DE3904731A1 - N-acetyl-ss-d-glukosaminderivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur bestimmung der n-acetyl-ss-d-glukosaminidase-aktivitaet - Google Patents

N-acetyl-ss-d-glukosaminderivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur bestimmung der n-acetyl-ss-d-glukosaminidase-aktivitaet

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Description

Die Erfindung betrifft neue N-Acetyl-β-D-glukosaminderivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und ein Verfahren zur Bestimmung der N-Acetyl-β-D-glukosaminidase-Aktivität und Anwendung der Reagentien für die Bestimmung der N-Acetyl-β-D-glukosaminidase-Aktivität.
N-Acetyl-β-D-glukosaminidase (nachfolgend als NAGase abgekürzt) ist eines der Enzyme in Lysomen, die in dem Tubular-Epithelium der Niere in großen Mengen verteilt sind, und nimmt an der Zersetzung von Glykoprotein oder Mucopolysaccharid teil. Es ist bekannt, daß der Gehalt an NAGase im Urin ansteigt, wenn verschiedene Nierenerkrankungen, wie ein akutes Nierenversagen, Glomerulonephritis etc., vorliegen oder nach einer Nierenoperation. Es ist auch bekannt, daß die NAGase bei Diabetes nicht nur im Urin, sondern auch im Serum ansteigt. Als Hilfe bei der Diagnose und der Beobachtung des Verlaufs von verschiedenen Nierenerkrankungen und auch als Index für Untersuchungen von Arzneimitteln auf eine Toxizität gegenüber der Niere besteht ein gestiegenes Interesse für Bestimmungsmethoden für NAGase auf dem klinischen Gebiet und bei Tierversuchen.
Substrate, die bisher für die Bestimmung von NAGase-Aktivität verwendet wurden, sind beispielsweise p-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid (Methods Enzymol., 28, 702 (1972)) und 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid (Clinica. Chemica. Acta., 24, 189 (1969)) sowie m-Kresolsulfonphthaleinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid (Clin. Chem., 29, 1713 (1983)).
Bei der Verwendung des erwähnten p-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glukosaminids als Substrat für die Bestimmung der NAGase-Aktivität weist dieses Substrat jedoch den Nachteil auf, daß es durch gelbe Substanzen im Urin beeinflußt wird und man dadurch in erhöhtem Maße falsche Zahlenwerte erhält, weil das gebildete p-Nitrophenol bei einer Wellenlänge von etwa 400 nm gemessen wird und die Meßgenauigkeit dabei erheblich vermindert ist. 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid hat den Nachteil, daß es ebenfalls falsche Daten ergibt und spezielle Vorrichtungen, wie ein Fluorophotometer etc., benötigt. Bei der Verwendung von p-Nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glukosaminid und m-Kresolsulfonphthaleinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid wird das Aglykon, das sich durch die Bildung des Enzyms bildet, colorimetrisch bei hohen alkalischen pH-Bereichen in der Reaktionslösung von annähernd 10 bis 11 bestimmt, so daß man die Enzymreaktion unterbrechen muß. Dieses Substrat ist deshalb wenig vorteilhaft, weil man eine kontinuierliche Bestimmung der Enzymaktivität nur mit außerordentlich großen Schwierigkeiten durchführen kann.
Zur Verbesserung der Nachteile des Standes der Technik wurden von den vorliegenden Erfindern gründliche Untersuchungen durchgeführt und es wurde dabei gefunden, daß neue N-Acetyl-β-D-glukosaminderivate außerordentlich brauchbar für die Bestimmung der NAGase-Aktivität sind.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung und zeigt die Beziehung zwischen der Bestimmung von NAGase-Aktivität und der Absorption des gebildeten Farbstoffs bei einer Wellenlänge von 570 nm gemäß Beispiel 5. Fig. 2 ist eine graphische Darstellung und zeigt die Beziehung zwischen der Bestimmung von NAGase-Aktivität und der Veränderung der Absorption des gebildeten Farbstoffs bei einer Wellenlänge von 600 nm gemäß Beispiel 6. In diesen Figuren geben die linearen Linien Kalibrierungskurven an.
Die Erfindung betrifft N-Acetyl-β-D-glukosaminderivate der allgemeinen Formel (I)
worin R ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe bedeutet und X ein Stickstoffatom oder ein Stickoxid bedeutet.
Beispiele für N-Acetyl-β-D-glukosaminderivate der Formel (I) sind die nachfolgenden Verbindungen:
Resorufinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid (R=H, X=N), Resaruzinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid (R=H, X=N)→0), Resorufinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-d-glukosaminid (R=COCH₃, X=N→0).
Ein N-Acetyl-β-D-glukosaminderivat der allgemeinen Formel (I) kann man herstellen, indem man ein Halogen-N-acetyl-D-glukosaminderivat der allgemeinen Formel (II)
in welcher R eine Acylgruppe und Y ein Halogenatom bedeutet, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (III)
in welcher X ein Stickstoffatom oder ein Stickoxid bedeutet und Z ein Wasserstoffatom, eine organische Ammoniumgruppe oder ein Alkalimetallatom bedeutet, umsetzt und gewünschtenfalls anschließend eine De-O-acylierung vornimmt.
Die Verbindung (II) kann man beispielsweise herstellen, indem man ein im Handel erhältliches N-Acetyl-b-D-glukosamin mit Acetylchlorid umsetzt (J. Org. Chem., 27, 1794 (1962). Ein Beispiel für eine Verbindung der Formel (II) ist 1-Chlor-1-deoxy-2,3,4,6-tetraacetyl-alpha-D-glukosamin.
Die Verbindung (III) kann eine im Handel erhältliche sein, oder man kann sie durch eine geeignete Methode herstellen. Beispiele für Verbindung (III) sind Resorufin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on), Resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on 10-oxid) und Natriumsalze davon oder das Triethylammoniumsalz davon. Die Verbindung (III) wird im allgemeinen in einer Menge von 1 bis 10 Moläquivalenten und vorzugsweise 2 bis 5 Moläquivalenten pro Mol der Verbindung (II) verwendet.
Geeignete Lösungsmittel sind Ketone, z. B. Aceton, Methylethylketon; Nitrile, z. B. Acetonitril; halogenierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Dichlormethan, Chloroform, Dichlorethan, Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid (DMA), Dimethylsulfoxid (DMSO), Hexamethyl-phosphoramid (HMPS). Diese Lösungsmittel können in Kombination verwendet werden, aber besonders bevorzugt wird Acetonitril. Das Lösungsmittel wird im allgemeinen in einer 5- bis 500fachen und vorzugsweise 20- bis 200fachen Menge, bezogen auf das Gewicht der Verbindung (II), verwendet.
Beispiele für den Katalysator sind Silbersalze, beispielsweise Ag₂O, AgClO₄, AgNO₃, Ag₂CO₃; Quecksilbersalze, z. B. HgO, Hg(CN)₂; Cadmiumsalze, z. B. CdCO₃ und tertiäre Amine, z. B. Triethylamin oder Tributylamin. Diese Katalysatoren kann man in Kombination anwenden, jedoch wird besonders Ag₂O bevorzugt. Der Katalysator wird im allgemeinen in einer Menge von 1 bis 10 Moläquivalenten, vorzugsweise 2 bis 5 Moläquivalenten, bezogen auf die Verbindung (II), verwendet.
Die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit hängt von der Art der Verbindungen (II) und (III), dem Lösungsmittel und dem Katalysator ab, wobei die Umsetzung aber im allgemeinen bei 20 bis 60°C während 1 bis 60 Stunden durchgeführt wird. Durch Umsetzen der so erhaltenen Verbindung (I), in welcher R eine Acylgruppe ist mit einer Base unter Entfernung der O-Acetylgruppe, erhält man die Verbindung (I), in welcher R ein Wasserstoffatom ist (Verbindung I′). Geeignete Basen sind Alkalisalze, wie KOH, K₂CO₃, NaOH, NaCO₃ oder Alkalialkoholate, beispielsweise Natriummethylat und Natriumphenolat sowie Ammoniak. Besonders bevorzugt wird hierbei wasserfreies Kaliumcarbonat. Die Base wird im allgemeinen in einer Menge von 0,1 bis 5 Moläquivalenten, vorzugsweise 0,2 bis 1 Moläquivalenten pro Mol der Verbindung (I) verwendet.
Die Verbindung (I), in welcher R ein Wasserstoffatom ist, kann zur Bestimmung der NAGase-Aktivität verwendet werden.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Reagens zur Bestimmung der NAGase-Aktivität, das ein N-Acetyl-β-D-glukosaminderivat der allgemeinen Formel (I′)
in welcher X ein Stickstoffatom oder ein Stickoxid ist und das einen Puffer enthält.
Ein für eine quantitative Bestimmung vorteilhaftes System enthält 1 bis 20 mM des N-Acetyl-β-D-glukosaminderivats und 2 bis 100 mM Puffer (pH 3,5 bis 6,5). Als Puffer werden Phosphate, Acetate, Carbonate, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Borate, Citrate oder Dimethylglutamate und dergleichen verwendet. Erforderlichenfalls und gewünschtenfalls kann man als Auflösungshilfe oder als Stabilisatoren zu dem System Glycerin, Rinderserumalbumin, Triton X 100 oder Kronenether, Cyclodextrin oder Glykole zugeben.
Das erfindungsgemäße Reagens kann in trockener oder in gelöster Form vorliegen und alternativ kann man das Reagens auf einen Dünnschichtträger, beispielsweise ein Blatt oder ein Eintauchpapier, imprägnieren. Durch Anwendung eines solchen Reagenses kann man die in verschiedenen Proben enthaltene Aktivität von NAGase genau und einfach mit hoher Empfindlichkeit bestimmen.
Nachfolgend wird die Methode zur Bestimmung der NAGase-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Zunächst wird annähernd 1 bis 20 mM und vorzugsweise 1 bis 5 mM des N-Acetyl-β-D-glukosaminderivats (I′) zu der NAGase enthaltenden Probe gegeben. Zu der Mischung gibt man einen Puffer und dann läßt man die Enzymreaktion wenigstens 3 Minuten und vorzugsweise 5 bis 120 Minuten bei 30 bis 60°C und einem pH-Wert von 3,5 bis 6,5 ablaufen. Hinsichtlich des gebildeten Aglykons (Resorufine) wird deren Absorptionswert kontinuierlich oder diskontinuierlich direkt mit einem Spektralphotometer oder einem Fluorophotometer gemessen. Durch Vergleich der Absorptionszahlen mit einer Standard-NAGase, die zuvor gemessen wurde, kann man die NAGase-Aktivität in der Probe berechnen.
Die die NAGase enthaltende Probe, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendeine Probe sein, die NAGase enthält. Spezielle Beispiele hierfür sind Kulturlösungen von Mikroorganismen, Pflanzenextrakte, Körperflüssigkeiten von Tieren, Urin, Gewebe und Extrakte davon.
Beispiele für Puffer sind Phosphate, Acetate, Carbonate, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Borate, Citrate und Dimethylglutarate. Erforderlichenfalls wird eine Vorbehandlung durchgeführt oder ein Oxidationsmittel wird zugegeben, um die Wirkung von reduzierbaren Substanzen zu minimieren.
Bei der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode kann man die NAGase-Aktivität genau und in einfacher Weise mittels einer automatischen Analyse, einer manuellen Analyse, einer Trockenanalyse etc. bestimmen, ohne daß ein Einfluß von Glukose, Billirubin, Haemoglobin und dergleichen in der Probe zu befürchten ist.
Die Erfindung wird ausführlich in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Beispiel 1 Herstellung von Resorufinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid
1-Chlor-1-doxy-2,3,4,6-tetraacetyl-alpha-D-glukosamin, 2,0 g (5,5 mM) wurden in 250 ml Acetonitril gelöst und dazu wurden 3,5 g (16,4 mM) Resorufin und 3,8 g (16,4 mM) Silberoxid (Ag₂O) zugegeben. Die Mischung wurde 10 Tage unter Rühren bei 40°C umgesetzt. Dann wurde nicht­ umgesetztes Ag₂O abfiltriert. Nach dem Abdestillieren von Acetonitril aus dem Filtrat wurde der Rückstand durch Kieselgelchromatographie gereinigt. Die mit einem Chloroform-Acetonitril-Gemisch (Volumenverhältnis 6 : 4) eluierte Fraktion wurde aus Chloroform-Diethylether-Gemisch umkristallisiert, wobei man 1221 mg (2,25 mMol, 41,2%) Resorufinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid erhielt.
Schmelzpunkt: 208,0 bis 210,0°C (Zersetzung)
UV und sichtbares Absorptionsspektrum (MeOH):
Maximale Absorptionswellenlänge (lambda max)=450 (epsilon=19 200), 375, 248 nm
IR Absorptionsspektrum (KBr):
3480 (sh), 3300, 1745, 1660, 1605, 1565, 1510 cm-1
Kernmagnetisches Resonanzspektrum (200 MHz):
(DMSO-d₆): delta(ppm)
8,04 (1H, d, J=8,8 Hz, NH), 7,79 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,53 (1H, d, J=10,0 Hz), 7,20 (1H, d, J=2,4 Hz), 7,07 (1H, dd, J=8,8 Hz, 2,4 Hz), 6,80 (1H, dd, J=10,0 Hz, 1,7 Hz), 6,25 (1H, d, J=1,7 Hz), 5,56 (1H, d, J=8,8 Hz), 5,25 (1H, brt, J=9,8 Hz), 4,95 (1H, brt, J=9,8 Hz), 4,00-4,30 (4H, m), 2,03 (3H, s), 2,01 (3H, s) 1,96 (3H, s), 1,79 (3H, s)
Beispiel 2 Herstellung von Resorufinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid
Resorufinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid, 434 mg (0,8 mM) wurden in einer Mischung aus Methanol (40 ml)-Acetonitril (20 ml) gelöst und dazu wurden 28 mg (0,2 mM) wasserfreies Kaliumcarbonat gegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur umgesetzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 5°C stehen gelassen und die ausgefallenen Kristalle wurden abfiltriert. Die Kristalle wurden aus Methanol umkristallisiert, wobei man 333 mg (0,08 mM, 100,0%) Resorufinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid erhielt.
Schmelzpunkt: 195,0 bis 198,0°C (Zersetzung)
UV und sichtbare Absorptionsspektren (MeOH):
Maximale Absorptionswellenlänge (lambda max)=450 (epsilon=18 500), 382, 349
IR Absorptionsspektrum (KBr):
3380 (sh), 3250, 1640 (sh), 1600, 1560, 1505 cm-1
Kernmagnetisches Resonanzspektrum (200 MHz):
(DMSO-d₆): delta(ppm)
7,76 (2H, d, J=8,8 Hz), 7,52 (1H, d, J=10,0 Hz), 7,08 (1H, d, J=2,4 Hz), 7,02 (1H, dd, J=8,8 Hz, 2,4 Hz), 6,79 (1H, dd, J=10,0 Hz, 2,0 Hz), 6,26 (1H, d, J=2,0 Hz), 5,20 (1H, d, J=8,3 Hz), 5,03 (2H, brt, J=5,9 Hz), 4,55 (1H, brt, J=5,6 Hz), 3,10-3,80 (6H, m), 1,82 (3H, s)
Beispiel 3 Herstellung von Resazurinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid
1-Chlor-1-deoxy-2,3,4,6-tetraacetyl-alpha-D-glukosamin, 1,5 g (4,1 mM) wurde in 200 ml Acetonitril gelöst und dazu wurden 2,8 g (12,2 mM) Resazurin und 2,8 g (12,1 mM) Silberoxid (Ag₂O) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Stunden unter Rühren umgesetzt. Dann wurde nicht umgesetztes Ag₂O abfiltriert. Nach dem Abdestillieren von Acetonitril aus dem Filtrat wurde der Rückstand kieselgelchromatographisch gereinigt. Die mit einem Gemisch aus Chloroform-Acetonitril (Volumenverhältnis 6 : 4) eluierte Fraktion wurde aus Chloroform-Diethylether umkristallisiert, wobei man 840 mg (1,51 mM, 36,7%) Resazurinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid erhielt.
Schmelzpunkt: 220,0 bis 221,0°C (Zersetzung)
UV und sichtbare Absorptionsspektren (MeOH):
Maximale Absorptionswellenlänge (lambda max)=520 (epsilon=14 600), 489 (epsilon=14 600), 375 (sh), 358, 348, 270 nm
IR Absorptionsspektren (KBr):
3480 (sh), 3320, 1740, 1660, 1630, 1600, 1540 cm-1
Kernmagnetische Resonanzspektren (200 MHz):
(CDCl₃): delta(ppm)
8,13 (1H, d, J=10,0 Hz), 8,01 (1H, d, J=10,0 Hz), 7,03 (1H, d, J=2,0 Hz), 7,01 (1H, dd, J=10,0 Hz, 2,0 Hz), 6,74 (1H, dd, J=10,0 Hz, 2,0 Hz), 6,22 (1H, d, J=2,0 Hz), 6,15 (1H, d, J=8,1 Hz, NH), 5,52 (1H, d, J=8,3 Hz), 5,49 (1H, brt, J=10,0 Hz), 5,14 (1H, brt, J=9,8 Hz), 4,15-4,35 (3H, m), 3,95-4,05 (1H, m) 2,10 (3H, s), 2,08 (3H, s), 2,07 (3H, s), 1,97 (3H, s)
Beispiel 4 Herstellung von Resazurinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid
Resazurinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid, 447 mg (0,8 mM) wurde in einer Mischung aus Methanol (40 ml)-Acetonitril (20 ml) gelöst und dazu wurden 28 mg (0,2 mM) wasserfreies Kaliumcarbonat gegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur umgesetzt. Dann ließ man das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 5°C stehen und filtrierte die ausgefallenen Kristalle ab. Die erhaltenen Kristalle wurden aus Methanol umkristallisiert, wobei man 154 mg (0,36 mMol, 44,5%) Resazurinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid erhielt.
Schmelzpunkt: 150,5 bis 153,0°C (Zersetzung)
UV und sichtbare Absorptionsspektren (MeOH):
Maximale Wellenabsorptionslänge (lambda max)=522 (epsilon=14 400), 490 (epsilon=14 400), 379 (sh), 359, 349, 270 nm
IR Absorptionsspektren (KBr):
3380 (sh), 3250, 1650 (sh), 1630, 1600, 1545, 1470 cm-1
Kernmagnetische Resonanzspektren (200 MHz):
(DMSO-d₆): delta(ppm)
8,07 (1H, d, J=9,3 Hz), 7,98 (1H, d, J=10,0 Hz), 7,77 (1H, d, J=8,8 Hz, NH), 7,17 (1H, d, J=2,0 Hz), 7,04 (1H, dd, J=9,3 Hz, 2,0 Hz), 6,67 (1H, dd, J=10,0 Hz, 1,7 Hz), 6,15 (1H, d, J=1,7 Hz), 5,23 (1H, d, J=8,8 Hz), 5,03 (2H, brt, J=5,9 Hz), 4,54 (1H, brt, J=4,9 Hz), 3,10-3,80 (6H, m), 1,82 (3H, s)
Beispiel 5 Verfahren A zur Bestimmung von N-Acetyl-β-D-glukosaminidase-Aktivität (Endpunktmethode) (1) Herstellung einer Substratlösung
1 mM Resorufinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid wird abgewogen und 50 mM Citratpuffer (pH-Wert=5,0) werden dazugegeben bis zu einem Volumen von 1 Liter, welches die Substratlösung darstellt.
(2) Herstellung von Standard-NAGase-Lösungen
Im Handel erhältliche NAGase-Lösungen mit einer bekannten Enzym-Aktivität werden mit 50 mM Citratpuffer (pH-Wert=5,0), enthaltend 0,05% Rinderserumalbumin, auf verschiedene Konzentrationen verdünnt, die als Standard-NAGase-Lösungen dienen.
(3) Herstellung der Probelösung
Eine Probe von 10 mg für die Bestimmung der NAGase-Aktivität wird genau abgewogen und zu 50 mM Citratpuffer (pH-Wert=5,0) enthaltend 0,05% Rinderserumalbumin, gegeben bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml. Dies stellt die Probelösung dar.
(4) Herstellung einer Kalibrierungskurve
Nachdem 0,5 ml der jeweiligen Standard-NAGase-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen zu jeweils 1 ml der Substratlösung gegeben wurden, wurden die Mischungen 15 Minuten auf 37°C erwärmt. Unmittelbar nach der Zugabe von 2 ml einer wäßrigen 200-mMol-Natriumcarbonatlösung zu der Mischung wurde die Absorption bei 570 nm gemessen. Es wird eine Kalibrierungskurve aufgestellt, die auf der Beziehung zwischen den Aktivitäten der Standard-NAGase-Lösungen und deren Absorptionswerten beruht.
Bei Verwendung einer NAGase (28,6 U/0,5 ml), hergestellt von Sigma Co., wird die Kalibrierungskurve durch folgende Gleichung ausgedrückt:
U=69,4×A-0,777
(worin U die Enzymaktivität, U/l ist und A die Absorption bedeutet). Fig. 1 zeigt die graphische Darstellung.
(5) Bestimmung der NAGase-Aktivität in der Probelösung
Zu 0,5 ml der Probelösung gibt man 1 ml der Substratlösung und dann erhitzt man 15 Minuten auf 37°C. Unmittelbar nach der Zugabe von 2 ml einer wäßrigen 200-mM-Natriumcarbonatlösung zu der Mischung wird die Absorption bei 570 nm gemessen. Durch einen Vergleich der Absorptionszahlen mit der Kalibrierungskurve, die gemäß (4) hergestellt wurde, kann man die NAGase-Aktivität in der Probelösung bestimmen.
Falls die Enzymaktivität in der Probelösung größer ist als das Meßlimit der Kalibrierungskurve (14,3 bis 143 U/l), wird eine Verdünnung bis zu der entsprechenden Vergrößerungszahl vorgenommen unter Verwendung eines 50-mM-Citratpuffers (pH-Wert 5,0), enthaltend 0,05% Rinderserumalbumin, und dann wird die Messung nochmals durchgeführt.
Beispiel 6 Methode B zur Bestimmung von N-Acetyl-β-D-glukosaminidase-Aktivität (Raten-Assay-Methode) (1) Herstellung einer Substratlösung
1 mM Resazurinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid wird abgewogen und dazu werden bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter 50 mM Citratpuffer (pH-Wert=5,0) gegeben. Dies ist die Substratlösung.
(2) Herstellung von Standard-NAGase-Lösungen
Im Handel erhältliche NAGase-Lösungen mit bekannter Enzymaktivität werden mit 50 mM Citratpuffer (pH-Wert=5,0), enthaltend 0,05% Rinderserumalbumin, auf unterschiedliche Konzentrationen verdünnt, die dann als Standard-NAGase-Lösungen verwendet werden.
(3) Herstellung einer Probelösung
Eine Probe von 10 mg für die Bestimmung der NAGase-Aktivität wird genau abgewogen und zu 50 mM Citratpuffer (pH-Wert=5,0), enthaltend 0,05% Rinderserumalbumin, bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml gegeben. Man erhält so eine Probelösung.
(4) Herstellung einer Kalibrierungskurve
Nach Erhitzen von 2 ml der Substratlösung auf 37°C während 3 Minuten gibt man 1 ml jeder der Standard-NAGase-Lösungen unterschiedlicher Konzentration zu den Substratlösungen. Die Mischung wird dann 3 Minuten auf 37°C erhitzt. Eine Kalibrierungskurve wird hergestellt, basierend auf der Veränderung der Absorption bei 600 nm während 2 Minuten nach dem Erwärmen.
Wird NAGase (28,6 U/0,5 ml), hergestellt von Sigma Co., verwendet, dann wird die Kalibrierungskurve durch folgende Gleichung ausgedrückt:
U=1,33×(DeltaA)×10³
(darin bedeutet U: Enzymaktivität, U/l; DeltaA: Veränderung der Absorption/Minute). Eine graphische Darstellung wird in Fig. 2 gezeigt.
(5) Bestimmung der NAGase-Aktivität in der Probelösung
Nachdem man 2 ml der Substratlösung 3 Minuten auf 37°C erwärmt hatte, gibt man 1 ml der Probelösung zu und erhitzt dann 3 Minuten auf 37°C. Die Veränderung der Absorption bei 600 nm wird während 2 Minuten nach dem Erwärmen gemessen.
Indem man die Veränderung der Absorption mit der Kalibrierungskurve, die gemäß (4) hergestellt wurde, vergleicht, kann man die NAGase-Aktivität in der Probelösung bestimmen.
Falls die Enzymaktivität in der Probelösung größer ist als die Meßgrenze der Kalibrierungskurve (14,3 bis 143 U/l), nimmt man Verdünnungen bis zu der entsprechenden Vergrößerungszahl vor unter Verwendung von 50 mM Citratpuffer (pH-Wert=5,0), enthaltend 0,05% Rinderserumalbumin, und führt die Messung nochmal durch.
Beispiel 7 Reagens A für die Messung
(1) Zusammensetzung des Reagens
Komponente
Konzentration
Reagens a:
Resorufinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid 1,0 mM
Citratpuffer (pH-Wert=5,0) 50,0 mM
Gereinigtes Wasser @ Reagens b: @ Natriumcarbonat 200 mM
Gereinigtes Wasser @ Reagens c: @ Rinderserumalbumin 0,05%
Citratpuffer (pH-Wert=5,0) 50,0 mM
Gereinigtes Wasser
(2) Meßmethode
Zunächst werden 10 mg der Probe für die Messung genau abgewogen, und dann gibt man Reagens c zu bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml, welches die Probelösung darstellt.
Dann gibt man 0,5 ml der Probelösung zu 1 ml des Reagens und anschließend erhitzt man 15 Minuten auf 37°C. Unmittelbar nachdem man 2 ml von Reagens b zugegeben hat, mißt man die Absorption bei 570 nm. Durch einen Vergleich dieser Absorptionswerte mit der zuvor hergestellten Kalibrierungskurve kann man die NAGase-Aktivität in der Probelösung bestimmen.
Falls der Enzymaktivitätswert in der Probelösung die Meßgrenze der Kalibrierungskurve übersteigt, wird die Probelösung auf die entsprechende Vergrößerungszahl verdünnt, indem man das Reagens c verwendet, und dann bestimmt man noch einmal die Aktivität.
Beispiel 8 Reagens B für die Messung
(1) Zusammensetzung des Reagens
Komponente
Konzentration
Reagens a:
Resazurinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid 1,0 mM
Citratpuffer (pH-Wert=5,0) 50,0 mM
Gereinigtes Wasser @ Reagens b: @ Rinderserumalbumin 0,05%
Citratpuffer (pH-Wert=5,0) 50,0 mM
Gereinigtes Wasser
(2) Meßmethode
Zunächst werden 10 mg der Probe für die Messung genau abgewogen und Reagens b wird dazu bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml gegeben. Dies stellt dann die Probelösung dar. 2 ml von Reagens a werden 3 Minuten auf 37°C erhitzt und 1 ml der Probelösung wird dazugegeben unter Erwärmen während 3 Minuten auf 37°C. Die Veränderung der Absorption bei 600 nm während 2 Minuten nach dem Erwärmen wird gemessen. Durch einen Vergleich der Veränderung in der Absorption und der zuvor hergestellten Kalibrierungskurve kann die Aktivität der NAGase in der Probelösung bestimmt werden.
Falls der Enzymaktivitätswert in der Probelösung die Meßgrenze der Kalibrierungskurve übersteigt, wird die Probelösung auf die entsprechende Vergrößerungszahl verdünnt, indem man das Reagens c verwendet, und dann bestimmt man noch einmal die Aktivität.

Claims (10)

1. N-Acetyl-β-D-glukosaminderivat der allgemeinen Formel (I) in welcher R ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe und X ein Stickstoffatom oder ein Stickoxid bedeuten.
2. N-Acetyl-β-D-glukosaminderivat gemäß Anspruch 1, nämlich Resorufinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid, Resazurinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid, Resorufinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid oder Resazurinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid.
3. Verfahren zur Herstellung eines N-Acetyl-β-D-glukosaminderivats der allgemeinen Formel (I) worin R ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe bedeutet und X ein Stickstoffatom oder ein Stickoxid bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Halogen-N-acetyl-D-glukosaminderivat der allgemeinen Formel (II) worin R eine Acylgruppe und Y ein Halogenatom bedeuten, mit einem Resorufin der allgemeinen Formel (III) worin X ein Stickstoffatom oder ein Stickoxid bedeutet und Z ein Wasserstoffatom, eine organische Ammoniumgruppe oder ein Alkalimetallatom bedeutet, umsetzt und gewünschtenfalls eine De-O-acylierung vornimmt.
4. Verfahren zur Herstellung eines N-Acetyl-β-D-glukosaminderivats gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der Formel (II) 1-Chloro-1-deoxy-2,3,4,6-tetraacetyl-D-glukosamin oder 1-Bromo-1-deoxy-2,3,4,6-tetraacetyl-alpha-D-glukosamin verwendet.
5. Verfahren zur Herstellung eines N-Acetyl-β-D-glukosaminderivats gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der Formel (III) Resorufin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on), Resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on-10-oxid), ein Natriumsalz davon ein Triethylaminsalz davon verwendet.
6. Verfahren zur Herstellung eines N-Acetyl-β-D-glukosaminderivats gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (I) Resorufinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid, Resazurinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid, Resorufinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid oder Resazurinyl-2,3,4,6-tetraacetyl-β-D-glukosaminid ist.
7. Reagens zur Bestimmung von N-Acetyl-β-D-glukosaminidase-Aktivität, enthaltend als wirksamen Bestandteil ein N-Acetyl-β-D-glukosaminderivat der allgemeinen Formel (I′) in welcher X ein Stickstoffatom oder ein Stickoxid bedeutet.
8. Reagens zur Bestimmung von N-Acetyl-β-D-glukosaminidaseaktivität gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (I′) Resorufinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid oder Resazurinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid ist.
9. Verfahren zur Bestimmung der N-Acetyl-β-D-glukosaminidase-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß man ein N-Acetyl-β-D-glukosaminderivat der allgemeinen Formel (I′) in welcher X ein Stickstoffatom oder ein Stickoxid bedeutet, zu einer Lösung der Probe enthaltend N-Acetyl-β-D-glukosaminidase gibt und colorimetrisch das Aglykon (Resorufin), das durch die Enzymreaktion gebildet wird, direkt mit einem Spektrophotometer oder fluorometrisch mit einem Fluorophotometer bestimmt.
10. Verfahren zur Bestimmung der N-Acetyl-b-D-glukosaminidase-Aktivität gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der Formel (I′) Resorufinyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid oder Resazurinyl-N-acetyl-b-D-glukosaminid verwendet.
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