DE3889625T2 - Proteolytisches enzym, spezifisch für menschlichen immunmangel-virus, verfahren zu seiner herstellung und renaturierung. - Google Patents

Proteolytisches enzym, spezifisch für menschlichen immunmangel-virus, verfahren zu seiner herstellung und renaturierung.

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die Protease des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) sowie ihre natürlichen Polyproteinsubstrate wurden identifiziert und strukturell, biochemisch und enzymatisch charakterisiert, um die Aktivität der Protease hemmende Arzneimittel herzustellen. Untersuchungen an Protease-defizienten MuLV-Mutanten ergaben, daß das reife infektiöse Virus nicht produziert werden kann, wenn die Vorläuferpolyproteine nicht gespalten werden. Stattdessen werden nicht-infektiöse Partikel gebildet, die jedoch immunogen bleiben, da sie vollständige Hüllen tragen. Das eigentliche Ziel dieser Untersuchungen war die Herstellung chemischer Inhibitoren, die in die infizierte Zelle eindringen, in das sich abschnürende Virus eingeschlossen werden, mit hoher Affinität an die Virusprotease oder Vorläuferpolyproteine binden, die Spaltung verhindern und die Produktion von nicht-infektiösen, jedoch noch immunogenen Virusnachkommen bewirken. Die Verwendung dieser chemischen Inhibitoren würde die Ausbreitung der HIV-Infektion verhindern, während sie die Stimulierung der Wirtsimmunität durch Antigene ermöglicht.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Aminosäuresequenz der Protease des menschlichen Immunschwächevirus (HIV), die ein für das HIV-, LAV- und HTLV-III-Virus spezifisches proteolytisches Enzym ist, wurde sowohl für HIV-1- als auch HIV-2-Varianten ermittelt. Es wurde außerdem eine Protease synthetisiert, die sowohl bei HIV-1 als auch HIV-2 aktiv war. Dieses Enzym ist in Zellen von HIV-Virus-infizierten Individuen zur natürlichen Synthese von HIV erforderlich. Im Verlauf der natürlichen Synthese muß das Virusprotein aus den Vorläuferproteinen freigesetzt werden. Dies ist die spezifische Funktion des identifizierten und synthetisierten proteolytischen Enzyms. Das aktive Virus kann in infizierten Zellen ohne die HIV-Protease nicht reproduziert werden, und der natürliche Synthesevorgang wird kurz vor dem Abschluß beendet. Nach der Aufklärung der Struktur dieser spezifischen Protease und der Synthese des aktiven Enzyms kann ein für dieses Enzym spezifischer Protease-Inhibitor entwickelt werden. Es wurde ein HIV-1-spezifisches Kaninchen-Antiserum gegen den C-terminalen Bereich der HIV-1-Protease erzeugt und zur Isolierung und Charakterisierung der natürlichen HIV-1-Protease verwendet. Es wurde außerdem ein Kaninchen-Antikörper gegen die synthetische HIV-1-Protease erzeugt, der mit der HIV-2-Protease kreuzreagiert.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Figur 1 zeigt die Konservierung von Aminosäuresequenzen in die erfindungsgemäßen Proteasen einschließenden retroviralen Proteasen. Die Punkte zeigen identische Reste oder konservative Substitutionen.
  • Figur 2 zeigt die Aminosäuresequenz der HIV-1 (BH10)- Protease und die in der HIV-2-Protease festgestellten nichthomologen Sequenzen.
  • Figur 3 zeigt DNA- und Aminosäuresequenzen von HIV, einschließlich der vollständigen Sequenz der HIV-1-Protease (Figur 3A) und der HIV-2-Protease (Figur 3B).
  • Figur 4 zeigt die proteolytische Spaltung von HIV- Substraten mit der hier synthetisierten HIV-1-Protease, die dadurch ihre Aktivität bestätigt.
  • Die Figuren 5, 6 und 7 zeigen eine proteolytische Spaltung der Phe-Pro-Bindung durch die HIV-2-Protease in Sp- 78- und Sp-258-Substraten und der Try-Pro-Bindung in SP-211- Substraten.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die HIV-codierende DNA-Sequenz war vollständig bekannt. Die Sequenzbereiche jedoch, die bestimmte aktive Peptide und Proteine, beispielsweise die Protease, codieren, sind vor dieser Erfindung nicht bestimmt worden. Da zuvor für menschliche Retroviren spezifische Proteasen identifiziert und Homologien in den Sequenzen, die zur natürlichen Synthese dieser anderen Retroviren erforderliche Proteasen codieren, festgestellt worden waren, konnten Bereiche in der HIV-Proteine-codierenden DNA-Sequenz identifiziert werden, die innerhalb der Sequenz liegen, die eine HIV-spezifische und für seine natürliche Synthese erforderliche Protease codieren. (Copeland und Oroszlan, "A Synthetic Dodecapeptide Substrate For Type C RNA Tumor Virus Associated Proteolytic Enzyme", Peptides: Synthesis-Structure-Function, Pierce Chemical Company 1981, und Yoshinaka et al., "Murine Leukemia Virus Protease is Encoded By The gag-pol Gene and Is Synthesized Through Suppression of an Amber Termination Codon", Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd. 82 (März 1985), 1618- 1622, die hier durch Bezugnahme vollständig eingeschlossen sind). Bisherige Untersuchungen zeigten, daß bestimmte Sequenzen in retroviralen Proteasen konserviert waren. Diese sind in Figur 1 dargestellt.
  • Die HIV-Protease ist ein Peptid von 99 Aminosäuren, das ein durch SDS-PAGE ermitteltes Molekulargewicht von 11 bis 11,5 kD aufweist. Die Aminosäuresequenz ist in Figur 2 dargestellt und beginnt mit ProGlnIle... . Die Aminosäuresequenz von HIV-1BH10 ist vollständig dargestellt. Die zweite Reihe in Figur 2 zeigt die Aminosäuren von HIV-2, sofern sie sich von denen in HIV-1 unterscheiden. Figur 3A zeigt die Lage des Peptids von 99 Aminosäuren in der HIV-1-Sequenz. Die erste Reihe in jeder Gruppierung ist die HIV-1-Proteasecodierende DNA-Sequenz. Die Peptidsequenz ist in den unteren Reihen jeder Gruppierung dargestellt. Die zweite Reihe in der ersten Gruppierung ist eine alternative Aminosäuresequenz, die für die Expression bestimmter Teile des HIV-1- Proteins korrekt ist. Aufgrund einer Leserasterverschiebung vor der Protease ist jedoch die Sequenz, die in der dritten Reihe und außerdem in Figur 2 dargestellt ist, die eigentliche Aminosäuresequenz der HIV-1-Protease.
  • Nach der Ermittlung der Aminosäuresequenz der HTV- Protease wurde der aus 15 Aminosäuren (IleGlyArgAsnLeuLeuThrGlnIleGlyCysThrLeuAsnPhe) bestehende C-terminale Bereich des Peptids synthetisiert. Mit diesem 15 Aminosäuren umfassenden synthetischen Peptid wurde ein Kaninchen-Antiserum erzeugt. Das Kaninchen-Antiserum wurde anschließend zum Nachweis der natürlichen HIV-Protease verwendet. Es wurde außerdem zur Identifizierung der Proteasefraktion nach der HPLC-Trennung verwendet. Der N-Terminus der HPLC-gereinigten Protease wurde anschließend durch einen Edman-Abbau sequenziert. Es konnte dadurch festgestellt werden, daß der N-Terminus mit dem Pro beginnt, das 99 Aminosäuren stromaufwärts des zuvor identifizierten N-terminalen Pro am Sequenzanfang der reversen Transkriptase liegt, der in Figur 3a mit RT markiert ist.
  • Nachdem festgestellt worden war, daß es sich um die Sequenz der HIV-Protease handelte, wurde zur Synthese des 99 Aminosäuren-Peptids eine Festphasensynthese unter Verwendung des Merrifield-Verfahrens durchgeführt (R. B. Merrifield, "Solid Phase Peptide Synthesis I", J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Die Synthese wurde unter Verwendung der halbautomatischen Syntheseverfahren nach einem Programm von Applied-Biosystems und einem Peptidsynthesizer 430 von Applied-Biosystems (Foster City, Kalifornien) durchgeführt.
  • Das 99 Aminosäuren-Polypeptid, das die in den Figuren 2 und 3A dargestellte Sequenz aufweist, wird ausgehend von der DNA-Sequenz von HIV-1BH10 synthetisiert (L. Ratner et al., "Complete Nucleotide sequence of the AIDS Virus, HTLV- III", Nature 313 (1985), 277-284, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Diese synthetische Protease wird hier nachstehend als PR-1 bezeichnet.
  • Ferner wurde eine weitere HIV-Protease mit der Bezeichnung PR-2 synthetisiert, die, wie von M. Guyader et al., in "Genome Organization and Transactivation of the Human Immunodeficiency Virus Type 2", Nature 326 (1987), 662-669, beschrieben, der Sequenz eines anderen HIV-Stamms (HIV-2ROD) entspricht. Die Unterschiede der PR-1- und PR-2- Aminosäuresequenzen sind in Figur 2 dargestellt. Die vollständige Sequenz von PR-2 ist in Figur 3B dargestellt. Die PR-1- und PR-2-Sequenzen umfassen beide 99 Aminosäuren und weisen 47 identische Reste in ihrer Sequenz auf und eine Homologie von insgesamt etwa 76 %. Die mutmaßlichen Sequenzen des aktiven Zentrums von PR-1 und PR-2 sind identisch (vgl. die identischen Reste 23 bis 30, Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp, die in Figur 2 dargestellt sind) und die natürlichen Spaltstellen in den beiden HIV-Stämmen sind sehr ähnlich, wie im Labor ermittelt wurde (L. E. Henderson et al., "Analysis of Proteins and Peptides Purified From Sucrose Gradient Banded HTLV-III", in Human Retroviruses, Cancer and AIDS: Approaches to Prevention and Therapy (1988), 135-147, Alan R. Liss Inc., und L. E. Henderson et al., "Molecular Characterization of gag Proteins From Simian Immunodeficiency Virus Sivmne, J. Virol. (1988), In Press).
  • Beispiel I Synthese:
  • Die Proteasen von 99 Aminosäureresten (99 mere), PR-1 und PR-2, wurden durch ein Festphasenverfahren in einem Peptidsynthesizer Model 430A von Applied Biosystems hergestellt. Das Harz und die geschützten Aminosäuren wurden von Applied Biosystems bezogen. Schutzgruppen für Seitenketten waren Benzylgruppen (Bzl) für Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin und Threonin, 4-Methylbenzylgruppen für Cystein, Tosylgruppen für Arginin und Histidin, 2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppen für Lysin, 2-Brombenzyloxycarbonylgruppen für Tyrosin und Formylgruppen für Tryptophan. Die tert-Butoxycarbonyl (Boc)-Gruppe schützte die α-Aininogruppe. Die Synthese begann mit der Boc-Carboxyl-Aminosäure, die an einem Phenylacetamidmethylharz immobilisiert war. Das Programm des Apparats wandelte die Aminosäuren unmittelbar vor dem Kupplungsschritt in die symmetrischen Anhydride um. Arginin, Asparagin und Glutamin wurden unter Verwendung von 1- Hydroxybenzotriazol doppelt gekuppelt. Nach Abschluß sämtlicher Kupplungsschritte wurde das Peptid-Harz in einem Exsiccator getrocknet. 0,3 g wurden anschließend 2 Stunden bei 0ºC mit 0,75 ml p-Kresol, 0,25 ml p-Thiokresol, 6,5 ml Dimethylsulfid und 2,5 ml Fluorwasserstoff in einem Teflonapparat umgesetzt, wobei mit einem Magnetrührer gerührt wurde, die Lösungsmittel anschließend im Vakuum entfernt, das Gemisch mit Ether extrahiert und mit Stickstoff getrocknet. In einem zweiten Schritt wurden die Schutzgruppen durch eine einstündige Behandlung mit 0,6 ml p-Kresol und 9 ml Fluorwasserstoff entfernt. Die Lösungsmittel wurden erneut im Vakuum entfernt, das Gemisch filtriert, mit Ether gewaschen und mit Stickstoff getrocknet.
  • Peptide von unterschiedlicher Länge, die den natürlichen Spaltstellen entsprechen, die in retroviralen gag-Polyproteinen vorhanden sind, wurden synthetisiert und gemäß publizierten Verfahren gereinigt (Copeland und Oroszlan (a. a. O.) und T. D. Copeland et al., "Envelope Proteins of Human T Cell Leukemia Virus Type I: Characterization by Antisera to Synthetic Peptides and Identification of a Natural Epitope: The Journal of Immunology Bd. 137 Nr. 9 (1. November 1986), 2945-2951).
  • Das synthetisierte Peptid ist linear und als proteolytisches Enzym nicht aktiv. Nach der Entfernung der Schutzgruppen mußte daher die Protease in ihre natürliche stereospezifische Konformation umgewandelt werden, damit sie eine proteolytische Aktivität zeigte. Die produzierte synthetische HIV-Protease wurde mit einer starken Säure extrahiert. Sie mußte anschließend einer Behandlung und Reinigung unter Verwendung von spezifischen Puffersystemen und einer Dialyse unterzogen werden. Anschließend wurde durch Ausprobieren versucht, das Peptid zu renaturieren und durch erneute Faltung wieder in seine natürliche stereospezifische Konformation zu bringen. Dies wurde durchgeführt, indem es in einer Guanidinhydrochloridlösung aufgenommen und konzentriert wurde, alle gelösten Bestandteile entfernt wurden und es in einer wäßrigen Lösung aufgenommen wurde. Die richtige Faltung wurde nach mehrmaligem Ausprobieren erreicht. Die richtige Faltung des Peptids ist das Ergebnis von intra- und intermolekularen Kräften und Bindungen und der Eigenschaften der Medien, in denen sich das synthetische Protein befand.
  • Reinigung und Renaturierung der synthetischen Protease:
  • 25 mg des Harzes sowie das Peptidgemisch, das die synthetische Protease von 99 Aminosäuren enthielt, wurden mit 6 M Gnd-HCl, das in Tris-HCl bei einem pH-Wert von 8,0 gelöst war, extrahiert. Die PR-1-Lösung enthielt außerdem das Reduktionsmittel Dithiothreit (DTT). Im Verfahren zur Reinigung von PR-2 wurde DTT nicht verwendet. Die partielle Reinigung wurde durch Gelpermeationschromatographie auf G- 25-Sephadex (Pharmacia) erreicht. Die Fraktionen des Ausschluß-Peaks wurden gesammelt und zunächst bei 4ºC in Tris- HCl-Puffer dialysiert. Die Fraktionen wurden anschließend gegen NP-40-enthaltenden Pipes-Puffer, der mehrfach ausgetauscht wurde, bei einem pH-Wert von 7,0 mit oder ohne DTT dialysiert (R. Hafenrichter & H. J. Thiel, "Simian Sarcoma Virus-Encoded gag-Related Protein: In Vitro Cleavage by Friend Leukemia Virus-Associated Proteolytic Activity" Virology 143 (1985), 143-152).
  • Gegen die synthetische PR-1-Protease von 99 Aminosäuren wurde auch ein Antikörper hergestellt. 0,1 mg Rohpeptid wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und komplettem Freundschem Adjuvans vermischt und anschließend subcutan an ein "New Zealand white"-Kaninchen an mehreren Stellen auf dem Rücken verabreicht. In Abständen von zwei Wochen wurden mit 0,1 mg in inkomplettem Freundschem Adjuvans Auffrischungsimpfungen durchgeführt. Nach einem Monat wurde dem Tier in Abständen von zwei Wochen Blut entnommen. Positive Antiseren gegen PR-1-99-mere wurden erhalten. Dieser Antikörper zeigte mit PR-2 eine Kreuzreaktion.
  • Es konnte ein synthetisches Protein erhalten werden, daß eine HIV-spezifische proteolytische Aktivität zeigte. Zum Nachweis der Aktivität des Proteins wurde die synthetische Protease mit natürlichen und mit synthetischen viralen Substraten inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, daß die synthetische HIV-Protease für die charakteristischen Spaltstellen spezifisch war. Es wurden im wesentlichen die von Copeland und Oroszlan (a. a. O.) beschriebenen Testverfahren mit synthetischen Substraten verwendet.
  • Beispiel II Proteasetests:
  • Synthetische Peptide, die den Spaltstellen in verschiedenen gag-Vorläufern entsprachen, wurden in verschiedenen Pufferlösungen bei unterschiedlichen pH- Werten mit PR-1 und PR-2 inkubiert und Aliquots nach verschiedenen Zeiträumen entnommen. Um festzustellen, ob die Substrate gespalten worden waren, wurden 50 Microliter gesättigtes Gnd-HCl und zur Verringerung des pH-Wertes auf 2 TFA zugesetzt. Die Inhalte wurden anschließend auf eine u- Bondapak C18-Säule (Waters) aufgetragen und 30 Minuten mit einem 0,05 % TFA enthaltenden 0 bis 40 % CH&sub3;CN-Gradienten behandelt. Zwischen jedem chromatographischen Test wurde die Säule mit 60 % CH&sub3;CN gewaschen. Nach einer 20-stündigen Hydrolyse mit 6 N HCl bei 110 Grad im Vakuum wurden die Peaks manuell gewonnen und die Aminosäurezusammensetzung ermittelt. Die Aminosäureanalyse wurde auf einem Pico-Tag - System von Waters durchgeführt.
  • Diese Aktivität ist in Figur 4 dargestellt. Figur 4a zeigt ein synthetisches MuLV-Peptid, das die bekannte proteolytische Spaltstelle enthielt. Figur 4b zeigt das gleiche Peptid nachdem es mit der synthetischen HIV-Protease PR-1 inkubiert worden war. Zwei der Peaks links vom Hauptpeptid zeigen Spaltprodukte des MuLV-Substrats. Die Figuren 4c und 4d zeigen die Spaltung des gleichen Substrats unter Verwendung von zwei anderen Proteasen, Cathepsin D bzw. Renin. Wie aus den Produkten auf der rechten Seite des Substrat-Peaks ersichtlich ist, spalten diese Enzyme das Substrat an unterschiedlichen Spaltstellen.
  • Beispiel III
  • Die Spaltung des synthetischen Peptids SP-78, das einer Undecapeptidsequenz entspricht, die an der Phe-Pro- Spaltstelle im gag-Polyprotein des Maus-Leukämievirus vorhanden ist, ist in Figur 5 dargestellt. Einer geeigneten Menge lyophilisiertem SP-78 wurde das synthetische 99 Aminosäuren aufweisende PR-2 (etwa 100 ng) in der NP-40-enthaltenden Stammlösung zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit Natriumphosphatpuffer auf 6,5 zu einem Gesamtvolumen von 25 ul eingestellt. Das Reaktionsgemisch enthielt eine Endkonzentration von etwa 0,2 M Natriumphosphat, 0,35 % NP-40 und 10 % Glycerin. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur inkubiert und Aliquots unmittelbar nach dem Vermischen (0 Std.), nach 20 Std. und 70 Std. Inkubation entfernt. Substrate und Produkte wurden getrennt und durch HPLC gewonnen. Die in Figur 5 dargestellten chromatographischen Profile zeigen das Substrat und die Spaltprodukte 1 und 2 mit ihren spezifischen Sequenzen. Die Sequenzen wurden durch Analyse der Aminosäuren der Peakfraktionen bestätigt. Diese Ergebnisse lieferten den Beweis, daß die Phe-Pro-Bindung in der gleichen spezifischen Weise, wie durch die virale Protease unter natürlichen Bedingungen, gespalten wurde. Eine mit der Zeit fortschreitende enzymatische Spaltung ist dokumentiert. Die Elutionszeit, die ein gut definierter Parameter in Abhängigkeit von der Peptidzusammensetzung ist, ist für die Produkte 1 und 2 gleich, wie in Figur 4b dargestellt, in der das gleiche Substrat durch PR-1 gespalten wurde. Es ist auffällig, daß das Ausmaß der Spaltung, wie es durch zwei kleinere Peaks links des Substrat-Peaks gezeigt wird, aufgrund der in den anfänglichen Experimenten mit PR-1 verwendeten, weniger günstigen experimentellen Bedingungen viel geringer war.
  • Die Spaltung des synthetischen Peptids SP-258, das einer Phe-Pro-Stellensequenz im HIV-2-gag-Polyprotein entspricht, ist in Figur 6 dargestellt. Die Ergebnisse sind für einen einzigen Zeitpunkt der Inkubation dargestellt, die anschließende Aminosäure-Analyse lieferte jedoch den überzeugenden Beweis, daß eine einzige Bindung an der erwarteten Stelle gespalten worden war. Vgl. die Sequenz des Substrats und der Produkte in Figur 6. Das Substrat und das Enzym (etwa 120 ng) wurden bei Raumtemperatur in NP-40-enthaltendem, niedermolarem Pipes-Puffer bei einem pH-Wert von 7,0 inkubiert. DTT ist zur Spaltung von Cystein-freien Substraten mit PR-2 nicht erforderlich, da dieses Enzym in seiner Struktur kein Cystein enthält.
  • Die nach 15 und 39 Std. Inkubation bei Raumtemperatur erhaltene Spaltung des synthetischen Peptids SP-211, das einer Sequenz der Tyr-Pro-Spaltstelle im HIV-1-gag-Polyprotein entsprach, ist in Figur 7 dargestellt. Etwa 100 ng PR-2 wurden wie im vorstehend beschriebenen Experiment, allerdings mit einer höheren Ionenstärke, verwendet. Der Puffer war 0,2 M Natriumphosphat, bei einem pH-Wert von 6,5, und enthielt außerdem 15 mM Natriumchlorid, 5 % Glycerin und 0,2 % NP-40. Die Inkubation wurde erneut bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Produkt #2, Tetrapeptid Pro-Ile-Val-Gln- Amid eluiert, wie erwartet, vor dem Produkt #1, einem Pentapeptid mit der Sequenz Val-Ser-Gln-Asn-Tyr.

Claims (6)

1. Ein Enzym mit einer für die Keplikation des humanen Immunschwächevirus notwendigen proteolytischen Aktivität, indem gag- und gag-pol-Vorläuferpolyproteine gespalten werden, wobei das Enzym die Aminosäurensequenz umfasst:
2. Ein Enzym mit einer für die Replikation des humanen Immunschwächevirus notwendigen proteolytischen Aktitvität, indem gag- und gag-pol-Vorläuferpolyproteine gespalten werden, wobei das Enzym die Aminosäurensequenz umfasst:
3. Ein Enzym gemäss Anspruch 1, durch synthetische Mittel in einer stereospezifischen Konformation hergestellt, die proteolytische Aktivität verleiht.
4. Ein Enzym gemäss Anspruch 2, durch synthetische Mittel in einer stereospezifischen Konformation hergestellt, die proteolytische Aktivität verleiht.
5. Eine DNA-Sequenz, die für das proteolytisches Enzym gemäss Anspruch 1 codiert.
6. Eine DNA-Sequenz, die für das proteolytisches Enzym gemäss Anspruch 2 codiert.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637488A (en) * 1987-06-01 1997-06-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services HIV protease gene and method for its expression
US5252477A (en) * 1987-06-01 1993-10-12 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Health And Human Services Human immunodeficiency virus specific proteolytic enzyme and a method for its synthesis and renaturation
CA1340748C (en) * 1988-07-13 1999-09-14 Stephen Oroszlan Synthetic hiv protease gene and method for its expression
US5147369A (en) * 1991-07-01 1992-09-15 Wagner Michael A Forceps and method for nuclear fragment removal
US5554728A (en) * 1991-07-23 1996-09-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Lipid conjugates of therapeutic peptides and protease inhibitors
RU2126794C1 (ru) * 1992-03-11 1999-02-27 Нархекс Лимитед Аминопроизводные оксо- или гидроксизамещенных гидразинов, способ их получения и фармацевтические композиции для ингибирования ретровирусной протеазы
US5888992A (en) * 1992-03-11 1999-03-30 Narhex Limited Polar substituted hydrocarbons
ATE253050T1 (de) 1992-03-11 2003-11-15 Narhex Ltd Aminderivate von oxo- und hydroxy- substituierten kohlenwasserstoffen
US6071895A (en) * 1992-03-11 2000-06-06 Narhex Limited Polar-substituted hydrocarbons
US5872210A (en) * 1995-10-05 1999-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transframe peptide inhibitor of viral protease
EP0909322B1 (de) 1996-04-30 2005-11-16 Twinstrand Therapeutics Inc. Antivirale variante von ricin-proteinen
US6531125B1 (en) 1999-03-02 2003-03-11 Twinstrand Therapeutics Inc. Antiviral ricin-like proteins

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5252477A (en) * 1987-06-01 1993-10-12 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Health And Human Services Human immunodeficiency virus specific proteolytic enzyme and a method for its synthesis and renaturation

Also Published As

Publication number Publication date
AU630590B2 (en) 1992-11-05
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