DE2549231A1

DE2549231A1 - Verfahren und vorrichtung zum reproduzierbaren messen der koagulationsrate

Info

Publication number: DE2549231A1
Application number: DE19752549231
Authority: DE
Inventors: Rudolph H Moyer; Donald J Sibbett
Original assignee: Geomet Inc
Current assignee: Geomet Inc
Priority date: 1975-10-28
Filing date: 1975-11-03
Publication date: 1977-05-12
Also published as: FR2330008A1; GB1529195A; FR2330008B1

Description

Patentanwalt

Dipl.-in»· E- ^Eder
DipLlns-K. Cci.ieschke

8München40,Bisabethstraße34

Geomet Incorporated, Roekville,
Maryland/USA

Verfahren und Vorrichtung zum reproduzierbaren Messen der Koagulationsrate

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vorrichtungen zur schnellen Ermittlung von Koagulationsraten. In der
nachfolgenden Beschreibung wird die Erfindung bei Anwendung zur Ermittlung oder Abschätzung der Fähigkeit zur Klümpchenbildung von kleinen Blut- oder Plasmaproben auf der Basis von Messungen beispielsweise der Prothrombinzeit, der
teilweisen Thromboplastinzeit oder ähnlicher Tests beschrieben.

Hierzu wird zunächst das natürliche Phänomen der Blutgerinnung oder -koagulation diskutiert. Das Phänomen ist komplex und schließt eine Folge enzymatischer und physikalischer

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Wechselwirkungen ein, die das Fluid Blut in eine klebrige Masse verwandeln. Die Hauptvorgänge beziehen sich auf die Umwandlung des Proenzyms Prothrombin in das Enzym Thrombin und auf die Wirkung von Thrombin auf Fibrinogen zur Bildung von Fibrin. Das Fibrin scheidet sich in langen Fasern oder Fäden ab, die stark klebrig sind. Die klebrigen Fäden haften aneinander, an Blutkörperchen, an Geweben und an fremden Stoffen und bilden ein dreidimensionales Netz oder Klümpchen. Die Klebrigkeit bewirkt, daß das zu Klümpchen umgeformte Blut aneinanderheftet und zur Verhinderung von Blutungen an verletzten Geweben klebt. Der gesamte Ablauf der Klümpchenbildung läßt sich wie folgt schematisch darstellen:

Leber

Begünstigt durch Vitamin K, verhindert durch orale Antikoagulanzien

Prothrombin

Aktiviert durch Ca und thromboplastische Substanzen

Fibrinogen_

Thrombin ->Fibrin (Klümpchen)

Normalerweise bildet Blut im vaskularen System keine Klümpchen, da Thrombin in der inaktiven Form, Prothrombin, vorhanden ist, das zu Thrombin aktiviert wird, wenn Blut infolge einer Verletzung austritt oder aus Blutgefäßen

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entnommen wird. Die Prothrombinaktivierung erfolgt durch Substanzen, die man als Thromboplastin bezeichnet und die in Blutplättchen und in verschiedenen Geweben, insbesondere in der Lunge und im Gehirn vorkommen. Bei gewissen Krankheiten kann es zu einer teilweisen Prothrombinaktivierung in den Blutgefäßen kommen, die zu einem thromboembolischen Zustand führt. Der Zustand ist gefährlich bei Krankheiten, wie etwa myokardialen Infarkten, bei rheumatischen Herzleiden, bei cerebrovaskularen Leiden, bei venöser Thrombose und Lungenembolie, wobei zur Behandlung verschiedene Antikoagulanzien eingesetzt werden, die die Bildung intravaskularer Thromben verhindern und die normale Hämostase aufrechterhalten.

Die Verabreichung der Antikoagulanzien als Teil der Behandlung dieser Leiden erfolgt weitgehend empirisch und die Dosierung regelt sich so lange auf einer täglichen Basis, bis das Ansprechen des einzelnen Patienten auf das Antikoagulang gewährleistet ist. Auch nach der Eegulierung der Dosierung für eine Langzeitbehandlung wird das Ansprechen des Patienten gewöhnlich alle zwei oder vier Wochen überprüft.

Die älteste und am weitesten verbreitete Methode zur Überwachung des Ansprechens des Patienten auf die Antikoagulanztherapie ist die von Quick vorgeschlagene Einstufen-Prothrombinzeit oder eine Adaption dieser Grundmethode. Bei der Messung der Einstufen-Prothrombinzeit wird das Blut in Natriumeitrat oder -oxalat gesammelt, die Calcium chelatieren. und eine Prothrombinaktivierung vor Beginn der Messung verhindern. Das Blut wird zentrifugiert und eine Plasmaaliquote mit einem Überschuß an thromboplastischem Extrakt aus Gehirn- oder Lungengewebe gemischt, das ausreichend Calcium enthält, um den Einfluß des chelatierenden Mittels überwinden zu können. Das Mischen erfolgt schnell unter kontrollierten Bedingungen. Die für die Anfangsklümpchen-

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bildung erforderliche Zeit ist als Prothrombinzeit definiert. Die Klümpclienb ildung kann visuell beobachtet oder durch im Handel erhältliche, mechanische Einrichtungen gemessen werden. Wenn die Messung bei 57°C durchgeführt wird, hat normales Plasma vom Menschen in der Regel eine Prothrombinzeit von 12 Sekunden, wobei die orale Antikoagulanztherapie normalerweise so reguliert wird, daß man Prothrombinzeit en von ca. 25 Sekunden erhält.

Bei der üblichen Klinikpraxis erfolgt die Messung der Prothrombinzeit an Blutproben, die dem Patienten entnommen und dann zur Analyse in ein Labor gebracht werden. Diese Messungen sind zwar relativ einfach auszuführen und erfordern keine komplizierten oder aufwendigen Reagenzien, aber sie müssen dennoch von speziell ausgebildetem Personal ausgeführt werden, wozu Einwegausrüstungen und Laboreinrichtungen benötigt werden. Infolge der Laboranalyse tritt eine erhebliche Zeitverzögerung zwischen dem Zeitpunkt der Entnahme der Blutprobe und dem Zeitpunkt ein, an dem das Analyseresultat zur Einleitung der Therapie zur Verfügung steht. In der Regel ist die Verzögerung nicht kritisch, wenn sie auch für Patienten und verordnenden Arzt unbequem ist. Über eine längere Zeit verteilte und wiederholte Venenpunktureη sind erforderlich, damit die zur Überwachung der Antikoagulanztherapie für jeden Patienten erforderlichen Blutproben entnommen werden können, nachdem eine Diät festgelegt ist. Bei älteren Patienten z. B. können diese Venenpunkturen Schwierigkeiten bereiten und für den Patienten ein gewisses Trauma bilden.

Hier sind Verfahren und Vorrichtungen von Vorteil, die sich zur schnellen Messung der Prothrombinzeit an einem Tropfen ungeronnenen Blutes eignen, das dem Patienten aus einer Fingerpunktur entnommen wurde. Man kann dabei mit einer Einrichtung arbeiten, die sämtliche Reagenzien und Gerate

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enthält, die zur Messung der Prothrombinzeit erforderlich sind. Gegenüber dem bekannten Stand der Technik würde dadurch ein wesentlicher Fortschritt erzielt.

Bekannt ist die Messung der Prothrombinzeit in kleinen Gefäßen, wie etwa Teströhrchen oder -zellen, in die eine Plasmaprobe zusammen mit Reagenzien eingebracht ist, wie etwa eines der verschiedenen, im Handel erhältlichen Thromboplastinreagenzien, falls erforderlich mit zusätzlichem Calcium. Die Zeit vom Mischen der Reagenzien und der Probe bis zur Klümpchenbildung läßt sich visuell überwachen, durch optische Instrumente, die Durchlässigkeitsänderungen der Probe erfassen, durch Fibrometer, die das Zusammenkleben der Klümpchen zu Fasern oder Fäden erfassen, durch Messung der Leitfähigkeitsänderungen und durch verschiedene Messungen der ViskositätsSteigerungen. Die anfängliche Einstufen-Prothrombinzeit wurde von Quick entwikkelt, demonstriert und verbreitet. Dieser Test spricht an auf die Blutfaktoren V (den aktiven Faktor oder Proakzelerin), VII (Prokonvertin) und X (Stuart-Prower' Faktor) sowie auf Prothrombin (Faktor II). Bei der Ermittlung der Prothrombinzeit nach der Methode von Quick wird vorausgesetzt, daß die Faktoren mit Ausnahme von Prothrombin im Überschuß vorhanden sind. Die Faktoren VII und X können jedoch während der Antikoagulanztherapie zurückgehen.

Zur Messung der Koagulationsrate hat man schon verschiedene Methoden angewandt. Beispielsweise hat man mit einem Kapillarviskometer die Zuckermenge gemessen, die zur Herstellung von Gelee aus Fruchtsäften erforderlich ist. Es wird zwar ein Kapillarröhrchen verwendet, das jedoch den Fluß regulieren soll. Ein solches Viskosimeter setzt eine logarithmische Abhängigkeit der Strömung vom Zuckergehalt oder der relativen Viskosität von der Kapillarlänge voraus. Bei Viskos it ätsmessunge η ist eine solche Abhängigkeit normal. Bei

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einer Einrichtung zur Messung der Koagulationszeit von Blutproben wird das Blut mit zugesetzten Reagenzien gemischt und dann mittels Luftdruck durch eine Kapillare hin und her gepumpt. Die Zeit, zu der die Strömung durch die Kapillare so behindert ist, daß das weitere Pumpen nicht ohne eine Druckerhöhung ausgeführt werden kann, ist die gemessene Koagulations- oder Gerinnungszeit. Man arbeitet hierbei mit einer relativ großen Blutmenge, in der Regel 20 ml.

Die Reproduzierbarkeit der mit diesen Einrichtungen erzielten Resultate hängt ab von der Erfassung der Druckänderungsamplituden bei jedem Hub zur Ermittlung der Koagulationszeit. Eine Kapillarverbindung zwischen den Reagenzien und der Blutprobe verstärkt die Wirkung der Koagulation. Diese komplizierte Einrichtung erfordert Pumpen, Druckmesser usw.

Bei einem anderen bekannten Gerät muß eine hypo d.ermische Nadel in eine Vene eingeführt werden, worauf die Blutströmung in ein flexibles Plastikröhrchen so lange gemessen wird, bis Klümpchenbildung auftritt. Das aufgefangene Volumen wird in Abhängigkeit von der Zeit gemessen, bis die Thrombose beendet ist. Die gemessene Zeit und das Volumen werden als Maß für die Neigung des Patienten zu Thrombose angesehen. Der Durchmesser des glatten Meßröhrchens betrug 0,5 bis 1,0 mm. Diese Messung erfolgt ohne Zusatz von ehe-, mischen Reagenzien und liefert die Klümpchenbildungszeit des Blutes, jedoch nicht die durch Prothrombin und die zugehörigen Blutfaktoren begrenzte Reaktion.

Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zum reproduzierbaren Messen der Koagulationsrate eines Fluids, dessen Viskosität sich nach Kombination mit mindestens einem zur Veränderung der Probenviskosität geeigneten Reagenz erhöht,

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wobei die Probe in ein langgestrecktes Röhrchen eingebracht wird. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Einfluß der Probenviskosität durch Verwendung eines Röhrchens mit ausreichend großem Innendurchmesser ausgeschaltet wird, daß das Fluid mindestens mit einem der Reagenzien kombiniert wird, daß das Röhrchen praktisch senkrecht gehalten wird, so daß die Probe im Röhrchen unter der Wirkung der Schwerkraft kontrolliert absinkt, und daß die Zeit gemessen wird, die zur effektiven Viskositätssteigerung zur Immobilisierung der Probe benötigt wird, nachdem sie sich im Röhrchen nach unten bewegt hat.

Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens, bei der die Koagulationsraten einer Fluidprobe nach der Kombination mit mindestens einem Reagenz ermittelt wird, das bei Kombination mit der Probe in einem langgestreckten Reaktionsröhrchen zur Viskositätssteigerung der Probe führt. Diese Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsröhreheη einen derart großen Innendurchmesser aufweist, daß anfängliche Viskositätseinflüsse der Fluidprobe praktisch eliminiert werden, daß das Röhrchen das Reagenz in der Nähe eines ersten, offenen Röhrchenendes enthält und daß das Röhrchen unterhalb dieses ersten Endes zur reproduzierbaren Messung der Zeit für die Koagulation der Fluidprobe nach Kontakt mit dem Reagenz in direkter Abhängigkeit des Abstandes geeicht ist, um den die in dieses Röhrchenende eingebrachte Fluidprobe im Reaktionsröhrchen bis zu einer Immobilisationsposition absinkt.

Die ausführliche Erläuterung der Erfindung erfolgt unter Bezugnahme auf die in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiele. Darin zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung gemäß der Erfindung zur Ermittlung der

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Koagulationsrate,

Fig. 2 eine Ausführungsform der Vorrichtung nach Fig. 1 mit einer Zoneneinteilung, d. h. mit einer farbigen Kennzeichnung, und

Fig. 3 die Eichdaten einer typischen Vorrichtung gemäß Fig. 1.

Das erfindungsgemäße Verfahren arbeitet mit einem Reaktionsröhrchen oder einem Zylinder, in dem sich speziell präparierte und positionierte Reagenzien befinden, die sich zur Reaktion mit Blut, Plasma oder anderen Fluids eignen. Dem Röhrchen wird oben eine kleine Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit zugeführt. Sie sinkt ab, löst die Reagenzien auf und kommt an einer Position zur Ruhe, die ihrer Reaktionsdauer zugeordnet ist. Die Position entlang der Röhrchenlänge, an der die verklumpte Flüssigkeitsprobe unbeweglich wird, ist ein Maß für die Schnelligkeit der Reaktion. Bei Verwendung geeigneter Reagenzien ist diese Position der Prothrombinzeit einer Blut- oder Plasmaprobe direkt zuzuordnen, iös hat sich gezeigt, daß ein linearer Zusammenhang besteht zwischen der Prothrombinzeit und der im Röhrchen nach unten zurückgelegten Strecke.

Zur effektiven und reproduzierbaren Funktion muß die Innenseite des Röhrchens oder Zylinders von der Probe gleichförmig zu benetzen sein. Bevor das Röhrchen benutzt wird, werden an einer bestimmten Position oder Stelle die chemischen Reagenzien eingesetzt, die aus Thromboplastinreagenzien und gewissen Zusätzen in geeigneter Menge bestehen, die die Prothrombxnreaktion herbeiführen, wenn sie in der flüssigen Probe aufgelöst werden. Diese Reagenzien sind an einer Position im Röhrchen unmittelbar unterhalb einer Eichmarke lyophilisiert, die das Probenvolumen angibt, das in das Röhrchen einzufüllen ist. Nach der Lyophilisierung wird das

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Röhrchen in einer flussigkeitsdichten Tasche verschlossen, aus der es erst zur Verwendung wieder entnommen wird.

Alternativ kann das Reagenz auch schon mit der Probe gemischt werden, bevor das Einfüllen in das Reaktionsröhrchen oder in den Zylinder erfolgt. Diese Methode bereitet jedoch Schwierigkeiten, da die Zeitspanne zwischen dem vorherigen Mischen und den Viskositatsmeßstufen wichtig werden kann.

Das Röhrchen soll eine annähernd gleichförmige Bohrung aufweisen. Die Blut- oder Plasmaprobe wird am oberen Ende des Röhrchens eingeführt. lÄ/enn das Röhrchen den richtigen Durchmesser hat, kann die Aufnahme der Probe dadurch erfolgen, daß man mit dem Pullende die Flüssigkeitsoberfläche berührt. Die Probe wird dann durch die Kapillarwirkung hereingezogen. Sie darf in dem umgekehrten Röhrchen so weit aufsteigen, bis der Miniskus eine geeichte Füllmarke erreicht. In diesem Moment wird das Röhrchen mit der Probe am oberen Ende senkrecht gestellt. Unter dem Einfluß der Schwerkraft sinkt das abgemessene Volumen des Proben- oder Flüssigkeitsabschnittes durch die lyophilisierten Reagenzien nach unten, die zur Reaktion benötigt werden. Nach Auflösung der Reagenzien sinkt der Flüssigkeitspfropf im Röhrchen oder Zylinder weiter ab, bis die Koagulation oder Gerinnung eintritt. Die Bewegungsstrecke von der Position des Bodens der lyophilisierten Reagenzien zum Boden des Koagulats dient als direktes Maß für die Reaktionsrate. Bei verschieden präparierten Röhrchen wurde dieser Abstand in Abhängigkeit von der Prothrombinzeit geeicht, die durch den standardisierten Einstufentest nach Quick bestimmt ist. Vergleiche hierzu: A. J. Quick: Amer. J. Med. Sc. 190, 501, (1956); Proc. Sc. Exper. Biol. and Med., 42, 788 (1939); Amer. J. Clin. Path., 15, 560 (194-5); Thromb. Diath. Haemorrh., 2, 226 (1958); Amer. J. Med. Sei., 246, 517 (1963). Die Kurve der Prothrombinzeit in Abhängigkeit von

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der im Röhrchen nach unten zurückgelegten Strecke ist eine einfache, lineare Funktion.

Im Prinzip kann der Zylinder so lang gemacht werden, als dies zur Verwendung unbeschränkter Strömungsraten des Flüssigkeitstropfens im Zylinder nach unten erforderlich ist. Aus Zweckmäßigkeitsgründen arbeitet man mit verschiedenen Methoden zur Beschränkung der Absinkrate. Beispielsweise hat man am unteren Zylinderende Drosselstellen oder Ausmündungen vorgesehen, die die Luftaustrittsrate aus dem Röhrchen unterhalb des flüssigen Probenstückes beschränken. Der Zylinder kann auch in einem Winkel gegenüber der Vertikalen gehalten werden, so daß das Probengewicht als Antriebskraft beim Absinken des Flüssigkeitspfropfens dient, wobei mit einem Faktor multipliziert wird, der gleich dem Cosinus des Winkels des Röhrchens gegenüber der Vertikalen ist. Ebenso läßt sich die Absinkrate durch einen inneren Wandbelag oder durch Vorsprünge an der Innenseite des Zylinders kontrollieren. In jedem Fall ist die endgültige Stopposition ein direktes Maß für die Prothrombinzeit der Pro be.

In der normalen klinischen Praxis werden die Prothrombinzeiten nach der Methode von Quick bei 37°C ermittelt. Es hat sich gezeigt, daß man die Prothrombinabstände mit dem Reaktionsröhrchen ohne weiteres bei Zimmertemperatur ermitteln kann, vorausgesetzt, es wird eine Eichkurve zur Zuordnung der beiden Datensätze aufgenommen (d. h* der Standardprothrombinzeiten bei 37°G und der Reaktionsröhrchen-Prothrombinzeiten bei Umgebungstemperaturen von 22 bis 23°C).

Zur reproduzierbaren Funktion der erfindungsgemäßen Prothrombinreaktionsröhrchen müssen die physikalischen und chemischen Parameter sorgfältig ermittelt werden, die die Reaktionsrate und die Bewegungsrate der Flüssigkeit in den

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Röhrchen steuern. Diese Parameter sind: a) der Innendurchmesser des Röhrchens und seine Schwankungen, b) die Reinheit und Gleichförmigkeit der Röhrcheninnenfläche, c) das Probenvolumen, d) die Zusammensetzung und Position des Reagenz, e) die Rate der Reagenzlöslichkeit und/oder der Reagenzdichte und Porosität im Röhrchen, f) die absolute Menge der Reagenzien, g) die Reaktioüstemperatur und h) die Rate des Luftaustrittes aus dem Volumen unter dem Probenstück oder unter Berücksichtigung des Winkels gegenüber der Vertikalen, in dem sich das Röhrchen befindet. Diese Parameter sind möglichst eng zu spezifizieren.

Der wichtigste Parameter ist der zu wählende Innendurchmesser eines Reaktionsröhrchens, der groß genug sein muß, damit die nicht-koagulierte Flüssigkeitsprobe nach unten strömen kann, unter der Einwirkung der Schwerkraft, nachdem die flüssige Probe und die Reagenzien zunächst einmal kombiniert sind. Dieser Durchmesser wird ebenfalls so gewählt, daß nach dem Koagulieren der Flüssigkeitsprobe und nachdem die Probe unbeweglich geworden ist, ein ausreichendes Stück der Rohrlänge passiert wurde. Bei dem erläuterten Ausführungsbeispiel wurde zur Ermittlung der Prothrombinzeit von Blut oder Plasma vorzugsweise ein Röhrchen mit 1,8 mm Durchmesser verwendet.

Bei der Durchführung des Tests ist darauf zu achten, daß die Einflüsse der Blutviskosität gering sind. Durch dieses Verfahren kann man Messungen der Prothrombinzeit zur Erzielung definitiver Resultate in ca. 2 Minuten durchführen, so daß Verzögerungen entfallen und ohne daß Fachpersonal spezielle Laboreinrichtungen benötigt. Für jede Messung werden lediglich ein Tropfen nicht geronnenen Blutes aus dem Finger eines Patienten benötigt, so daß die lästigen Venenpunkturen der bekannten Verfahren entfallen können. Außerdem ist die Zeit beim Ablesen des Resultates nicht

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kritisch.. Der Test kann begonnen und das Eesultat beobachtet und aufgezeichnet werden, wie es der Benutzer wünscht. Die endgültige Position aes Re stilt ε. tt- bleibt fast unbegrenzt erhalten.

Gemäß Fig. 1 ist ein Glasröhrchen mit einer kleinen, gleichförmigen Bohrung mit 1,8 mm Innendurchmesser (± 2 %) und 18 cm Länge vorgesehen, das so geeicht ist, daß es an der angegebenen Füllinie mit 35/Ul Blut oder Plasma gefüllt ist. Die Röhrchenlänge ist in mm-Markierungen geeicht, die von der unteren Kante der Ablagerung des lyophilisierten Reagenz nach unten gehen. Der Abstand d ist das Maß für die Bewegung des reagierenden Probenflüssigkeitsstückes bis zum Immobilisationspunkt, der bei der Klümpchenbildung erreicht wird. Die Eichdaten nach. Fig. 3 gelten für ein Reaktionsröhrchen, bei dem zur Steuerung des Luftaustrittes eine Kapillare aus rostfreiem Stahl von 20 mai Länge und 0,15 sim Durchmesser verwendet wurde.

Bei den Versuchsbedingungen und bei 23°C entspricht 1 cm Bewegungsbahn des Klümpchens im Böhrchen nach unten 2,1 Sekunden Prothrombinzeit gemessen bei 37°C. Der Schwankungskoeffizient bei diesen Experimenten betrug ± 6 bis 8 %.

Derartige Eichungen wurden bei verschiedenen Temperaturen, Röhrchendurchmessern und -längen, Luftaustrittsraten und Probenvolumen vorgenommen. Bei den so gewonnenen, absoluten und numerischen Werten wurde der lineare Zusammenhang zwischen den Prothrombinzeiten, gemessen nach der klinischen Standardlabormethode und dem Reaktionsröhrchen gemäß der Erfindung, eingehalten. Gemäß dem Verfahren und der Vorrichtung nach der Erfindung können somit die Prothrombinzeit und partielle Prothrombinzeiten in einer Stufe gemessen werden.

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Einer der Hauptfaktoren für die Leistungsfähigkeit des Prothrombinreaktionsröhrchens ist die Optimierung des Thromboplastinreagenz hinsichtlich Reaktivität, mechanischer Stabilität und Lösungsrate. Es wurden eine Anzahl im Handel erhältlicher Thromboplastinpräparate getestet. Sie zeigen sämtlich adäquate Reaktionscharakteristika, wenn absolute Mengen so verwendet werden, daß bei Rekonstitution aus dem trockenen Zustand im Probenvolumen (d. h. 35/Ul nach obiger Darstellung) die vorgegebenen Konzentrationen eingehalten wurden. Dies entspricht einer Annäherung von 10 mg/ml für eine Reihe im Handel erhältlicher Präparate. Zur mechanischen Stabilisierung in der Tube des gefriergetrockneten Präparates wird jedoch Gelatine mit einer Konzentration von 10 mg/ml hinzugefügt. Ss wird eine derartige Porosität erreicht, daß eine schnelle Auflösung der Reagenzien in der Probe durch Hinzufügung eines fein verteilten Dehners erreicht wird. Zur Ermittlung der Daten nach Pig. 3 wurde im Präparat als Dehner· Gab—O—SiI, gerauchte Kieselsäure vom Grad H—5 bei einer Konzentration von 5 mg/ml verwendet.

Das Thromboplastin wurde in der Lösung bei den angegebenen Konzentrationen gebildet. Ein Anteil von 30/ul wurde mittels einer automatischen Mikropipette in ein sauberes, tiefgekühltes Reaktorröhrchen von -20°C an eine Position 2,2 cm unter dem oberen Röhrchenende eingebracht. Die Röhrchen wurden zu einem Lyophilisator transportiert, gefriergetrocknet, bei 5 % RH in trockene Behälter eingesetzt und verschlossen. Durch diese Prozedur bildete sich ein poröser Reagenzpfropfen mit einem Durchmesser von ca. 1 cm Höhe in jedem Röhrchen. Die Röhrchen wurden bis zur Benutzung bei Umgebungstemperatur aufbewahrt. Man erhält eine praktisch unbeschränkte Lagerfähigkeit.

Derartig präparierte Röhrchen lassen sich in Zonen eichen, die die Bedeutung der gewonnenen Resultate ausdrucken.

COPY

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Fig. 2 zeigt ein Röhrchen mit Farbkennzeichnung, das zur Routineüberprüfung der Wirkung einer Antikoagulanztherapie verwendbar ist. Eine kleine, normale Zone, die Prothrombinzeiten von 12 bis 14- Sekunden entspricht, wurde durch ein blaues Band gekennzeichnet. Eine grüne Zone gibt das gewünschte Ansprechen auf die Antokoagulanzdosierung an. Dieser Bereich entspricht der weiteren Unterdrückung der Prothrombinaktivitätsfunktion.

Die oben erläuterte Technik kann auch zur Messung anderer Klümpcheneigenschaften von Blut und Plasma verwendet werden, etwa der gesamten Prothrombinzeit, der Prothrombinverbrauchszeit, der Zweistufen-Prothrombinanalyse und der Analysen bzw. Proben von Faktoren V, VIII und IX. Darüber hinaus ist das Reaktionsröhrchen einsetzbar bei Reaktionen mit Mikroquantitäten sensitiver Reagenzien, bei denen eine feste Reaktionszeit zweckmäßig ist, bevor die Produkte aus Blut-, Plasma- oder Serumreaktionen spektrophotometrisch oder kolorimetrisch untersucht werden.

Außerdem gestatten geeignete Variationen in der Zusammensetzung der Reagenzien nach den konventionellen Methoden zur Durchführung der entsprechenden Analysen die Anwendung der beschriebenen Vorrichtung bei derartigen Messungen wie Polymerisationsreaktionen, Proben von proteolytischen Enzymen, bei Urokinaseaktivität, Fibrinogenpräparation und bei einzelnen Blutverklumpungsfaktoren ebenso wie bei anderen Messungen, die sich dem Fachmann hierzu anbieten.

Die Röhrchenabmessungen sind nicht auf die im Ausführungsbeispiel angegebenen Werte beschränkt. Die Abmessungen der Reaktionsröhrchen lassen sich so variieren, daß jede gewünschte Unterscheidung und Präzision bei den Daten erzielt wird. Die Röhrchenabmessungen zusammen mit der benutzten Strömungsrate lassen sich bequem an jede Anwendung anpassen,

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Claims

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£ß₁äi>4 Patentansprüche

1. Verfahren zum reproduzierbaren Messen der Koagulationsrate eines Fluids, dessen Viskosität sich nach Kombination mit mindestens einem zur Veränderung der Probenviskosität geeigneten Reagenz erhöht, wobei die Probe in ein langgestrecktes Röhrchen eingebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein Einfluß der Probenviskosität durch Verwendung eines Röhrchens mit ausreichend großem Innendurchmesser ausgeschaltet wird, daß das Fluid mit mindestens einem dieser Reagenzien kombiniert wird, daß das Röhrchen praktisch senkrecht gehalten wird, so daß die Probe im Röhrchen unter der Wirkung der Schwerkraft kontrolliert absinkt, und daß die Zeit gemessen wird, die zur effektiven Viskositätserhöhung zur Immobilisierung der Probe benötigt wird, nachdem sie sich im Röhrchen nach unten bewegt hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluidprobe in den Hohlzylinder injiziert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe zur Kombination mit dem Reagenz in den Hohlzylinder injiziert wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die injizierte, flüssige Probe an einer bestimmten Position in dem hohlen Röhrchen mit einem Reagenz kontaktiert wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluidprobe an bestimmten Positionen in den Hohlzylinder injiziert wird.

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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz während des Indizierens mit der flüssigen Probe vorvermischt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Messung die Bewegung der behandelten Probe so lange überwacht wird, bis praktisch ein Immobilisationszustand erreicht ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz lyophilisiert ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz lyophilisierte Reagenzien mit Thromboplastin und Calcium enthält und daß die Probe aus Blut oder Plasma besteht.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz Thromboplastinreagenzien und Zusätze in derartigen Mengen umfaßt, daß bei Auflösung in einer flüssigen Probe von Blut oder Plasma eine Prothrombinreaktion entsteht.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Reagenzien zur Veränderung der Viskosität der Probe nach dem Einbringen in den Zylinder enthält.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz ein lyophilisierter Pfropfen in der Nähe des Röhrchenendes ist.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz unmittelbar

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unterhalb einer Eichmarke positioniert ist, die das Probenvolumen angibt, die vorher in das Röhrchen injiziert wurde.

14-, Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Absinkrate der Probe durch Verwendung eines porösen Pfropfens aus festem Material kontrolliert ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Absinkrate der Probe durch eine Begrenzungsöffnung am entgegengesetzten Röhrchenende kontrollierbar ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Absinkrate der Probe durch Schrägstellung des Zylinders gegenüber der Vertikalen kontrollierbar ist.

17· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Röhrcheninnenseite durch die Probe gleichförmig benetzbar ist.

18. Vorrichtung zur Ermittlung der Koagulationsraten einer Fluidprobe nach Kombination mit mindestens einem Reagenz, das bei Kombination mit der Probe in einem langgestreckten Reaktionsröhrchen zur Viskositätssteigerung der Probe geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsröhrchen einen derart großen Innendurchmesser aufweist, daß anfängliche Viskositätseinflüsse der Fluidprobe praktisch eliminiert werden, daß das Röhrchen das Reagenz in der Nähe eines ersten offenen Röhrchenendes enthält, und daß das Röhrchen unterhalb dieses ersten Röhrchenendes zur reproduzierbaren Messung der Zeit für die Koagulation der Fluidprobe nach

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Kontakt mit dem Reagenz in direkter Abhängigkeit des Abstandes geeicht ist, um den die in dieses Röhrchenende eingebrachte Fluidprobe im Reaktionsröhrchen bis zu einer Immobilisationsposition absinkt.

19· Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das erste, offene Röhrchenende einen Abschnitt zur Aufnahme und Kombination der Probe mit dem Reagenz aufweist .

20. Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß am gegenüberliegenden RÖhrchenende eine begrenzte Austrittsöffnung vorhanden ist.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beeinflussung des Absinkens Vorsprünge an der Röhrcheninnenseite vorhanden sind.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz lyophilisiert ist und einen Pfropfen bildet, daß das Reagenz Thromboplastin und Calcium enthält und im Röhrchen in der Nähe des ersten Röhrchenendes positioniert ist und daß die Fluidprobe aus Blut oder Plasma besteht.

2$. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Röhrchen auch für verschiedene Neigungen gegenüber der Vertikalen geeicht ist.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Röhrchen eine Eichmarke aufweist, die das in das Röhrchen einfüllbare Probenvolumen angibt«

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch

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gekennzeichnet, daß die Innenseite des Reaktionsröhrchens durch eine flüssige Probe gleichförmig benetzbar ist.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsröhrchen ein chemisches Reagenz in Form eines Pfropfens an einer bestimmten Position in der Nähe des ersten Röhrchenendes enthält.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Eichungen als gekennzeichnete Zonen ausgeführt sind.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 2?, dadurch gekennzeichnet, daß die Eichungen graduierte Markierungen an der Außenwand des Röhrchens darstellen.

29. Manuell betätigbare Vorrichtung zur Ermittlung der Koagulationsrate von Fluidproben, gekennzeichnet durch ein Reaktionsröhrchen gleichförmiger Bohrung, deren Durchmesser zur Beseitigung von Viskositätseinflüssen der Probe ausreichend groß ist, durch eine Maßeinteilung für den reproduzierbaren Zugang zur angenäherten Position, an der das Reaktionsprodukt beim Absinken mit kontrollierter Rate im Röhrchen unbeweglich wird, und durch einen Körper, der von der Fluidprobe im Röhrchen mit nach unten dehnbar ist und lyophilisierte Reagenzien enthält, die mit der Fluidprobe reagieren und sie dann unbeweglich machen, wobei sich das Reaktionsprodukt in diesem Körper befindet.

30. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die lyophilisierten Reagenzien Thromboplastin und Calcium enthalten und daß die Fluidprobe Blut oder

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Plasma umfaßt.

"j>'\. Vorrichtung zur Koagulationsermittlung, gekennzeichnet durch ein Reaktionsröhrchen mit gleichförmiger Bohrung mit einem oifenen Ende zur Aufnahme einer flüssigen Probe, wobei der Röhrcheninnendurchmesser zur Ausschaltung von Einflüssen der anfänglichen Probenviskosität ausreichend groß ist, durch einen porösen Pfropfen im Röhrchen in der Nähe des offenen Endes, der sich abhängig von der Viskosität der Probe nach Kontakt mit dem Pfropfen über die Röhrchenlänge bewegt, und durch eine Malieinteilung zum reproduzierbaren Zugang zur angenäherten Position an der Röhrchenlänge, an der die Probe beim Abstieg im Röhrchen eine Viskositätsänderung erfährt und an der die Probe unbeweglich wird, wenn diese Änderung erreicht ist.

32. Vorrichtung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Röhrchen einen Kontroll- oder Steuerabschnitt für die Absinkrate der Kombination von Probe und Pfropfen aufweist und daß dieser Abschnitt an dem dem offenen Ende gegenüberliegenden Ende angeordnet ist..

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