfrequenz erfolgt, die während der Meßdauer zu wenigstens einem Zeitpunkt mit der sich unter dem Einfluß der Zustandsänderungen der Flüssigkeit ändernden Eigenfrequenz des Schwingungssystems gleich ist, und wobei die dabei auftretenden Schwingungsamplituden fortlaufend gemessen werden. Mit diesem als Resonanzthrombographie bekannten Verfahren können Aussagen über die Struktur eines Gerinnsels und insbesondere der Beginn der Änderung von elastischen Eigenschaften der Flüssigkeit relativ störungs­ sicher und klar erkennbar erfaßt werden. Über die Adhäsions­ neigung der Thrombozyten einer Blut- bzw. Blutplasmaprobe lassen sich aber weder mit der Resonanzthrombographie noch mit der aus dem DE-PS 8 45 720 bekannten Thrombelastographie verwertbare Aussagen gewinnen.

Bei dem aus der DE-PS 8 45 720 bekannten Gerät zur Bestimmung der Elastizität von gerinnenden Flüssigkeiten fand noch kein simulierter Fließvorgang statt. Die thrombelastographische Meßkurve wird im wesentlichen durch die Aktivität der Blutplättchen sowie durch Geschwindigkeit, Quantität und Qualität des Fibrinaufbaues bestimmt, wobei sich aber diese beiden Parameter der Gerinnung in der Kurve nicht primär voneinander trennen lassen. Es wird hierzu ergänzend auf die DE 20 19 341 C3 verwiesen.

In der EP 0 015 550 A1 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der visko-elastischen Eigenschaften von gerinnenden Flüssigkeiten wie Blut oder Blutplasma beschrieben. Dabei wird eine Blut- bzw. Blutplasmaprobe in einem Probengefäß durch einen schwingenden Körper zu Schwingungen angeregt und dessen Schwingungsamplitude in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Mit Einsetzen der Blutgerinnung ändert sich die Resonanz­ frequenz des durch den schwingenden Körper und seine elasti­ sche Lagerung gebildeten Schwingsystems, welches sich über die Blut- bzw. Blutplasmaprobe gegen die festen Wände des Probengefäßes abstützt. Dabei wird gemäß der Lehre der EP 0 015 550 A1 entweder der Bereich der möglichen Lage der Resonanzfrequenz periodisch in kurzen Zeitabständen mit der Anregungsfrequenz überfahren, oder es wird die Anregungs­ frequenz dauernd der Resonanzfrequenz des Schwingungssystems nachgestellt und somit stets in der Resonanzfrequenz gemessen. Auf diese Weise lassen sich zwar grundsätzlich auch die viskosen und elastischen Änderungen von Blut- bzw. Blutplasma­ proben erfassen und Rückschlüsse auf die Konsistenz des Blutes ziehen. Nachteilig ist jedoch, daß über die Adhäsionsneigung der Thrombozyten keinerlei Aussage gemacht werden kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, mit dem sich das Adhäsionsvermögen gerinnender Flüssigkeiten wie Blut oder Blutplasma bestimmen läßt.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.

Damit wird ein einfacher und schnell durchführbarer Test ermöglicht, der sehr einfach auszuwerten ist und eine hohe Aussagekraft bei diagnostischen und therapeutischen Problemstellungen aufweist. Insbesondere läßt sich das Adhäsionsvermögen einer gerinnenden Flüssigkeit bestimmen. Dies wird im wesentlichen deshalb ermöglicht, weil die während des Meßvorgangs mit der Flüssig­ keit in Kontakt kommende Oberfläche des verwendeten Probenge­ fäßes eine hohe Oberflächenspannung (hohe Oberflächenkon­ stante θ) aufweisen. Dadurch wird eine gleichmäßige und dichte Anlagerung der Thrombozyten gewährleistet.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich besonders vorteilhaft bei der Bestimmung der Gerinnungseigenschaften von Blut oder Blutplasma anwenden, wobei der Ablösevorgang des sich bildenden Gerinnsels von den Wandungen des Probengefäßes und des Tauchkolbens zur Bestimmung der Thrombozyten-Adhäsions­ neigung der Blut- bzw. Blutplasmaprobe erfaßt und ausgewertet wird. Dabei ist von besonderem Vorteil, daß die Bestimmungen an zuvor spontan abgesetztem und rekalzifiziertem Citrat­ plasma, d. h. ansonsten unbehandeltem Blut unter naturähnlichen Fließbedingungen durchgeführt werden können. Das Adhäsionsver­ mögen der Thrombozyten wird in der klinischen Routine bisher in verschiedenen, meist zeitaufwendigen Verfahren erfaßt, zum Beispiel durch Zählung von Thrombozyten, die an präparierten Oberflächen haften bleiben und dann im Kontrollverfahren mit normalen Thrombozyten verglichen werden.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens liegt die Anregungsfrequenz des Tauchkolbens zu Beginn des Meßvorgangs unterhalb der sich im Verlauf des Gerinnungsprozesses dynamisch ändernden Eigenfrequenz des Schwingsystems. Damit lassen sich Resonanzeffekte ausschalten und eine noch höhere Auflösung bei der Bestimmung der Adhäsionsneigung zu erzielen.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens weist auch der Teil des Tauchkolbens, der mit der Flüssigkeitsprobe in Kontakt kommt, eine hohe Oberflächenspannung auf, so daß sich auch hier eine flächendeckende Thrombozytenschicht anlagert. Dies läßt sich besonders einfach dadurch erreichen, daß die Oberflächen des Probengefäßes und/oder des Tauchkolbens aus Glas sind.

Somit können sowohl das Probengefäß, als auch wenigstens der mit der Flüssigkeit in Kontakt kommende Teil des Tauchkolbens aus Glas bestehen. Diese lassen sich einfach und damit auch kostengünstig herstellen.

Bei einer anderen Ausgestaltung des Verfahrens sind die Ober­ flächen aus einem hoch benetzbaren Kunststoff. Auch diese Geräteteile lassen sich einfach herstellen.

Das Verfahren wird in der Folge mit Hilfe der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 in schematischer Darstellung einen vertikalen Schnitt durch eine Vorrichtung, mit welcher das Verfahren durchgeführt werden kann;

Fig. 2 in schematischer Darstellung einen horizontalen Schnitt durch das Probengefäß zur Veranschaulichung der Orbitalbewegung des Tauchkolbens;

Fig. 3 den zeitlichen Verlauf der Schwingungsamplitude eines Tauchkolbens bei einer herkömmlichen Festig­ keitsmessung ohne Ablösungsvorgang und

Fig. 4 den zeitlichen Verlauf der Schwingungsamplitude des Tauchkolbens einschließlich ihres Wiederanstiegs durch Ablösung bei Anwendung des Verfahrens.

Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung besteht aus einem Probengefäß 1, in das ein an dem unteren Ende eines Pendels 2 angeordneter Tauchkolben 3 eintaucht. Das obere Ende des schwingenden Pendels 2 ist über eine Stahlfeder 4 elastisch mit einem Meßturm 5 verbunden ist. Der Tauchkolben 3 wird durch magnetische Kraft zu einer Orbitalbewegung angeregt (Fig. 2). Die Bewegung des Tauchkolbens in dem Probengefäß 1 führt zu einem Rühreffekt, der ein zirkuläres Fließen der eingefüllten gerinnenden Flüssigkeit bewirkt. Da der Tauch­ kolben 3 nicht rotiert, ergibt sich eine Bewegung, die für den Fall, daß die Flüssigkeit Blut oder Blutplasma ist, eine physiologische Fibrinanbindung zwischen Tauchkolben 3 und Probengefäß 1 zustandekommen läßt und somit die elastische Grundlage für die Messung bildet.

Das Probengefäß 1 ist als auswechselbare Testküvette ausge­ bildet und besteht aus Glas. Sie ist in einem Thermostaten 6 angeordnet. Zur Durchführung des Meßvorganges wird das Pro­ bengefäß 1 mit citriertem Blutplasma gefüllt und auf eine Temperatur von 37°C erwärmt. Anschließend wird vorgewärmtes Calciumchlorid zugegeben. Die sich dabei bildende gerinnende Flüssigkeitsprobe wird dann durch die in Fig. 2 dargestellte Orbitalbewegung des Tauchkolbens 3 in eine zirkuläre Fließbe­ wegung versetzt, die der Fließgeschwindigkeit in einer Koronararterie vergleichbar ist. Die Anregungsfrequenz des Tauchkolbens 3 ist dabei geringer, als die anfängliche Eigen­ frequenz des aus Stahlfeder 4, Tauchkolben 3 und Flüssig­ keitsprobe bestehenden Schwingsystems. Während des gesamten Meßvorgangs wird die Schwingungsamplitude des Tauchkolbens 3 durch eine nicht dargestellte Schwingungsmeßeinrichtung erfaßt.

Mit der beschriebenen Vorrichtung lassen sich Viskosi­ tätsmessungen durchführen. Dabei wird die konstante Antriebs­ frequenz des Schwingsystems unterhalb der Eigenfrequenz des Schwingsystems gewählt. Dadurch entgeht der Meßablauf der Viskosität den hierfür ungeeigneten Resonanzeffekten, da die elastischen Anteile des zu messenden viskoelastischen Sub­ strats mit der Erhöhung der Eigenfrequenz des Schwingsystems diese ausschließlich von der Antriebsfrequenz weiter nach oben abrücken lassen. Hierdurch wird erreicht, daß der Radius der Orbitalbewegung monophasisch und durch die elastischen Substratanteile im gleichen Sinne reduziert wird wie durch die viskösen Anteile. Es erfolgt also eine kombiniert gleich­ gerichtete Dämpfung, wie sie in dieser Form der Zuordnung allein durch die Orbitalbewegung möglich ist. Die hohe Empfindlichkeit dieser Meßmethode erlaubt alle üblichen Blut- und Plasmaviskositätsmessungen einschließlich der Erfassung des Aggregations- und Flexibilitätsverhaltens der Erythro­ zyten.

Mit der gleichen monophasischen Meßweise wie bei der Messung der Viskosität läßt sich auch die Zunahme der elastoviskösen Dämpfung bei der Gerinnung flüssigen Blutes oder Blutplasmas messen. Der in Fig. 3 dargestellte normale Verlauf eines Tendogramms (Festigkeitsmessung) zeigt eine methodisch bedingte sehr kurze Koagulationszeit, einen steilen Anstieg der elastoviskösen Dämpfung bis zu einem Maximum, das sich in einer Reduzierung des Orbitalradius äußert und damit die Kurve bis Nahe Null abfallen läßt, wo sie wegen der Festig­ keit des entstandenen Gerinnsels länger stabil bleibt. Das Gerinnsel haftet dabei an den sich gegeneinander bewegenden Oberflächen der Meßvorrichtung fest. Die Fig. 3 zeigt eine einphasige absteigende Kurve, die durch die Form des tief abgesunkenen Kurvenschenkels die Beendigung des strukturellen Gerinnselaufbaus über längere Zeit konstant wiedergibt.

Nachfolgend wird die Messung der Thrombozyten-Adhäsion, d. h. das Haftvermögen von Thrombozyten an Oberflächen (im Gegen­ satz zum Haftvermögen der Thrombozyten untereinander, der sog. Thrombozyten-Aggregation) näher beschrieben:
Bei dem in Fig. 3 gezeigten Verlauf der Schwingungsamplitude des Tauchkolbens 3 befindet sich die gerinnende Flüssigkeit in einem Probengefäß, dessen mit der Flüssigkeit in Kontakt kommenden Oberflächen nicht hoch benetzbar sind und bspw. aus V2A-Stahl bestehen. Im Zustand der elastoviskösen Dämpfung der geronnenen Blut- oder Blutplasmaprobe haften die Fibrinfasern der Blut- bzw. Blutplasmaprobe fest an den Oberflächen des Probengefäßes 1 und des Tauchkolbens 3 und bilden somit eine viskoelastische Feder zwischen Tauchkolben 3 und Probengefäß 1.

Werden nun alle im Normbereich primär wenig benetzbaren Ober­ flächen aus V2A-Stahl, die mit der gerinnenden Flüssigkeit in Kontakt stehen, gegen solche aus Glas ausgetauscht, zeigt das Tendogramm einen Fig. 4 ähnlichen Kurvenverlauf.

Die Kurve verläuft zunächst völlig analog zu dem in Fig. 3 gezeigten Festigkeitsdiagramm mit dem Steilabstieg gegen die Nullinie. Dieser Abstieg wird jedoch bei oder kurz vor Errei­ chen der maximalen Festigkeit des Gerinnsels in seinem glatten Verlauf abgebrochen und kehrt rasch in einen Wieder­ aufstieg um, dessen Steilheit etwa der des vorangegangenen Abstiegs entspricht. Der Aufstieg verläuft meist etwas un­ regelmäßig, weil es sich um einen von der Orbitalbewegung unterstützten totalen Abrißvorgang des Gerinnsels von der Glasoberfläche handelt, der die Kurvenlinie in etwa zur Ausgangslinie zurückführt. Zu diesem Abriß kommt es, weil die hoch benetzbaren Oberflächen einen derart starken Adhäsions­ reiz auf die in der Blut- oder Blutplasmaprobe befindlichen Thrombozyten ausüben. Dieser führt zu einer sehr eng ge­ packten Besetzung der Glasoberfläche mit Plättchen aus dem vorbeiströmenden Plasma. Die nachfolgend gebildeten Fibrin­ fasern des Gerinnsels haben primär eine Adhäsionstendenz zu Plättchen, so daß kaum direkte Verbindungen zur Glasober­ fläche stattfinden. Diese sind weitgehend von den Plättchen zugedeckt.

Sind keine funktionell intakten Plättchen vorhanden, um die Glasoberfläche abzudecken, so kommt es zu einem Direktkontakt der Fibrinfaser mit der Glasoberfläche. Bei der speziellen Struktur der Fibrinfaser zeigt nun dieser Direktkontakt eine außerordentlich hohe Haftfähigkeit, die um so mehr eine Ablösung des Fibringerinnsels verhindert, je weniger intakte Plättchen interponiert sind.

Mit dem Verlauf des Gerinnungsprozesses wächst die Spannung im Gerinnsel, und zwar zum einen durch die beginnende Re­ traktionsaktivität der im Gerinnsel postierten Plättchen, in erster Linie aber durch den Schereffekt der Orbitalbewegung auf die wachsende Strukturdichte und Festigkeit des Fibrins. Beides bedeutet eine ständig sich erhöhende Belastung des Haftvermögens der Gerinnseloberfläche. Bei der offenbar relativ weichen Haftmasse der Plättchen führt dies zur Trennung des Gerinnsels von der Oberfläche des Probengefäßes.

Diese Abreißvorgänge sind im Grunde schon bekannt, wurden jedoch bisher mehr als Störfaktoren bewertet. Das Verfahren nutzt dieses an sich bekannte Phänomen aus, um gezielte Aussagen über die Adhäsionsneigung der Thrombozyten treffen zu können. Der Zeitpunkt des Gerinnsel­ abrisses von der hoch benetzbaren Oberfläche ist ein Maß für die Adhäsionskraft der Thrombozyten der Blut- oder Blutplas­ maprobe. Eine Verringerung der Thrombozytenzahl verlängert quantitativ die Haftdauer des Gerinnsels. Ebenso führen auch pathologische Veränderungen der Thrombozyten bei normaler Zahl zu pathologischen Verlängerungen der Haftdauer. Der Zeitpunkt der Gerinnselablösung und deren Intensität, die sich an der Steilheit des Wiederanstiegs der Schwingungs­ amplitude des Tauchkolbens ablesen läßt, geben summarisch die Adhäsionsneigung der im Gerinnungssubstrat enthaltenen Thrombozyten wieder. Die Art der Registrierung erlaubt eine quantitative Definition des Vorganges, während ihre zeitliche Abhängigkeit eine Differenzierung zwischen Gerinnungsaktivi­ tät und Adhäsionsintensität ermöglichen kann. Sie teilt sich noch einmal in ihrer Logik dadurch auf, daß einerseits eine Konkurrenz besteht zwischen einer hohen Haftneigung und niedrigerer Haftfestigkeit der Thrombozyten und andererseits eine geringere Haftneigung verbunden ist mit einer sehr hohen Haftfestigkeit der Fibrinfasern.

Claims (8)

1. Verfahren zur Bestimmung von Gerinnungseigenschaften gerinnender Flüssigkeiten wie Blut oder Blutplasma, bei dem die Flüssigkeit in einem Probengefäß durch einen relativ zu dem Probengefäß schwingenden Tauchkolben in eine die natürli­ che Blutbewegung simulierende Fließbewegung versetzt wird, wobei der Tauchkolben mit einer konstanten Frequenz angeregt und die Amplitude des schwingenden Tauchkolbens in Abhängig­ keit von der Zeit gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein Probengefäß verwendet wird, dessen während des Meßvor­ ganges mit der Flüssigkeitsprobe in Kontakt kommenden Ober­ flächen eine hohe Oberflächenspannung (hohe Oberflächenkon­ stante θ) aufweisen, und daß der Ablösevorgang des sich bildenden Gerinnsels von den Wandungen des Probengefäßes und des Tauchkolbens zur Bestimmung der Adhäsionsneigung der Flüssigkeit erfaßt und ausgewertet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ablösevorgang des sich bildenden Gerinnsels von den Wandungen des Probengefäßes und des Tauchkolbens zur Be­ stimmung der Thrombozyten-Adhäsionsneigung einer Blut- oder Blutplasmaprobe erfaßt und ausgewertet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsfrequenz des Tauchkolbens zu Beginn des Meßvorganges unterhalb der sich im Verlaufe des Gerinnungs­ prozesses dynamisch ändernden Eigenfrequenz des Schwingungs­ systems liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tauchkolben verwendet wird, dessen mit der Flüssigkeits­ probe in Kontakt kommender Teil eine hohe Oberflächenspannung (hohe Oberflächenkonstante θ) aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Probengefäß und/oder ein Tauchkolben verwendet werden, deren Oberflächen aus Glas bestehen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Probengefäß verwendet wird, das aus Glas besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tauchkolben verwendet wird, dessen mit der Flüssigkeits­ probe in Kontakt kommender Teil aus Glas besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein Probengefäß und/oder ein Tauchkolben verwendet werden, deren Oberflächen aus einem hoch benetzbaren Kunststoff bestehen.