DE3900191C2 - Meßvorrichtung zur Bestimmung des Sauerstoffpartialdruckes, des Sauerstoffgehaltes und des Sauerstoff-Flusses in biologischen Systemen - Google Patents

Meßvorrichtung zur Bestimmung des Sauerstoffpartialdruckes, des Sauerstoffgehaltes und des Sauerstoff-Flusses in biologischen Systemen

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Description

Die Erfindung betrifft eine Meßvorrichtung zur Bestimmung des Sauerstoffpartialdruckes, des Sauerstoffgehaltes und des Sauerstoff-Flusses in biologischen Systemen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, wie aus der DE 31 48 830 A1 bekannt.
Höhere Organismen benötigen zum Leben Sauerstoff, und seine Bestimmung spielt bei vielen biologischen Fragestellungen eine zentrale Rolle. Dementsprechend gibt es eine Reihe von Methoden zur Messung des Sauerstoffpartialdruckes in bio­ logischen Systemen. Im Vergleich zu anderen bereits bekann­ ten Verfahren hat sich in letzter Zeit die Messung des Sauerstoffpartialdruckes mittels Fluoreszenzlöschung in vieler Hinsicht als sehr vorteilhaft erwiesen. Insbesondere zeichnet sich diese Methode dadurch aus, daß für die Mes­ sung des Sauerstoffpartialdruckes kein Sauerstoff ver­ braucht und so der Meßwert selbst nicht erniedrigt wird, was beispielsweise ein systematischer Fehler bei polaro­ graphischen Meßverfahren ist. Die Fluoreszenzlöschung macht eine sinnvolle Bearbeitung wichtiger Probleme, wie z. B. der transkutanen Messung des Sauerstoffpartialdruckes, der Messung des Sauerstoffverbrauches von Zellen (als Mikromethode) und der Messung des Sauerstoffpartialdruckes im Boden überhaupt erst möglich.
Von zentraler Bedeutung für die Funktionsfähigkeit einer Meßanordnung zur Bestimmung des Sauerstoff-Gehaltes einer Probe mittels Fluoreszenzlöschung ist es, eine meß­ technisch auswertbare, ausreichend hohe Fluoreszenz­ löschung zu erreichen. Das bedeutet, daß durch äußeres Licht, welches auf die Meßvorrichtung fällt, das Fluoreszenzsignal nicht beeinflußt werden soll. Gleichzeitig dürfen auch das Anregungs- und das Fluoreszenzlicht nicht nach außen dringen, da sonst Absorptionsveränderungen in der Probe das Fluoreszenzsignal beeinflussen und so die Meßwerte verfälschen.
Darüber hinaus muß das Meß-System gegenüber Wasser undurch­ lässig sein, da sich auch dadurch die Reflexionsverhält­ nisse ändern und zu Störungen des Fluoreszenzsignals führen.
Eine Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Hauptanspruchs vorliegender Erfindung ist in der eingangs genannten DE 31 48 830 A1 beschrieben. Für die hierin verwendete Membran werden Halogenkohlen­ wasserstoff-Polymere eingesetzt. Hiermit ist jedoch das Problem der optischen Entkopplung nicht gelöst.
Die EP-A 0 190 830 A2 offenbart einen Sensor zur Messung des Sauerstoff-Partialdruckes, wobei der Indikator in eine Membran eingelagert ist, welche mit einer Silikonschicht versehen ist. Auch hier ist das Problem der optischen Ent­ kopplung nicht gelöst.
Die EP-A 0 109 958 A2 schlägt zur meßtechnisch auswertbaren Bestimmung des Sauerstoff-Gehaltes einer Probe vor, den Fluoreszenzindikator in einen Polymerträger einzuarbeiten bzw. kovalent damit zu verbinden und dem Trägermaterial bestimmte Weichmacher zuzusetzen. Dabei werden erhöhte Indikatorkonzentrationen eingesetzt. Die optische Unabhängigkeit vom Probenmedium soll hierbei durch Einlagerung von Pigmenten (z. B. Eisenoxidpartikel) in den Träger erzielt werden. Insgesamt sind hier relativ aufwendige Schritte notwendig, um eine geeignete Meßanordnung bereitzustellen.
Die DE 25 08 637 A1 offenbart ebenfalls eine Vorrichtung zur optischen Messung von Blutgasen, z. B. Sauerstoff, mittels Fluoreszenzlöschung. Hierbei wird vorgeschlagen, zur optischen Entkopplung die Oberfläche eines optischen Sensors, einer für das zu bestimmende Gas selektiv durchläs­ sigen Membran, zu verspiegeln oder zu schwärzen.
Es wird jedoch kein Hinweis darauf gegeben, wie eine solche Schwärzung vorzunehmen ist und welche Materialien hierfür Verwendung finden könnten.
In der AT 381 393 B sowie der EP 0 263 692 C3 wird ebenfalls vorgeschlagen, die Membran, welche hier den Indikator enthält, an der dem Träger abgewandten Seite mit einer Schicht geringer Lichtdurchlässigkeit zu versehen.
Üblich geschwärzte, käufliche Membranen werden dadurch her­ gestellt, daß ein Silikonmaterial, welches praktisch als einziges für eine sauerstoffdurchlässige und zugleich extrem wasserundurchlässige Membran in Frage kommt, mit Acetylen-Ruß - einem bislang als optimales Schwärzungs­ mittel angesehenen Material - zu beladen. Diese extreme Schwärzung ist erforderlich, weil die Fluoreszenzdetektoren extrem empfindlich sind. Dabei führt aber die relativ hohe Belegung des Silikons mit Ruß stets dazu, daß die Membran brüchig wird und die Rußteilchen Kapillaren bilden, durch die dann Wasser eindringt und somit keine befriedigenden Meßergebnisse erzielt werden.
Eine andere Möglichkeit zur optischen Entkopplung bei sol­ chen Meß-Systemen besteht in der Verwendung möglichst dicker Membranen. Dicke Membranen bedingen jedoch eine sehr lange Einstellzeit des Meß-Signals sowie eine Äquili­ brierung mit Sauerstoff während der Messung. Da Sauerstoffgehaltsmessungen in biologischen Systemen jedoch schnell erfolgen sollen (z. B. transkutan), sind solche dicke Membranen für die genannten Meßeinrichtungen eher ungeeignet.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Meß­ vorrichtung zur Sauerstoff-Messung mittels Fluoreszenzlöschung bereitzustellen, bei welcher eine vollständige optische Entkopplung vom Probenmedium und innerhalb der Anordnung möglich ist, der störende Einfluß von Wasser eliminiert ist und eine nur kurze Einstellzeit des Meß-Signals erforderlich ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einer gattungsge­ mäßen Vorrichtung dadurch gelöst, daß die Membran, aus­ gehend von der Indikatorseite, folgenden Aufbau hat:
  • - eine erste Schicht aus einer Silikonpaste,
  • - eine zweite Schicht aus einer Mischung aus einer Silikon­ paste und einer Silikonplaste aus einem Silikonöl mit einem darin eingearbeiteten partikelförmigen Schwärzungsmittel,
wobei die Schichten durch Vulkanisation hergestellt sind.
Bevorzugtes Trägermaterial ist quervernetztes Polystyrol, und die Membran ist insbesondere etwa 250 µm dick.
Durch die erfindungsgemäße Vorrichtung ist es möglich, eine vollständige optische Entkopplung zu erzielen, ohne daß dicke Membranen hierzu erforderlich wären. Gleichzeitig bleibt die Dichtigkeit gegen Wasser erhalten, d. h. das Eindringen von Wasser in den kapillaren Spalt zwischen der Fluoreszenzschicht und der schwarzen Membran wird verhindert.
Die schwarze Membran kann vorzugsweise in die bereits be­ kannten Sondenvorrichtungen eingesetzt werden (vgl. Abb. A). Deren wichtigster Teil ist ein Y-förmiger Lichtleiter (LL), bei dem im gemeinsamen Teil die Glasfasern statistisch gemischt sind. Durch die Lichtquelle (L) und das Interferenzfilter (F1) wird quasi-mono­ chromatisches Licht erzeugt, das über einen Arm des Y-förmigen Lichtleiters (LL) zur Sauerstoff-empfind­ lichen Schicht gelangt. Mittels Langpaßfilter (F2), Sekun­ därelektronenvervielfältiger (PM) und Schreiber erfolgt die Detektion des Signals. Die Bedeutung der mit (SS) angege­ benen Schicht wird weiter unten erläutert. Als Sauerstoff­ abhängige Fluoreszenzindikatoren können hierfür hydrophobe aromatische Verbindungen verwendet werden, von denen Tetraphenylporphyrin oder Pyren besonders bevorzugt ist.
Die Verwendung dieses Indikators in einem Mikrodetektor zur Messung der Änderung des Sauerstoff-Partialdruckes ist bei­ spielsweise in W.K.R. Barnikol et al, Rev. Sci. Instrum., 59 (7), Juli 1988, Seiten 1204-1208, beschrieben.
Als Trägermaterial finden übliche hydrophobe Polymere, wie z. B. Polystyrol, Polyester, Polyvinylchlorid und bevorzugt vernetztes Polystyrol mit einem durchschnittlichen Korngrößendurchmesser von 120 µm Verwendung.
Es hat sich darüber hinaus als vorteilhaft erwiesen, in einer bevorzugten Ausführungsform zwischen der Trägerplat­ te (G) und der Membran (M) probenseitig eine Zwischen­ schicht aus Polytetrafluorethylen anzuordnen. Der Einsatz von Polytetrafluorethylen ist beispielsweise in der EP 0 126 600 A2 oder in O.S. Wolfbeis et al. in Anal. Chem. 1985, 57, Seiten 2556-2561 beschrieben. Durch diese Anordnung bleibt die Membran und damit das ganze System vollkommen druckun­ empfindlich, was vor allem bei Messungen auf der Haut erforderlich ist. Diese Zwischenschicht ist in Abb. A mit (SS) gekennzeichnet.
Statt der Y-förmigen Anordnung der Lichtleiter in der er­ findungsgemäßen Meßvorrichtung kann der Indikator bevor­ zugt auch direkt angeregt werden. Das Fluoreszenzlicht wird dann seitlich in einem Winkel von etwa 45° abgeführt (s. Abb. C).
Der Vorteil der erfindungsgemäßen Meßvorrichtung liegt darin, daß durch die schwarze dünne Membran eine optimale optische Entkopplung erfolgt. Durch Eliminierung äußerer Lichteinflüsse und Verhinderung des Austretens von Fluores­ zenzlicht werden störende Signaländerungen vermieden. Be­ vorzugt kann durch Einfügung einer Schicht aus Polytetra­ fluorethylen zwischen die schwarze Membran und die Fluores­ zenzschicht das System vollständig druckunempfindlich ge­ macht werden. Die Membran ist sauerstoffdurchlässig, bleibt für Wasser jedoch undurchlässig. Die Einstellzeit des Meß-Signals bleibt aufgrund der geringen Dicke der Membran kurz. Ferner erfolgt die Messung ohne eigenen Sauerstoffverbrauch, die Indikatorkonzentration kann des­ halb niedrig gehalten werden. Die Meßvorrichtung ist daher besonders für biologische Systeme geeignet, da nur sehr geringe Probenmengen erforderlich sind.
Gegebenenfalls kann zur elektronischen Sauerstoffreduk­ tion die Membran (M) probenseitig mit einem Gitter aus Edelmetall, insbesondere Gold oder Platin, ausgestattet sein.
Das zur optischen Entkopplung eingesetzte Schwärzungs­ mittel ist vorzugsweise Acetylenruß oder Eisenoxid.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiel 1 Herstellung der schwarzen Membran
Ein 22 mm breiter Streifen aus 125 um dickem Paraffin wird auf eine Glasplatte gelegt. Hierüber wird eine Schicht aus Silikonpaste mit einem 250 µm Rakel gerakelt. Die frische Silikonschicht ist somit 125 µm dick. Man läßt nun 24 Stunden vulkanisieren und zieht den Streifen (Paraffin und Silikonschicht) von der Glasplatte ab. Nun wird eine Mischung aus 0,75 g Silikonpaste (Silikon-Einkomponenten­ kleber) und 0,75 g einer schwarzen Silikonplaste hergestellt. Die schwarze Silikonplaste besteht aus zäh­ flüssigem Silikonöl, in welches Acetylenruß oder Eisenoxid eingearbeitet ist. Der Streifen aus Paraffin- und Silikonschicht wird erneut auf eine Glasplatte gelegt und über diesen Streifen mit einem 450 µm Rakel die obige Mischung geschichtet. Man läßt wieder einen Tag vulkanisieren und zieht die entstandene Silikonmembran vom Paraffin ab. Es resultiert nach Vulkanisation eine etwa 250 µm dicke, schwarze Silikonmembran, die völlig wasserundurchlässig ist und Sauerstoff gut passieren läßt.
Diese Membran kann erfindungsgemäß wie folgt in eine Meß­ vorrichtung eingebaut werden:
Beispiel 2 (Abb. A)
Eine Glasplatte (G) (biplanar) wird mit einer beidseitig klebenden Haftfolie (etwa 30 µm dick) versehen. Hierauf wird das Trägermaterial (z. B. vernetztes Polystyrol) mit adsorbiertem Fluoreszenzfarbstoff (Fst) (Tetraphenylporphyrin) aufgestreut und angedrückt. Über diese Schicht wird dann die gemäß Beispiel 1 hergestellte schwarze Membran (M) gespannt.
Die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs erfolgt mittels eines Y-förmigen Lichtleiters (LL), bei dem im gemeinsamen Teil die Glasfasern statistisch gemischt sind. Durch die Lichtquelle (L) und das Interferenzfilter (F1) wird quasi­ monochromatisches Licht erzeugt, das über einen Arm des Y-förmigen Lichtleiters (LL) zur Sauerstoff-empfindlichen Schicht gelangt.
Das Fluoreszenzlicht wird dann über den zweiten Arm des Y-förmigen Lichtleiters zum Sekundärelektronenvervielfacher (PM) geleitet. Ein geeignetes Langpaßkantenfilter (F2) dient dazu, das Anregungslicht möglichst vollständig zu unterdrücken und das Fluoreszenzlicht, das bekanntlicher­ weise eine größere Wellenlänge als das Anregungslicht auf­ weist, möglichst ungehindert passieren zu lassen. Das Si­ gnal des Sekundärelektronenvervielfachers wird dann mittels eines geeigneten Meßgerätes erfaßt (Schr).
Mit Hilfe dieser Anordnung kann die Messung des Sauerstoff­ verbrauchs von Zellsuspensionen oder anderer biologischer Proben (kleine Insekten, Mikroorganismen etc.) erfolgen. Wegen des fehlenden Sauerstoffverbrauchs sind nur sehr kleine Probenmengen erforderlich.
Beim Einspannen der schwarzen Membran in die Halterung ist keine Änderung der Sauerstoff-Empfindlichkeit des Fluoreszenzsignals zu verzeichnen. Da das System bei dieser Messung keiner Druckbelastung ausgesetzt wird, kann keine Änderung des Signals erfolgen.
Zur Messung wird nun in die Meßkammer die zu untersuchende Probe (z. B. Zellsuspension oder andere sauerstoffver­ brauchende biologische Proben) eingefüllt. Es erfolgt eine Äquilibrierung der Sauerstoff-Partialdrücke zwischen der Meßkammer und der Sonde. Diese zeitliche Änderung des Sauerstoff-Partialdruckes ist dann ein direktes Maß für den Sauerstoff-Verbrauch der eingebrachten Probe.
Um den Sauerstoff-Verbrauch quantiativ erfassen zu können, muß man jedoch zusätzlich den Sauerstoff-Gehalt des Probensystems messen. Das geschieht mit Hilfe eines künstlichen definierten Sauerstoff-Verbrauchs. Dazu wird in die Meßkammer noch eine Platin-Elektrode eingebaut und der Sauerstoff in der Probe elektrochemisch reduziert. Den hierzu erforderlichen Strom kann man dann quantiativ bestimmen. Es läßt sich also ein definierter Sauerstoffverbrauch experimentell vorgeben und der PO2-Verlauf in Abhängigkeit von der Zeit fluormetrisch messen. Damit läßt sich das Meß-System kalibrieren. Um mit Hilfe der polarographischen Sauerstoff-Elektrode verschie­ dene Werte des Sauerstoff-Verbrauchs einstellen zu können, wird diese im Pulsbetrieb gefahren. Aus diesen Kalibriermessungen kann dann ein effektiver Löslichkeits­ koeffizient des Sauerstoffs für den Meßaufbau bestimmt und somit der Sauerstoff-Verbrauch der Probe schließlich quantitativ erfaßt werden. Es gilt also:
Hierbei ist VO der elektrochemisch vorgegebene Sauer­ stoff-Verbrauch, a* der effektive Löslichkeitskoeffizient (spezifisch für das jeweilige System) und piO2 (peO2) der fluorimetrisch gemessene Sauerstoff-Partialdruck zu Beginn (Ende) der Elektrolyse, dt ist das Zeitintervall, a* stellt eine meßtechnisch ermittelte Größe dar, in die neben der Löslichkeit des Sauerstoffs in dem Suspensionsmedium (für Zellen) auch die Löslichkeit des Sauerstoffs in der schwar­ zen Membran und der Membran vor der Platin-Elektrode mit ein­ gehen. Erst durch die Kalibrierung des Gerätes, also die Messung von a*, ist überhaupt eine quantitative Analyse der Daten möglich.
Eine solche Vorrichtung ist in Abb. B dargestellt:
Hierbei bedeutet Pt-El die Elektrode für die elektroche­ mische Reduktion des Sauerstoffs. (M3) eine Membran vor dieser Elektrode, (MK) die Meßkammer, in die die Probe eingefüllt wird, (M2) die oben beschriebene schwarze Membran, (M1) die Sauerstoff-sensitive Schicht, (G) eine Glasplatte zur Stabilisierung des Systems und (LL) der Lichtleiter mit Fasern für Anregungs- und Fluoreszenzlicht (vgl. Abb. 1). Als Farbstoff dient Tetraphenylporphyrin, das Trägermaterial ist Porapak Q (ein vernetztes Polystyrol, Korngrößendurchmesser 120 µm), die Sauerstoff-empfindliche Schicht wird in der gleichen Weise wie bereits beschrieben hergestellt.
Auf diese Weise kann beispielsweise der Sauerstoff-Ver­ brauch von Lymphozyten-Suspensionen oder einer 4 mg schweren Zuckmückenlarve (Chironomus pulmosus) gemessen werden.
Beispiel 3 Messung des transkutanen (epikutanen) Sauerstoff- Partialdruckes
Auf eine konvex gewölbte Glasplatte wird eine beidseitig klebende Haftfolie aufgebracht (etwa 30 µm dick) und nachfolgend das Trägermaterial mit absorbiertem Farbstoff wie in Beispiel 2 daran angebracht.
Probenseitig wird dann eine 90 µm dicke Polytetrafluor­ ethylenschicht aufgebracht (vgl. dazu Abb. A mit (SS) = Tetrafluorethylenschicht). Über diese Schicht wird dann die bereits beschriebene schwarze Membran gespannt. Überraschenderweise ist diese Anordnung nicht druck­ empfindlich, allerdings ändert sich durch Einspannen der schwarzen Membran in die Halterung das Fluoreszenzsignal. Da man nach dem Einspannen das System mit definierten Gasen kalibrieren kann, ist dieser Effekt für die beabsichtigte Anwendung ohne Relevanz. Das System ist nicht feuchtigkeitsempfindlich. Legt man nun eine derartige Sonde auf die Haut, so äquilibrieren auch Sonde und Haut, und man kann den Sauerstoff-Partialdruck auf der Haut (epikutaner Sauerstoff-Partialdruck) messen. Im Gegensatz zu den bereits existierenden Verfahren, wird hierbei kein Sauerstoff verbraucht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann auch probenseitig auf die schwarze Membran ein Gitter aus Edel­ metall (Au, Pt) aufgebracht werden und dann in dem kapillaren Spalt zwischen Haut und Meßkopf der Sauerstoff elektrochemisch reduziert werden. Wird nun unter konstantem epikutanem Sauerstoff-Partialdruck, welcher mit Hilfe der Fluoreszenzlöschung über eine dosierte Elektrolyse einge­ stellt wird, der Sauerstoff-Verbrauch dieser Anordnung gemessen, so läßt sich der Sauerstoff-Fluß durch die Haut quantitativ erfassen. Unter Zuhilfenahme des 1. Fickschen Gesetzes kann dann ein intrakutaner Sauerstoff-Partialdruck bestimmt werden. Letzterer stellt einen Indikator für die Sauerstoff-Versorgungssituation der Gewebe dar.
Die in den Beispielen 1 bis 3 erläuterten Messungen können auch in der Weise durchgeführt werden, daß man die Fluoreszenzschicht durch direkte Beleuchtung anregt, wie in Abb. C dargestellt. Das Fluoreszenzlicht wird dann seitlich über die Lichtleiter (aLL) abgeführt.

Claims (10)

1. Meßvorrichtung zur Bestimmung des Sauerstoffpartialdruckes, des Sauerstoffgehaltes und des Sauerstoff-Flusses in biologischen Systemen, umfassend einen Sauerstoff­ abhängigen fluoreszierenden Indikator, wobei die homogen auf einem Trägermaterial aufgebrachte Indikatorsubstanz auf einer Trägerplatte vorliegt und der auf dem Trägermaterial aufgebrachte Indikator außerhalb der Membran angeordnet ist, sowie eine Lichtquelle, einen Lichtleiter, einen Detektor und eine Sauerstoff-durchlässige und Wasser-undurchlässige Membran, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran (M), ausgehend von der Indikatorseite, folgenden Aufbau hat:
  • - eine erste Schicht aus einer Silikonpaste,
  • - eine zweite Schicht aus einer Mischung aus einer Silikonpaste und einer Silikonplaste aus einem Silikonöl mit einem darin eingearbeiteten partikelförmigen Schwärzungsmittel,
    wobei die Schichten durch Vulkanisation hergestellt sind.
2. Meßvorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial quervernetztes Polystyrol ist.
3. Meßvorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran (M) etwa 250 µm dick ist.
4. Meßvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Trägerplatte (G) und der Membran (M) probenseitig eine Zwischenschicht (SS) aus Tetrafluorethylen aufgebracht ist.
5. Meßvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur elektrochemischen Sauerstoffreduktion die Membran (M) probenseitig mit einem Gitter aus Edelmetall ausgestattet ist.
6. Meßvorrichtung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Edelmetall Gold oder Platin ist.
7. Meßvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Schwärzungsmittel Acetylenruß oder Eisenoxid ist.
8. Meßvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtleiter (LL) Y-förmig und mit Glasfasern für Anregungs- und Fluoreszenzlicht im gemeinsamen Teil ausgestattet ist und ein Interferenzfilter (F1), ein Langpaßkantenfilter (F2) und als Detektor (PM) einen Sekundärelektronenvervielfacher sowie einen Schreiber aufweist.
9. Meßvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (L) direkt auf den Fluoreszenzindikator (Fst) gerichtet ist und Lichtleiter (LL) seitlich davon in einem Winkel von etwa 45° zur Ableitung des Fluoreszenzlichtes angeordnet sind.
10. Meßvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzindikator (Fst) Tetraphenylporphyrin oder Pyren ist.
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