DE3881653T2

DE3881653T2 - Immobilisierte Enzyme und ihre Anwendung in Aminosäure-Elektrosensoren.

Info

Publication number: DE3881653T2
Application number: DE88870163T
Authority: DE
Inventors: Kenneth Matthew Baker; Alain Edmond Baudichau; Pierre Fernand Lardinois; Paul Gerard Unite C I Rouxhet; William Emile Ernest Uni Stone
Original assignee: Monsanto Europe NV SA
Current assignee: Bayer Agriculture BVBA
Priority date: 1987-10-29
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2008-10-29
Also published as: ES2058339T3; EP0318452B1; DE3881653D1; CA1296060C; DK600388D0; US4983510A; EP0318452A1; DK600388A; GB8725333D0; ATE90383T1

Description

Die Erfindung betrifft die Immobilisierung von Enzymen, insbesondere die Immobilisierung von Enzymen. wie etwa L-Methionln-gamma-lyase und L-Lysindecarboxylase. Die Erfindung betrifft ebenso einen Elektrosensor für die Analyse von Aminosäuren in Lösung, umfassend eine pH-ansprechende Elektrode in Kombination mit einem immobilisierten Enzym, welches die Aminosäure mit einer damit verbundenen Änderung des pH der Lösung abbaut.
Immobilisierte Enzyme und deren Rolle in biokatalytischen Reaktionen sind von beträchtlicher technologischer Wichtigkeit. Träger, welche zur Immobilisierung von Enzymen verwendet worden sind, umfassen Polymerlatices. In den meisten Fällen sind die betreffenden Polymeren aus Monomeren oder Comonomeren mit funktionellen Gruppen abgeleitet worden. Beispielsweise beschreibt die US-A-4 064 080 Latices aus Styrolpolymeren mit endständigen Aminophenylthiogruppen zur Immobilislerung von Proteinen; Bahadur et al, Makromol. Chem. (1985), 186, 1387 beschreiben Kern-Mantel-Latices aus Poly(methylmethacrylat-Co-Acrylsäure) mit Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Polymerteilchen sowie die Immobilisierung von alpha-Chymotrypsin auf der Oberfläche der Latexteilchen durch chemische Bindung unter Verwendung eines Carbodiimid- Kupplungsmittels; und Hoshino et al, Kobunshi Ronbunshu, (1985), 42(5), 305 beschreiben die Verwendung von hydrolysierten Styrol-N-Hydroxymethylacrylamld-Copolymerlatices zur Immobilisierung von alpha-Amylase.
Die Verwendung von pH-Sensoren zur Überwachung enzymkatalysierter Zersetzungen ist ebenso in der Literatur beschrieben worden. Beispielsweise berichten Ianniello und Yacynych, Anal. Chim. Acta (1983), 146, 249 über die Verwendung eines Iridiumdioxid-beschichteten Metalls, beispielsweise Titan, als pH-Ansprechelektrode zur Überwachung der Zersetzung von Harnstoff durch Urease. Die Urease wurde durch physikalische Einschließung in einem Poly(vinylchlorid)-Film oder durch kovalente Anlagerung über eine Cyanorsäulechlorid-Verknüpfung auf dem Iridiumoxid immobilisiert.
Fung et al, Analytlcal Chemistry, (1979), 51, 2319 beschreiben eine potentiometrische Enzymelektrode für die Analyse von Methionin in Lösung. Diese wurde hergestellt durch Aufbringen einer Schicht von in Rinderserumalbumin, vernetzt mit Glutaraldehyd, Immobilisierter Methioninlyase auf eine Ammoniakgas-Meßelektrode.
Die nicht-kovalente Bindung von Enzymen an eine Trägeroberfläche ist oft ein reversibler Prozeß, wobei die Glelchgewichtskonzentration an adsorbiertem Enzym eine nicht geeignete Menge sein kann. Weiterhin wird das adsorbierte Enzym häufig zumindest teilweise desaktiviert durch Deformation seiner Struktur durch Bindekräfte. Das Problem der Desaktivierung durch Deformation kann besonders akut sein, wenn Bereiche des Enzyms direkt oder über ein Blidemittel an funktionelle Gruppen auf der Oberfläche des Trägers kovalent gebunden werden. Dies bedeutet, daß das erwünschte Ziel der Immobilisierung eines Enzyms auf einem Träger ohne wesentlichen Verlust seiner Aktivität nur dann erreicht wertden kann, wenn ein hoher Grad an Spezlfltät zwischen dem Enzym, dem Träger und der Weise, in welche diese verknüpft sind, vorliegt.
In früher beschriebenen Biosensoreinrichtungen, welche eine Sensorelektrode in Kombination mit einem Immobilisierten Enzym umfassen, lag das Enzym als Dispersion in einem relativ starren Film aus Polymermaterial auf der Oberfläche der Elektrode oder als kovalent gebundene Beschichtung auf der Oberfläche der Elektrode vor. Die Immobilisierung in einem starren Film bedingt Beschränkungen bezüglich der Zugängigkeit des Substrats für das Enzym und bezüglich der Reproduzierbarkeit solcher Einrichtungen. Die Anwendung einer kovalenten Bindung zur Immobilisierung der Enzyme auf der Elektrodenoberfläche beschränkt die Menge des in dem System verfügbaren Enzyms, wobei beide Verfahren der Immobilisierung die Ansprechgeschwindigkeit der Einrichtung beschränken.
Wir haben gefunden, daß die Enzyme L-Methionin-gamma-lyase und L-Lysindecarboxylase unter hoher Enzymaktivität-Beibehaltung auf Polymerteilchen mit definierten Eigenschaften immobilisiert werden können. Die gleichen Polymerteilchen können mit etwas geringerer Wirksamkeit für die Immobilisierung für L-Aspartase und von L-Tryptophanase verwendet werden.
Solche das immobilisierte Enzym tragende Teilchen können in Verbindung mit einer pH-Ansprechelektrode zur Analyse der entsprechenden Aminosäuren in Lösung verwendet werden.
Die Erfindung sieht somit ein Verfahren zur Immobilisierung eines aus L-Methionin-gamma-lyase, L-Lysindecarboxylase, L-Aspartase und L-Tryptophanase ausgewählten Enzyms vor, umfassend das Kontaktieren des Enzyms mit einem Latex aus Polymerteilchen mit einer negativen Oberflächenladung, so daß die elektrophoretische Mobilität des Latex bei der Messung bei pH 7 in 0,01M KNO&sub3; und einer Polymerfeststoffkonzentration von 30 mg/l einen negativen Wert von -2,0 x 10&supmin;&sup8;m²V&supmin;¹sec&supmin;¹ oder weniger aufweist, wobei die Polymerteilchen ebenso eine hydrophobe Oberfläche besitzen, so daß der Kontaktwinkel eines 1 ul-Tropfens destillierten Wassers mit einer durch Trocknen und Verdichten der Latexteilchen gebildeten, ebenen horizontalen Oberfläche 70º oder mehr beträgt.
Die Erfindung umfaßt weiterhin einen Elektrosensor zur Verwendung bei der Analyse einer aus L-Methionin, L-Lysin, L-Asparaginsäure und L-Tryptophan ausgewählten Aminosäure, wobei der Elektrosensor eine pH-empfindliche Elektrode umfaßt, welche in einer Meßzone angeordnet ist, welche Polymerteilchen enthält, die ein entsprechend gewähltes, durch das Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 darauf immobilisiertes Enzym aufweisen, wobei die Teilchen als wäßrige Dispersion oder in wasserdisperglirbarer Form vorliegen.
Der erfindungsgemäße Elektrosensor besitzt gegenüber früher beschriebenen Biosensoren für Enzyme den Vorteil, daß, obwohl das Enzym auf der Oberfläche der Polymerteilchen Immobilisiert ist, die Teilchen selbst mobil oder innerhalb der Meßzone potentiell mobil sind. Der Zugang des Substrats für das Enzym wird dadurch erheblich verbessert im Vergleich mit früheren Systemen, bei denen der Enzymträger selbst immobil ist.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare Latices besitzen beispielsweise eine durchschnittliche Teilchengröße von 0,1 bis 5 um. Bevorzugte Latices besitzen Teilchen mit einer Durchschnittsgröße im Bereich von 0,3 bis 3 um, insbesondere 0,6 bis 1 um. Für bestimmte Anwendungen, einschließlich der Verwendung in dem erfindungsgemäßen Elektrosensor, sind Teilchen mit einer relativ engen Größenvertellung bevorzugt. Teilchen in Latices, welche durch Emulsionspolymerisation von Monomeren hergestellt werden, erfüllen typischerweise diese letzte Anforderung.
Viele Polymere werden durch Emulslons- oder Suspensionspolymerisation eines Monomeren oder von Monomeren unter Verwendung von Persulfat als Komponente des Polymerisationskatalysators hergestellt. Dies ergibt das Vorhandensein einer kleinen Anzahl restlicher ionischer Gruppen, welche aus dem Persulfatkatalysator stammen, beispielsweise -O-SO&sub3;&supmin;, auf der Oberfläche der Latexteilchen. In Abwesenheit kationischer Oberflächengruppen verleihen solche Gruppen auf den Teilchen eine negative Oberflächenladung. Wenn das Monomer oder die Monomeren, aus welchem das Polymer abgeleitet ist, nicht oder im wesentlichen nicht polar ist, sind die restlichen anionischen Gruppen als Folge einer persulfatkatalysierten Polymerisation normalerweise ausreichend, um einen Latex mit einer elektrophoretischen Mobilität innerhalb des beim erfindungsgemäßen Verfahren erforderlichen Bereichs vorzusehen. Gute Ergebnisse sind unter Verwendung von Latices aus Polystyrol und aus einem Copolymer aus Styrol mit einer kleinen Menge eines Carbonsäuremonomeren, beispielsweise Acryl- oder Methacrylsäure, erhalten worden. Wie jedoch gut bekannt ist, copolymerisiert Styrol in verschiedenen Anteilen mit einem breiten Bereich von Comonomeren. Es wird angenommen, daß jeder der beträchtlichen Anzahl solcher Copolymerlatices zur Immobilisierung von Enzymen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, vorausgesetzt. daß die Copolymerteilchen eine negative Oberflächenladung und eine Hydrophobizität, wie oben definiert, besitzen.
Es ist ebenso möglich, die Oberfläche der Latexteilchen zu modifizieren durch Vermischen des Latex mit Lösungen von ionischen oder polaren Substanzen und danach Rückgewinnen und Redispergieren der modifizierten Latexteilchen. Beispielsweise können zu diesem Zweck Lösungen von Metallsalzen, insbesondere Salze von mehrwertigen Metallen, wie etwa Aluminium, Eisen, Titan oder Zink, oder polaren und ionischen Polymere, wie etwa Chitosan, verwendet werden. Die Mengen solcher verwendeten Modifiziermittel und die Bedingungen der Modifizierung sollten so sein, daß die elektrophoretische Mobilität und Hydrophobizität des modifizierten Latex innerhalb der oben spezifizierten Grenzen liegen.
Bevorzugt besitzen Latices zur Verwendung bei der Erfindung elektrophoretische Mobilitätenvon etwa -3,5 bis etwa -6,5, beispielsweise von etwa -4,5 bis etwa -5,5, x 10&supmin;&sup8;m²V&supmin;¹sec&supmin;¹ bei der Messung bei pH 7 in 0,01 M KNO&sub3; und einer Polymerfeststoffkonzentration von 30 mg/l, sowie hydrophobe Oberflächen, so daß der vorgenannte Kontaktwinkel 70º bis 150º, beispielsweise 100º bis 130º, beträgt.
Beim erfindungsgemäßen Elektrosensor liegt das immobilisierte Enzym im Gegensatz zu den Elektrosensoren des Standes der Technik nicht in einem auf der Oberfläche der Elektrode aufbeschichteten, starren Film vor. Es ist jedoch auf eine Meßzone begrenzt, in welcher die pH-Ansprechelektrode angeordnet ist. Bei einer Ausführungsfrom umfaßt der Elektrosensor eine Halbzelle, welche zur Verwendung in Verbindung mit einer äußeren Referenzelektrode angepaßt ist. Die Meßzone befindet sich innerhalb eines Behälters, welcher aus solchen Materiallen aufgebaut ist, daß, wenn der Behälter eine die zu analysierende Aminosäure enthaltende Lösung enthält und von einer solchen umgeben ist, die Latexteilchen mit dem adsorbierten Enzym innerhalb des Behälters zurückgehalten werden, die Aminosäure jedoch in den und aus dem Behälter heraus difundieren kann.
Bei einer anderen Ausführungsform umfaßt der Elektrosensor einen Latexteilchen mit adsorbiertem Enzym enthaltenden Behälter und ist so aufgebaut, daß sowohl die pH-empfindliche Elektrode als auch die Referenzelektrode untergebracht sind.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Analyse einer Aminosäure, umfassend das Einbringen einer die Aminosäure enthaltenden Lösung in die Meßzone eines erfindungsgemäßen Elektrosensors, wobei die Lösung mit einer Referenzelektrode in Berührung steht und die Meßzone ebenso Pyridoxal-5- phosphat als ein Coenzym enthält, Messen der Änderung der Potentialdifferenz zwischen der pH-Ansprechelektrode und der Referenzelektrode während eines festgelegten Zeltintervalls und das Korrellieren dieser Änderung mit der Aminosäuremenge in der Lösung.
In den Zeichnungen zeigt Figur (1) eine Querschnittsansicht durch eine elektrolytische Halbzelle, welche zur Bestimmung einer Aminosäure gemäß der Erfindung verwendet werden kann. Die Figuren 1(b) und 1(c) zeigen Querschnitte von elektrolytischen Zellen, welche für den gleichen Zweck geeignet sind. Die Figuren 2-6 veranschaulichen graphisch verschiedene Ergebnisse, welche in den nachstehend aufgeführten Beispielen erhalten wurden.
Die Halbzelle in Figur 1(a) umfaßt eine im allgemeinen kubische Kammer (1), deren untere horizontale Fläche (2) geschlossen ist. Die Größe ist nicht kritisch, die bei den in den Beispielen beschriebenenVersuchenverwendete Halbzelle besaß jedoch eine Außenabmessung von etwa 2,5cm. Die obere horizontale Fläche (3) besitzt eine Öffnung (4), um einen Zugang zum Inneren der Kammer vorzusehen, und ist zentral an einem zylindrischen Schaft (5) befestigt, innerhalb dessen eine pH-empfindliche Drahtelektrode (6) koaxial mittels einer Packung (7) gehalten wird. Die senkrechten Flächen des Würfels weisen rechteckig ausgeschnittene Bereiche auf, welche mit semipermeablen Membranen (8), welche an den Kanten (9) der senkrechten Flächen des Würfels befestigt sind, bedeckt sind. Die Abmessungen der kubischen Kammer sind nicht kritisch; die bei den nachfolgend beschriebenen Beispielen verwendete besaß eine Außenabmessung von ungefähr 27 mm und eine Wanddicke von etwa 2mm. Sämtliche Konstruktionsmaterialien, mit Ausnahme der Drahtelektrode, sind elektrisch nicht leitend. Es können verschiedene Polymermaterialien, beispielweise Polypropylen, Poly(tetrafluorethylen), Polycarbonate, Acrylnitril-Styrol-Butadlen-Polymermischungen oder Polyamide, verwendet werden. Rislan , bei dem es sich um eine Mischung aus Nylon 11 und Nylon 12 handelt, hat sich als besonders geeignet erwiesen. Die pH-empfindlichen Drahtelektroden umfassen eine Metalloxidbeschichtung auf einem Metalldraht, wobei zahlreiche Kombinationen in der Literatur beschrieben worden sind. Bei der in den nachstehenden Beispielen verwendeten Halbzelle bestand die pH-empfindliche Drahtelektrode aus einem mit Iridiumoxid beschichteten Titandraht mit einer weiteren Außenbeschichtung aus einem Fluorsulfonylcopolymer (siehe US-A-4 536274). Es ist erforderlich, daß die semipermeablen Membranen Latexteilchen zurückhalten, jedoch für Aminosäuren permeabel sind. Membranen aus Celluloseacetat und aus einem Polycarbonatfilm mit einer Porengröße von 0,45 um mit jeweils einer Dicke von etwa 10 um haben sich als geeignet erwiesen.
In den Figuren 1(b) und 1(c) umfaßt jede Zelle einen Behälter (10) mit einem Deckel (11), die beide aus einem Kunststoffmaterial, wie etwa Polypropylen oder Polystyrol, hergestellt sind. Der Behälter weist zweckmäßigerweise eine zylindrische Form auf mit einem typischen Außendurchmesser von etwa 10 mm und einer typischen Höhe von 7 mm. In der Zelle gemäß Figur 1 (b) sind eine pH-empfindliche Drahtelektrode (12) und eine Referenzelektrode (13), typlscherweise ein mit Silberchlorid beschichteter Silberdraht, als Einsätze durch den Deckel (11) hindurch fixiert. Ein Verbindungsteil (14) weist Endverschlüsse (15), welche so ausgelegt sind, daß sie einen Schiebesltz über den oberen Enden der Elektroden (12) und (13) außerhalb des Deckels des Behälters ergeben, sowie eine Leitungseinrichtung (16) auf, um die Endverschlüsse (15) mit einem pH-Meter zu verbinden. Der Deckel kann entfernbar angefertigt sein oder alternativ eine solche Dicke besitzen, welche mittels einer Hohlnadel durchdrungen werden kann, so daß Flüssigkeiten aus einer Spritze in den Behälter eingeführt werden können.
Bei der Zelle in Figur 1(c) besitzt der Deckel (11) zwei Öffnungen (17), welche den Einsatz einer pH-empfindlichen Drahtelektrode (18) und einer Referenzelektrode (19) erlauben, wobei die Elektroden an ihren oberen Enden in eine Scheibe oder einen Stab (20) aus einem elektrischen Isolationsmaterial, welches einen Teil des Verbindungteils (21) bildet, eingelassen sind. Beim Gebrauch der Zelle ist die Scheibe oder der Stab so ausgelegt, daß er auf dem Deckel des Behälters ruht. Das Verbindungsteil (21) ist ebenso mit einer Leitungseinrichtung (22) zur Verbindung der Elektroden mit einem pH-Meter versehen.
Bei den nachstehend beschriebenen Beispielen wurden zwei Latices, Estapor Latex K109 (A) und Estapor Latex PSI 480 (B), welche beide von Rhöne-Poulenc hergestellt werden, verwendet. Jeder wird von den Herstellern als ein Polystyrollatex beschrieben, welcher 10 Gew. -% Feststoffe in Suspension enthält und einen Teilchendurchmesser von ungefähr 0,80 um aufweist, wobei Latex B zusätzlich funktionelle Carboxylgruppen an der Oberfläche enthält.
Verschiedene Eigenschaften der Latices wurden unter Anwendung der Röntgenstrahlen- Photoelektronenspektroskopie (XPS), Infrarot-Spektroskopie (IRS), Mlkroelektrophorese und Kontaktwinkelmessungen untersucht. Um Proben für XPS, IRS und Kontaktwinkelmessungen zu erhalten, wurden die Originallatices durch Zentrifugatlon und zweimalige Resuspension in destilliertem Wasser gewaschen. Das letztendlich erhaltene Sediment wurde gefriergetrocknet.
Für die XPS wurde das Pulver mit einem Spatel in nicht rostende Stahlbehälter (Durchmesser von 8 mm) gepreßt, wobei die Oberfläche mit dem Spatel geglättet wurde. Für Kontaktwinkelmessungen wurden 10 in eine Polyacetalplatte eingehöhlte Bohrungen (Durchmesser von 4mm, Tiefe von 0,3 mm) in gleicher Weise gefüllt. Zur Aufzeichnung von IR-Spektren wurde dickes Papier mit einem Loch von 5 mm Durchmesser als Probenhalter verwendet; das Latexpulver wurde in das Loch gegeben und unter einem Druck von etwa 30 MPa verpreßt.
Die XPS-Spektren wurden mit einem Vacuum Generator ESCA3-Spektrometer, welches mit einem Tracor Northern Signal-Akkumulator unter Verwendung einer nicht monochromatisierten MgK-Quelle (14kV,20mA) gekoppelt war, aufgezeichnet. Die Analysenenergle betrug 50 eV und der Elektronenstartwinkel 45º.
Es wurde davon ausgegangen, daß sämtliche funktionellen Gruppen an der Oberfläche der Latexteilchen angeordnet sind, wobei die quantitative Oberflächenanalyse unter Anwendung der integrierten Oberfläche der Peaks und der empirischen Sensibllitätsfaktoren von Wagner et al. (Surf. Interface Anal., (1981), 3(5), 211-225) und Wagner, (J. Electron Spectrosc. Relat. Phenom., (1983), 32, 99-102) durchgeführt wurde.
Die XPS-Spektren sämtlicher Latices wurden durch den Peak von C1s-Elektronen dominiert, deren Bindungsenergie (BE) bei 285,0 eV eingestellt wurde und als Referenz für die Energieskala diente. Die Spektren zeigten einen S2p-Peak mit einer BE zwischen 168,7 eV und 169,7 eV, welche für (-OSO&sub3;&supmin;)-Gruppen typisch ist. Die Gegenwart solcher Gruppen auf der Oberfläche sämtlicher Latices wurde der Initiierung der Polymerisation durch S&sub2;O&sub8;= zugeschrieben, welches SO&sub4;&supmin;- Reste ergibt; wobei eine -O-SO&sub3;&supmin;-Gruppe an jedem Ende der Polymerkette gebunden verbleibt. Ein O1s-Peakzwischen 532,5 eV und 533,5 eV umfaßte einen Beitrag von Sauerstoff aus -O-SO&sub3;&supmin;-Gruppen und aus Carboxylgruppen.
Die Mittelwerte von Atomkonzentrationsverhältnissen (Cx/Cc) (x = Sauerstoff oder Schwefel) in Latexproben und die berechneten Werte für die Oberflächenkonzentrationen von Sauerstoff- und Schwefelatomen (O) und (S) sind in nachstehender Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Latex Probe
Die Infrarotabsorptionsspektren (2000-1500 cm&supmin;¹) wurden auf einem Perkin Elmer 580 B-Spektrophotometer aufgezeichnet, welches mit einem Data Station-Mikroprozessor ausgerüstet war. Die Intensität des gesamten Spektrums wurde normalisiert durch Einstellen der Extinktion bei 1945cm&supmin;¹ auf einen gegebenen Wert, wodurch die Wirkung von Schwankungen der Pelletdicke eliminiert wird. Der Beitrag der Carboxylgruppen bei 1750-1700 cm&supmin;¹ wurde durch Abziehen des Spektrums eines Polystyrollatex ohne Carboxyl bestimmt. Die berechneten Oberflächenkonzentrationen an Carboxylgruppen (Gruppen nm&supmin;²) waren wie folgt: Latex A, Probe 1, 0,17; Latex B, Probe 1, 0,33; Latex B, Probe 2, 0,4.
Die mikroelektrophoretischen Mobilitäten der Latices wurden mit einem Lazer Zee-Meter 500 (Pen-Kem) in einer rechtwinkligen Polymethylmethacrylatzelle gemessen. Das Gesamtvolumen der eingebrachten Suspension betrug etwa 25 ml. Die angelegte Spannung betrug 30 bis 50 V.
Die elektrophoretischen Mobilitäten wurden bei verschiedenen pH-Werten sowohl in 0,01 M als auch 0,001 M KNO&sub3; bestimmt. Sie wurden ebenso im zehnfach verdünnten L-Methionin-gamma-lyase-Medium (0,01 M in Phosphat) (MGL) und im zweifach verdünnten Lysindecarboxylat-Medium (0,01 M in Phosphat) (LD) bestimmt. Beide Latices waren negativ geladen von pH 3 bis pH 10.
Werte für die elektrophoretische Mobilität (mit einem Unsicherheitsfaktor von ± 0,5 Mobilitätseinheiten *) bei pH 7,0 ± 0,2 sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Medium Latex Probe * 1 Einheit = 10&supmin;&sup8;m²V&supmin;¹sec&supmin;¹
Für die Kontaktwinkelmessungen wurden kleine Tropfen (1 Mikroliter) aus destilliertem Wasser auf die flache horizontale Oberfläche der Proben aufgesetzt. Die Höhe (h) und Breite (w) der Basis des Tropfens wurden auf einem vergrößerten Bild, welches auf einen Schirm projeziert wurde, gemessen. Der Kontaktwinkel (φ) zwischen der Festkörperoberfläche und dem Tangens zu dem Tropfen am Feststoff-Flüssigkeit-Gas-Berührungspunkt wird mittels der Gleichung
∅ = 2 arctan 2h / w
berechnet.
Je größer der Wert ∅ ist, desto hydrophober ist die Oberfläche. Die Ergebnisse waren wie folgt: Latex A, Probe 1, 122º ± 7º; Latex B; Probe 1, 119±4º.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

Diese Beispiel beschreibt die Immobilisierung von L-Methionin-gamma-lyase auf Polymerteilchen und die Verwendung des immobilisierten Enzyms in einem Biosensor zur Bestimmung von L-Methionin.
L-Methionin-gamma-lyase-Lösung wurde von Dr. K. Soda, Institute for Chemical Research, Kyoto University, Uji, Kyoto-Fu 611, Japan, bezogen. Sie besitzt ein Molekulargewicht von etwa 172 000 und besteht aus 4 Untereinheiten mit identischen Molekulargewichten. Sie enthält 4 Mol Pyridoxal 5'-phosphat pro Mol Enzym (Soda et al, Anal. Blochem, 1984, 138, 421-4).
Das Medium der Enzymlösung (Medium M) war 0,1 M Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,2, enthaltend 20 Mikro-M Pyridoxalphosphat, 0,01 % 2-Mercaptoethanol, 1mM EDTA und 2% Ethanol.
Die enzymatlsche Aktivität wurde bestimmt durch Einbringen von 1 ml einer 0,2 M Kaliumphosphat-Pufferlösung, 500 Mikroliter 0,1 M L-Methionin, 100 Mikroliter 0,1 mM Pyridoxalphosphat und 50 Mikroliter Enzymlösung in ein Röhrchen und anschließende Verdünnung mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 2 ml.
Das Röhrchen wurde bei 37ºC während 10 Minuten inkubiert und die Reaktion dann durch Zugabe von 0,25 ml 50%-iger Trichloressigsäure beendet. Nach der Zentrifugation wurde in der überstehenden Flüssigkeit alpha-Ketobutyrat unter Verwendung von 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon bestimmt, wie von Soda, Analytical Biochemistry (1968), 25 228-235 beschrieben. Eine Einheit der Enzymaktivität (U) entspricht der Produktion von 1 Mikromol alpha-Ketobutyrat in 1 Minute.
Die Latices wurden dreimal mit dem oben beschriebenen Medium M gewaschen durch Zentrifugieren und Resuspension, um letztendlich einen Latex zu erhalten, welcher 10 mg Polymer/ml enthält.
Die Adsorption des Enzyms durch den Latex wurde gemessen durch Vermischen von jeweils 0,1 ml Latex und der Enzymlösung und Auffüllen auf ein Volumen von 1 ml durch Zugabe von Medium M in einem Röhrchen mit einem Volumen von 3,5 ml. Die Mischung wurde eine Stunde bei Umgebungstemperatur belassen und dann bei 10&sup4; min&supmin;¹ während 15 Minuten zentrifugiert, wobei ein verdichtetes Pellet aus Latexteilchen im unteren Teil des Röhrchens und eine überstehende Lösung erhalten wurde. Die Aktivität des adsorbierten Enzyms wurde gemessen durch einmaliges Waschen des Pellets mit Medium M, Redispergieren des Pellets in Medium M bis zu einem Volumen von 0,5 ml und danach Bestimmen der Enzymaktivität in der Suspension mittels dem oben beschriebenen Verfahren bezüglich der Originalenzymlösung.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. Die erste Zeile gibt die Zusammenfassung von Ergebnissen mit 18 Proben des Latex, jeweils mit 3,75 mg, an. Die zweite Zeile ist eine Zusammenfassung von Ergebnissen von 2 Proben von jewells 1,75 mg. Die dritte, vierte und fünfte Zelle zeigen die Ergebnisse mit einer Probe von jeweils 1,5 mg, 2,5 mg und 3,75 mg. Latex Träger mg Anfangsaktivität in Lösung Aktivität beim Pellet Aktivität pro mg Träger Probe
Die Verwendung von auf einem Latex gemäß der Erfindung immobilisierter L- Methionin-gamma-lyase in einem Biosensor zur Bestimmung von L-Methionin wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung in Figur 1 (a) untersucht.
Zur Herstellung des immobilisierten Enzyms zur Verwendung der Bestimmung von L-Methionin wurde der oben beschriebene Latex A dreimal mit Wasser durch Zentrifugation und Redispersion gewaschen, wobei sich eine Enddispersion ergab, welche 10 Gew.-% Polymerfeststoffe enthielt. Ungefähr 0,1 mg Enzym wurden zu 700 mg der Enddispersion gegeben und die Mischung 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sie wurde dann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit vom Sedimentpellet dekantiert.
Die Kammer der Halbzelle in Figur 1(a) wurde in eine 10&supmin;³ molare Phosphatpufferlösung bei einer Temperatur von 25 ºC, zusammen mit einer benachbart angeordneten Standard-Calomelelektrode eingetaucht. Die Elektroden wurden mit einem pH-Meter verbunden und die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden aufgezeichnet. Diese Vorgehensweise wurde mit einer Reihe von 10&supmin;³ molaren Phosphatpufferlösungen, enthaltend 10&supmin;&sup4; molares Pyridoxal-5- phosphat und verschiedene Konzentrationen an L-Methlonln, wiederholt. Bei anderen Versuchen wurde die Wirkung der Änderung des pH des Puffers bei einer festen Konzentration (10&supmin;²M) von L-Methionin untersucht. Bei jedem Versuch dieser Reihe wurde ein Pellet aus immobilisiertem Enzym, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, in die Kammer der Halbzelle durch die Öffnung ((4) in Figur 1(a)) nach Eintauchen der Halbzelle in die Lösung eingeführt. Die Potentlildifferenz zwischen den Elektroden vor Einführung des Pellets wurde festgehalten und die Potentialdifferenz wurde in Abständen nach dessen Einführung aufgezeichnet. Die erhaltenen Ergebnissen sind in Figuren 2, 3 und 4 gezeigt.
Figur 2 zeigt die direkte Aufzeichnung der Potentialdifferenz gegenüber der Zeit bei einem Puffer von pH 7 und verschiedenen Konzentrationen an L-Methionin. Figur 3 zeigt die graphische Darstellung der Potentialdifferenz 30 Minuten nach der Einführung des Enzyms gegenüber der Konzentration an L-Methionin mit einem Puffer von pH 7. Figur 4 zeigt die graphische Darstellung der Potentialdifferenz gegenüber der Zeit bei der festgelegten Konzentration an L-Methionin mit Pufferlösungen mit verschiedenen pH-Werten.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von auf Polymerteilchen immobilisierter L-Lysindecarboxylase in einem Biosensor zur Bestimmung von L-Lysin.
Das bei diesen Versuchen verwendete Enzym war L-Lysindecarboxylase Sigma Typ VIII, erhältlich von Sigma Corporation, U.S.A.
Eine Probe des obigen Latex A wurde zentrifugiert und das Sediment in einer Phosphatpufferlösung von pH 6 redispergiert. Die Zentrifugation und Redispersion wurden zweimal wiederholt.
5 ml der Enddispersion, enthaltend 10 Gew.-Feststoffe, wurden mit 4,4 mg L- Lysindecarboxylase vermischt und die Mischung eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Sie wurde dann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit vom Sedimentpellet dekantiert.
Die Kammer der Halbzelle in Figur 1(a) wurde in eine 10&supmin;² molare Phosphatpufferlösung bei pH 5,92 und einer Temperatur von 37 ºC, zusammen mit einer benachbart angeordneten Standard-Calomel Elektrode, eingetaucht. Die Elektroden wurden mit einem pH-Meter verbunden und die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden aufgezeichnet. Diese Arbeitsweise wurde mit einer Reihe von 10&supmin;² molaren Phosphatpufferlösung, enthaltend 10&supmin;&sup4; molares Pyridoxal-5- phosphat und verschiedene Konzentrationen an L-Lysin, wiederholt. Bei jedem Versuch der Serie wurde ein Pellet aus immobilisiertem Enzym, das wie oben hergestellt wurde, in die Kammer durch die Öffnung (4) in Figur 1(a) nach Eintauchen der Halbzelle in die Lösung eingeführt. Die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden vor der Einführung des Pellets wurde festgehalten und die Potentialdifferenz wurde bis zu 20 Minuten nach dessen Einführung aufgezeichnet. Die erhaltenen Ergebnissen sind in den Figuren 5 und 6 gezeigt. Figur 5 zeigt die direkte Auftragung der Potentialdifferenz gegenüber der Zeit bei verschiedenen L-Lysin-Konzentrationen. Figur 6 ist die graphische Darstellung des Werts der Potentialdifferenz 5 Minuten nach der Einführung des Enzyms gegenüber der Konzentration an L-Lysin.

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt die Immobilisierung von L-Aspartase auf Polymerteilchen.
Aus Hafnia alvei (Bacterium cadaveris) extrahierte L-Aspartase wurde von Sigma gekauft. L-Aspartase besitzt ein Molekulargewicht von 180 000, einen isoelektrischen Punkt von 4,8 und einen optimalen pH von 7,8. Das Enzym wurde in einem Phosphatpuffer 0,1 M (KH&sub2;PO&sub4;+K&sub2;HPO&sub4;), pH 7,2, gelöst und In 4 Portionen geteilt, welche bis zu deren Verwendung eingefroren wurden.
Die Analyse der enzymatischen Aktivität basiert auf der folgenden Reaktion:
-OOC-CH&sub2;-NH&sub3;&spplus;-COO&supmin;T&supmin;OOC-CH = CH-COO&supmin; + NH&sub4;&spplus;
L-Aspartat Fumarat
und wird mittels der Fumaratproduktion gemessen. Eine Aktivltätseinheit (U) wandelt 1,0 uMol L-Aspartat in Fumarat pro Minute um.
Die Messung wird durchgeführt durch Einbringen der folgenden Reagentien in eine Quarzzelle (1 cm Lichtweg):
- 1 ml 0,15 M Tris-Puffer, pH 8,5
- 100 ul 0,6 M MgSO&sub4; 7H&sub2;O-Lösung
- 100 ul 3 mM EDTA-Dinatriumsalz-Lösung
- 300 ul 0,5 M L-Aspartat-Substratlösung
- 1,4 ml H&sub2;O,
Inversionsmischen, Zugabe von 100 ul Enzymlösung und Verdünnung, um etwa 0,2 U oder 100 ul resuspendiertes Pellet zu erhalten. Die Inhalte der Zelle werden sofort durch Inversion vermischt und die Zunahme der Extinktion (A*) bei 240 nm gegenüber der Zeit aufgezeichnet.
Es wird eine lineare Zunahme der Extinktion mit der Zeit beobachtet. Die Einheiten der enzymatischen Aktivität in der Zelle werden durch die Formel Zeit
angegeben, wobei 2,53 der Extinktionskoeffizient von Kaliumfumarat (mM&supmin;¹ cm&supmin;¹) und 3 das Endvolumen der Reaktionsmischung (ml) bedeuten.
Der Latex A wurde dreimal mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) durch Zentrifugation und Resuspension gewaschen. Die Adsorption des Enzyms durch den Latex wurde gemessen durch Zugabe eines Teils der Enzymlösung mit einer vorbestimmten Aktivität zu 3,75 ml Latex und Auffüllen des Volumens auf 1 ml durch Zugabe von Pufferlösung. Die Mischung wurde eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen und dann bei 10&sup4;min&supmin;¹ während 15 Minuten zentrifugiert, wobei ein verdichtetes Pellet aus Polymerteilchen und eine überstehende Lösung erhalten wurden. Die Aktivität des adsorbierten Enzyms wurde durch einmaliges Waschen des Pellets mit dem Puffer, Resuspendieren in einem Volumen von 250 ul und dann Anwenden der oben beschriebenen Methode gemessen. Bei nes Phosphatpuffers mit einem pH von 8,0 wiederholt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend wiedergegeben: Aktivität der Anfangslösung (U) Aktivität im Pellet (U)
Die Ergebnisse zeigen, daß eine vergleichsweise kleine Fraktion des Enzyms durch diese Behandlung auf dem Latex adsorbiert wird. Gleichzeitige Bestimmungen der Restenzymaktivität in der überstehenden Lösung und des gesamten adsorbierten Proteins deuteten jedoch darauf hin, daß Proteine, welche bei der handelsüblichen Aspartase Verunreinigungen darstellen, vorzugsweise adsorbiert wurden. Die Zugabe eines zweiten Teils des Latex zu der überstehenden Flüssigkeit läßt einen höheren Wert der Aktivität pro mg Träger für diesen zweiten Teil erwarten.

Beispiel 4

Versuche bezüglich der Adsorption von L-Tryptophanase auf Latex A zeigten, daß Proteine, welche bei dem im Handel gekauften Enzym Verunreinigungen darstellen, verglichen zum Enzym selbst vorzugsweise adsorbiert werden bei Verwendung eines gewaschenen, jedoch sonst unbehandelten Latex. Die Vorbehandlung des Latex mit Aluminiumnitrat verbesserte die Selektivität, ohne jedoch signifikant die Menge an pro Einheit des Trägers adsorbiertem aktiven Enzym zu erhöhen. Die Behandlung mit Aluminiumnitrat zeigte wenig Wirkung auf die elektrophoretische Mobilität des Latex, erhöhte jedoch die Hydrophobizität der Teilchen, wie sich durch eine Zunahme des Kontaktwinkels eines Wassertropfens mit einer durch Trocken und Verdichten der Latexteilchen gebildeten Oberfläche von etwa 125º auf etwa 163º, zeigt.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung eines aus L-Methionin-γ-lyase, L-Lysindecarboxylase, L-Aspartase und L-Tryptophanase ausgewählten Enzyms, umfassend das Kontaktieren des Enzyms mit einem Latex aus Polymerteilchen mit einer negativen Oberflächenladung, so daß die elektrophoretische Mobilität des Latex bei der Messung bei pH 7 in 0,01M KNO&sub3; und einer Polymerfeststoffkonzentration von 30 mg/l einen negativen Wert von -2,0 x 10&supmin;&sup8;m²V&supmin;¹sec&supmin;¹ oder weniger aufweist, wobei die Polymerteilchen ebenso eine hydrophobe Oberfläche besitzen, so daß der Kontaktwinkel eines 1 ul-Tropfens destillierten Wassers mit einer durch Trocknen und Verdichten der Latexteilchen gebildeten, ebenen horizontalen Oberfläche 70º oder mehr beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die negative Oberflächenladung der Latexteilchen derart ist, daß der Latex eine elektrophoretische Mobilität von etwa -3,5 bis etwa -6,5 x 10&supmin;&sup8;m²V&supmin;¹sec&supmin;¹ besitzt und der Kontaktwinkel 70 bis 150º beträgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei der durchschnittlichen Teilchendurchmesser des Latex etwa 0,6 bis etwa 1,0 um beträgt.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Polymerlatex ein Latex ist, welcher durch Emulsionspolymerisation eines Monomeren oder von Monomeren unter Verwendung eines Persulfat-Polymerisationskatalysators hergestellt ist, und wobei die negative Oberflächenladung zumindest teilweise auf die Gegenwart restlicher ionischer Gruppen, welche von dem Persulfat stammen, zurückzuführen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Polymer Polystyrol oder ein Copolymer von Styrol mit einem oder mehreren Comonomeren mit einer Null- oder negativen Polarität ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polymer ein Copolymer von Styrol mit einem Carbonsäuremonomer ist.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Immobilisierung von L-Methionin-γ-lyase oder L-Lysindecarboxylase, wobei die negative Oberflächenladung der Latexteilchen derart ist, daß der Latex eine elektrophoretische Mobilität von etwa -4,5 bis etwa -5,5 x 10&supmin;&sup8;m²V&supmin;¹sec&supmin;¹ aufweist und wobei die Hydrophobizität der Polymerteilchen derart ist, daß der Kontaktwinkel 100 bis 130º beträgt.

8. Elektrosensor zur Verwendung bei der Analyse einer aus L-Methionin, L- Lysin, L-Asparaginsäure und L-Tryptophan ausgewählten Aminosäure, wobei der Elektrosensor eine pH-empfindliche Elektrode umfaßt, welche in einer Meßzone angeordnet ist, welche Polymerteilchen enthält, die ein entsprechend gewähltes, durch das Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 darauf immobilisiertes Enzym aufweisen, wobei die Teilchen als wäßrige Dispersion oder in wasserdispergierbarer Form vorliegen.

9. Elektrosensor nach Anspruch 8, wobei die pH-empfindliche Elektrode eine Metall/Metalloxid-Elektrode ist.

10. Elektrosensor nach Anspruch 9, wobei die pH-empfindliche Elektrode Irdiumoxid auf Iridium oder Titan umfaßt, und wobei das Iridiumoxid eine Beschichtung aus einem Perfluorsulfonat-Polymer aufweist.

11. Verfahren zur Analyse einer aus L-Methionin, L-Lysin, L-Asparaginsäure und L-Tryptophan ausgewählten Aminosäure, umfassend das Einbringen einer die Aminosäure enthaltenden wäßrigen Lösung in die Meßzone eines Elektrosensors nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 10, welcher das entsprechend gewählte Enzym auf den Polymerteilchen in immobilisierter Form aufweist, wobei die Lösung mit einer Referenzelektrode in Berührung steht und die Meßzone ebenfalls Pyridoxal-5-phosphat als ein Coenzym enthält, Messen der Änderung der Potentialdifferenz zwischen der pH-Ansprechelektrode und der Referenzelektrode während eines festgelegten Zeitintervalls und das Korrelieren dieser Änderung mit der Aminosäuremenge in der Lösung.