DE3878750T2

DE3878750T2 - Verfahren zur Trennung von Aminosäure.

Info

Publication number: DE3878750T2
Application number: DE88401482T
Authority: DE
Inventors: Michel Louis Andre Flork
Original assignee: Flork Lab SA
Current assignee: Flork Lab SA
Priority date: 1987-06-16
Filing date: 1988-06-15
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 2008-06-16
Also published as: IN167394B; EP0296937A1; DE3878750D1; JPH02500592A; CA1334423C; FR2616782B1; WO1988010248A1; ATE86243T1; BR8807092A; EP0296937B1; FR2616782A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung einer Mischung von insbesondere aus der Säurehydrolyse von Proteinen stammenden Aminosäuren mittels Ionenaustauscherharzen.
Es ist seit langem bekannt, anionische oder kationische Harze, d.h. Anionen- bzw. Kationenaustauscher, zur Trennung von in einer Lösung vorliegenden Aminosäuren zu verwenden, indem man sich ihrer unterschiedlichen isoelektrischen Punkte bedient.
So wird seit 1945 in den Patentschriften US-A-2 386 926 und 2 387 824 von Richard J. Block die Trennung der basischen Aminosäuren Arginin, Lysin und Histidin vorgeschlagen, indem man ein sie enthaltendes Hydrolysat von Proteinen über ein kationisches Harz leitet, das diese Aminosäuren fixiert, und gemäß US-PS 2 480 654 von Merck wird ihre Gewinnung durch Elution mit Ammoniak empfohlen.
Ferner sehen der Artikel von Winters et al. in "Industrial and Engineering Chemistry", 41, Seiten 460-463, und die sich darauf beziehende Stelle in der Arbeit von Greenstein ("Chemistry of the Amino-Acids", Bd. 2, Seite 1.455) die aufeinanderfolgende Passage einer Mischung von Aminosäuren über ein anionisches Harz und dann über ein kationisches Harz vor, um bestimmte dieser Säuren selektiv zurückzuhalten; aber keines der beiden Dokumente des Standes der Technik beschreibt die Rückführung einer Aminosäuremischung über die gleichen Ionenaustauscherharze noch sieht es diese vor.
Obwohl man schon sehr früh mit Ionenaustauscherharzen beladene Kolonnen verwendete, um ein zahlreiche Aminosäuren enthaltendes Hydrolysat in mehrere Fraktionen aufzuspalten, litten diese Verfahren an einer Anzahl von Schwierigkeiten, die deren Verwendung in industriellen Maßstab verboten.
Tatsächlich fixieren die Säulen eine bestimmte Aminosäure nur teilweise und lassen einen nicht vernachlässigbaren, als Leck bezeichneten Anteil passieren; bei der gegebenen Nähe der Aziditätskonstanten von Säure-Base-Paaren, die in die Aminosäurezusammensetzung eintreten, ist die Trennung einer Aminosäure von anderen Aminosäuren nie ganz vollständig; ferner sind die Verhältnisse der pro Volumen Ionenaustauscherharz fixierten Aminosäure nicht ausreichend, um ihre Verwendung außerhalb eines Laboratoriums ins Auge zu fassen, und bestimmte in Wasser sehr wenig lösliche Aminosäuren, wie Cystin, kristallisieren in den Säulen.
Es sind nur Teilfortschritte erzielt worden, um die Fraktionierung einer Aminosäuremischung mittels Harzen zu verbessern.
So präzisiert z.B. die 1985 veröffentlichte DE-C-3 326 633 der Kali-Chemie Arbeitsweisen, durch die man aus einem auf einem schwachen anionischen Harz neutralisierten Hydrolysat von Proteinen eine Fraktion Arg-Lys-His durch Passage über ein starkes kationisches Harz oder eine Fraktion Arg-Lys ohne His durch Passage nur eines Teils des neutralisierten Hydrolysates, nämlich des Teils, der die Neutralisationssäule bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 verläßt, extrahieren kann.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die wesentlich vollständigere Abtrennung von Aminosäuren aus einer sie enthaltenden Mischung, indem man die Möglichkeiten der Fixierung bestimmter Säuren durch Passage dieser Mischung über eine Reihe von Säulen maximal ausnutzt, die mit einem absorbierenden Material ohne Ionenaustauscheigenschaften oder mit Ionenaustauscherharzen gefüllt sind, wobei der Ausgangslösung, die die Mischung der zu trennenden Aminosäuren enthält, keine außeren Reagenzien zufügt werden.
Nach der als Perkolation bezeichneten Passage der die Aminosäuremischung enthaltenden wäßrigen Phase über die Säule, die ein Produkt enthält, das einen Teil derselben zurückhält, ist die Zusammenseztung der Mischung verändert, und zwar ebenso bezüglich ihrer Ionenkraft als auch bezüglich ihrer basischen und sauren Bestandteile, die entsprechend ihres pH-Wertes ein Puffermedium bilden können oder nicht.
Nicht nur bezüglich der Wahl der in den Säulen enthaltenen Materialien, über die die zu behandelnde Ausgangslösung läuft, sondern auch bezüglich der verschiedenen Passagen dieser Lösung über diese Säulen hat man durch Versuche ein Verfahren gefunden, daß die aufeinanderfolgende Trennung, als Gruppe oder einzeln, der Gesamtheit der Aminosäuren zuläßt, die in die Zusammensetzung der Anfangslösung eintreten.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Trennung von Aminosäuren in Mischung in einer wäßrigen Lösung mittels Ionenaustauscherharzen, indem man die Lösung über eine Säule eines anionischen Harzes und dann über eine Säule eines kationischen Harzes leitet oder umgekehrt.
Es ist gekennzeichnet durch mindestens eine erneute Passage der Lösung über das gleiche Paar der gleichen Säulen, die in der gleichen Reihenfolge angeordnet sind, und durch die Tatsache, daß die aufeinanderfolgenden Passagen über die Säulen ohne irgendwelche Zugabe neuer Substanzen erfolgen, wobei die Schaffung der selektiven Wirkung einer Säule nur durch die Modifikation der Zusammensetzung der Lösung entsteht, die durch den Ionenaustausch über der Antagonistensäule herbeigeführt wurde.
Anders ausgedrückt, besteht das erfindungsgemäße Verfahren in dem aufeinanderfolgenden Hindurchführen der Lösung der Mischung der zu trennenden Aminosäuren über eine mit anionischem Harz gefüllte Säule und über eine mit kationischem Harz gefüllte Säule und dann erneut mindestens einmal über die gleiche Säule des anionischen Harzes und schließlich über die gleiche mit dem kationischen Harz gefüllte Säule.
Gemäß einer anderen Ausführungsform umfaßt dieses Vefahren auch die vorangehende Passage der Lösung der Mischung der zu trennenden Aminosäuren über die in Reihe angeordneten Säulen, die aufeinanderfolgend mindestens eine mit absorbierendem Material gefüllte Säule, dann mindestens eine mit anionischem oder kationischem Harz gefüllte Säule und schließlich mindestens eine mit kationischem Harz gefüllte Säule umfassen, wenn die vorhergehende Säule mit anionischem Harz gefüllt ist, oder, im Gegensatz dazu, eine mit anionischem Harz gefüllte Säule, wenn die vorhergehende Säule mit kationischem Harz gefüllt ist, wobei die Gesamtheit der über die erste Säule geführten Lösung der Zufuhr der folgenden Säule dient und so weiter.
Gemäß einer anderen Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Verfahren darin, daß man mindestens eine und vorzugsweise jede der Säulen, die die Lösung der Mischung der zu trennenden Aminosäuren aufnehmen, einer vorherigen Behandlung mit einem Oxidationsmittel unterwirft, ob es sich nun um eine mit absorbierenden Material gefüllte Säule oder um eine mit anionischem oder kationischem Harz gefüllte Säule handelt.
Mit Blick auf die vorliegende Beschreibung versteht man unter einem absorbierenden Material ein solches, das in Form von Teilchen mit großer aktiver Oberfläche vorliegt, die die physikalische Absorption fluider Produkte, mit denen die Oberfläche in Kontakt kommt, begünstigen und die keine Ionenaustauscheigenschaften zeigen, wie z.B. granulierte Aktivkohle; unter einem anionischen Harz versteht man ein Anionenaustauscherharz, das somit aus Kationen besteht, z.B. stark basische quaternäre Ammoniumharze oder schwach basische tertiäre Aminharze; und schließlich versteht man unter einem kationischen Harz ein Kationenaustauscherharz, das somit aus Anionen besteht, z.B. stark saure Harze, wie die Phenylsulfon- oder Methylensulfonsäure, oder Harze schwacher Säuren, wie die Carbonsäuren, oder die Phenole.
Die Verwendung mindestens einer mit einem absorbierenden Material gefüllten Säule stromaufwärts eines Systems, das mindestens zwei Ionenaustauschersäulen umfaßt, von denen eine mit anionischem Harz und die andere mit kationischem Harz gefüllt ist, stellt ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung dar.
Tatsächlich wurde gefunden, daß im Verlauf dieses ersten Schrittes aufeinanderfolgender kontinuierlicher Perkolationen der Mischung der zu trennenden Aminosäuren die am Kopf der Anordnung angebrachte Säule oder die Säulen des absorbierenden Materials nicht nur aromatische Aminosäuren, wie Tyrosin und Phenylalanin, zurückhalten, sondern auch die spätere Fixierung wesentlicher Aminosäuremengen auf den mit Ionenaustauscherharzen gefüllen nachfolgenden Säulen zulassen, wie es im folgenden genauer erläutert wird.
Nach ihrer Passage über die mit absorbierendem Material gefüllte Säule läuft die wäßrige Lösung der Mischung der zu trennenden Aminosäuren dann über eine mit kationischem Harz gefüllte Säule und dann über eine mit anionischem Harz gefüllte Säule, wenn diese wäßrige Lösung basisch ist; dies ist insbesondere bei Zuckersäften der Runkelrübenindustrie der Fall; im Gegensatz dazu läuft sie zuerst über eine mit anionischem Harz gefüllte Säule und dann über eine mit kationischem Harz gefüllte Säule, wenn diese wäßrige Lösung sauer ist, wie dies insbesondere bei Flüssigkeiten aus der Hydrolyse von Proteinen der Fall ist.
In diesem letzteren Fall hält die Säule bzw. halten die Säulen der kationischen Harze die dann am Ende der Anordnung arbeiten, basische Aminosäuren, wie Arginin, Lysin und Histidin, zurück.
Nach der Entfernung der ersten oder vorzugsweise dieser beiden Gruppen von Aminosäuren aus der zu trennenden Mischung führt man dann im zweiten Schritt des erfindungsgemaßen Verfahren die Eliminierung von in Wasser wenig löslichen Aminosäuren, wie Cystin, durch, das möglicherweise spätere Fraktionierungsvorgänge stört; diese Eliminierung erfolgt durch jede dem Fachmann geläufige Maßnahme, wie Ausfällung, Kristallisation, Filtration oder Konzentration, gefolgt von einem Kühlen.
Im dritten Schritt unterzieht man die Lösung, die von Fraktionen aromatischer und basischer Aminosäuren und der Fraktion von wenig löslichem Material, das im wesentlichen aus Cystin besteht, befreit ist, einer neuen Reihe aufeinanderfolgender Perkolationen über die Säulen.
Um die Fixierung ohne Lecks der in der Lösung verbleibenden Aminosäuren sicherzustellen, muß man in diesem Stadium eine erhöhte Anzahl von Säulenpaaren anionischer und kationischer Harze oder eine Säule verwenden, die mit einer Mischung dieser beiden Harze gefüllt ist, was in industriellem Maßstab undenkbar ist, weil die Regenerierung dieser letzten Säule nicht möglich wäre.
Es wurde gefunden, daß der dritte Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens die Passage der restliche Aminosäuren enthaltenden Lösung zuerst über eine Säule eines Stark anionischen Harzes und dann über eine Säule eines stark kationischen Harzes umfaßt, worauf man diese Doppelperkolation über die beiden gleichen Säulen mindestens einmal wiederholt. Diese Betriebsweise, die in einem Arbeiten im Kreislauf besteht, bei dem jede Passage über eine Säule die Pufferwirkung der Lösung modifiziert, erlaubt die Fixierung der aus Leucin und Isoleucin bestehenden Aminosäuren auf dem Stark kationischen Harz.
Es muß unterstrichen werden, daß eine solche Rückführung der wäßrigen Aminosäurelösung über ein gleiches Paar, das durch eine mit anionischem Harz gefüllte Säule und eine mit einem kationischen Harz gefüllte Säule gebildet wird, ein wichtiges Merkmal ist, das allgemein auf jede Mischung zu trennender Aminosäuren angewendet werden kann.
Diese Vorgehensweise bei der die Lösung im Kreis geführt wird und nacheinander über zwei Säulen läuft, die mit entgegengesetzten Ionenaustauscherharzen beladen sind, erlaubt den Betrieb dieser Säulen mit einer Lösung, deren pH-Wert sich von sehr sauren und sehr basischen Bereichen entfernt, um sich einem Wert nahe der Neutralität zu nähern.
Im Verlauf der aufeinanderfolgenden Perkolationen stabilisiert sich der pH- Wert der Lösung auf einem Pufferwert, der von der Aminosäurezusammensetzung der Lösung abhängt und die Fixierung bestimmter Aminosäuren auf einer dieser Säulen als Funktion ihrer isoelektrischen Punkte erlaubt.
Daher erfolgt eine selektive Extraktion bestimmter Aminosäuren der Mischung ohne Zugabe eines äußerlichen Puffermediums durch Verwendung des inneren Puffermediums, das durch die anderen Aminosäuren gebildet wird, die in der so behandelten wäßrigen Lösung vorliegen.
In einem dritten Schritt läßt man die verbleibende Lösung in der gleichen Weise zuerst über eine Säule eines schwach anionischen Harzes und dann über eine Säule eines stark kationischen Harzes laufen, und man wiederholt diese Doppelperkolationen über diese beiden gleichen Säulen mindestens einmal und stellt fest, daß die anionische Säule dieses zweiten Kreislaufs die Fraktion saurer Aminosäuren, nämlich Asparagin- und Glutaminsäure, fixiert, während die kationische Säule dieses zweiten Kreislaufs die aus Prolein, Glycin, Alanin, Valin und Methionin bestehende Fraktion fixiert, während die so perkolierte Lösung die Fraktion aus Threonin und Serin enthält.
Durch das vorliegende Verfahren wird so die Fraktionierung einer komplexen Mischung von 17 Aminosäuren in 7 unterschiedlichen Fraktionen allein durch Passage der sie enthaltenden wäßrigen Lösung über Säulen ermöglicht, die mit Materialien gefüllt sind, die sie fixieren können, mit Ausnahme der zwischen mehrere Perkolationsschritte eingeschobenen Ausfällungsoperationen von Cystin. Ein solches Verfahren ist in industriellem Maßstab besonders interessant, weil jede derart getrennte Aminosäurefraktion zur späteren Behandlung durch Elution der Säule, die sie zurückgehalten hat, gewonnen und jede Säule durch die dem Fachmann geläufigen Maßnahmen regeneriert werden kann.
Dieses Verfahren ist einerseits ausgezeichnet zur Gewinnung von Aminosäuren geeignet, bei denen die hauptsächlichen Materialien, die sie enthalten, meist in Form relativ geringer Mengen jeder der zu trennenden Aminosäuren vorliegen.
Dies gilt insbesondere für Aminosäuremischungen, die man durch Hydrolyse von Proteinen, wie z.B. Schweineborsten, mit einer starken Säure erhalten hat und die aus dem Verfahren gemäß dem am 27. März 1986 für Michel Flork eingereichten FR-Patent 86 04 441 stammen können.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf eine Lösung aus der Hydrolyse von Proteinen wird nun genauer beschrieben.
Bevor man die die Aminosäuremischung enthaltende Lösung oder das Hydrolysat dem erfindungsgemaßen Verfahren unterwirft, wurde gefunden, daß es sehr zweckmäßig ist, deren pH-Wert und deren Konzentration einzustellen, wobei die gewählten Werte von der Art und Anzahl der Aminosäuren abhängen.
Die besten Ergebnisse erzielt man im allgemeinen mit einer Ausgangsmischung, deren PH-Wert im Bereich von 0,5 bis 2,5 liegt und die eine Aminosäurekonzentration zwischen 30 und 300 g/l hat.
Im Fall eines Hydrolysates von Proteinen muß man häufig ein Lösen und eine partielle Neutralisation durchführen, z.B. mit Hilfe von Kalk und mit Abtrennung der ausgefallenen Salze durch Filtration, Trocknung oder Dekantieren.
Dann kann man die so hergestellte Aminosäurelösung den verschiedenen Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens unterziehen.
Der an sich neue erste Schritt dieses Verfahrens besteht, wie oben ausgeführt, darin, die die Aminosäuremischung enthaltende Lösung einer ersten kontinuierlichen Folge aufeinanderfolgender Perkolationen zu unterziehen. Die erste Säule oder die Säulen dieser Folge sind mit absorbierendem Material gefüllte Säulen, nämlich die Säulen S der Folge, wobei das Material im allgemeinen aus granulierter Aktivkohle besteht. Die Fixierung aromatischer Aminosäuren durch diese Säulen zeigt sich durch vorherige Adsorption von Säureelementen, die z.B. aus der für die Hydrolyse der Proteine verwendeten Säure stammen, auf diesen Säulen S.
Die Gegenwart der Säulen S am Kopf der Anordnung bringt beachtliche technische Vorteile. Sie erlaubt die spätere Fixierung sehr bedeutender Aminosäuremengen auf den nachfolgenden mit Ionenaustauscherharzen gefüllen Säulen bis zu etwa 240 kg/m³. Ferner braucht nur wenig oder überhaupt keine entfärbende Kohle während der abschließenden Reinigung jeder Fraktion oder jeder der abgetrennten Aminosäuren verwendet zu werden.
Diesbezüglich muß unterstrichen werden, daß während dieses ersten Verfahrensschrittes die Rolle der Säulen S nicht nur in der einfachen Klärung oder Reinigung durch Filtration der zu behandelnden Mischung besteht, sondern daß sie wesentlich komplexer ist, weil durch die rein physikalische Absorption bestimmter Bestandteile dieser Mischung durch das absorbierende Material, mit dem diese Säulen gefüllt sind, diese Bestandteile Ionenaustausche mit dem Rest der Mischung durchführen können, obwohl das absorbierende Material selbst keine Ionenaustauscheigenschaften hat.
In diesem ersten Schritt erhält man die besten Ergebnisse, wenn man nicht nur eine Säule S, sondern zwei Säulen S&sub1; und S&sub2;, verwendet, über die die zu behandelnde Lösung nacheinander läuft.
Die stromaufwärts liegende Säule S&sub1; belädt sich schnell bis zu einem Maß, bei dem Lecks nicht mehr vermieden werden können, schützt aber die stromabwärts liegende Säule S&sub2;, die, da sie weniger beladen ist, ihre Wirksamkeit längere Zeit bewahrt, ohne daß Lecks auftreten.
Nachfolgend zu diesen Säulen S ist eine oder sind Paare aus einer stark anionischen, als Säule A bezeichneten Säule und einer kationischen, als Säule C bezeichneten Säule angeordnet. Das Paar arbeitet zusammen, um den pH-Wert zu korrigieren, eine Lösungspufferwirkung zu erhalten und bestimmte Aminosäuren, nämlich basische Aminosäuren, zu fixieren.
Wiederum erhält man die besten Ergebnisse in diesem Stadium, wenn man nicht nur ein Paar der Säulen A-C sondern zwei Säulenpaare A&sub1;-C&sub1;-A&sub2;-C&sub2; verwendet, über die die zu trennende Aminosäuremischung nacheinander läuft.
Schließlich ist es oft interessant, nacheinander mehrere Säulen mit der gleichen Funktion, jedoch von unterschiedlicher Stärke, anzuordnen, z.B. eine neue schwach anionische, als Säule B bezeichnete Säule zwischen der letzten Säule S&sub2; und der ersten Säule A&sub1;
Eine bevorzugte Verfahrensweise für den ersten Schritt des Verfahrens besteht daher, wie im folgenden Beispiel 1, im aufeinanderfolgenden Hindurchführen der zu trennenden Mischung über eine Folge von in Reihe angeordneter Säulen: S&sub1;-S&sub2;-B-A&sub1;-C&sub1;-A&sub2;-C&sub2;.
Der zweite Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist wesentlich, weil die Eliminierung der in Wasser wenig löslichen Aminosäuren, wie Cystin, zur Vermeidung ihrer Kristallisation in den Säulen unabdingbar ist, was die Fraktionierung der verschiedenen Aminosäuren durch Fixierung in den Säulen stören könnte.
Eine einfache Lösung zum Abtrennen von Cystin in diesem Verfahrensstadium besteht im Konzentrieren der enthaltenen waßrigen Phase, z.B. durch Umkehrosmose und Wärmekonzentration, nach der Entfernung aromatischer und basischer Aminosäuren; das Cystin wird dann unlöslich und befindet sich in Suspension, und so kann es, vorzugsweise durch Filtration, leicht gewonnen werden.
Man kann das Cystin jedoch durch jede andere Maßnahme, insbesondere durch Perkolationen entfernen, mit der Maßgabe, daß sie zwischen dem oben definierten ersten und dem dritten Schritt zwischengeschaltet werden.
Der dritte und vierte Schritt, die sich der Cystineliminierung anschließen, erfolgen nach den gleichen Prinzipien wie der erste Schritt durch aufeinanderfolgende Passagen der den Rest der zu trennenden Aminosäuren enthaltenden Lösung über eine Reihe von Säulen.
Am Kopf der Anordnung können sich die Säulen S zur Fixierung der letzten Mengen aromatischer Aminosäuren befinden, und dann schließen sich die Säulen A-C, möglicherweise im Doppel, an.
Dennoch genügt die Verdoppelung der Säulen A-C nicht mehr, um in diesem Stadium die Fixierung ohne Lecks der aus der Mischung zu entfernenden Aminosäuren zu gewährleisten.
Zur Behebung dieses Problems, das in der Vergangenheit die Verwendung von Ionenaustauscherharzen begrenzt hat, läßt man gemäß dem dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens die zu trennende Mischung über eine Säule A, dann über eine Säule C laufen und wiederholt diesen Vorgang mehrere Male mit den gleichen Säulen A und C, die im Kreislauf arbeiten.
Im Verlauf dieser Rückführung der Lösung, die über ein Paar der Säulen A-C im Kreis läuft, modifiziert jede Passage über eine dieser Säulen die Zusammensetzung oder den pH-Wert der Lösung und damit die Wirkung der anderen Säule.
So erhält man die Fixierung der aus Leucin und Isoleucin bestehenden Aminosäurefraktion auf der Säule C des Paares A-C.
Eine solche Arbeitsweise im Kreislauf erlaubt das Abziehen der Lösung im Behandlungsverlauf an irgendeinem Punkt ihres Kreislaufes.
In diesem Verfahrensstadium sind die letzten Säurereste, die insbesondere aus der Säurehydrolyse der Proteine stammen können, eliminiert, und man kann nun den vierten Verfahrensschritt durchführen.
Wie bereits erwähnt, besteht dieser vierte Schritt darin, die Lösung über eine schwach anionische Säule B und dann über eine kationische Säure C zu führen und das Verfahren mehrmals zu wiederholen, um die sauren Aminosäuren Asp-Glu auf der ersten und die Fraktion Pro-Gly-Ala-Val-Met auf der zweiten dieser Ionenaustauscherharzsäulen zu fixieren, wodurch nur die Aminosäuren Thr und Ser in Lösung verbleiben.
Um die Aminosäuren oder Aminosäurefraktionen zu gewinnen, die im Lauf der verschiedenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in den Säulen zurückgehalten werden, eluiert man diese Säulen und regeneriert sie dann.
Um die Überführung des Verfahrens in den industriellen Maßstab zu erleichtern, sollten die Nachteile behoben werden, die aus der Erzielung bestimmter Fraktionen in stark verdünnten Lösungen stammen.
Dies gilt insbesondere, wenn die Elution und die Regeneration der Säulen S in einem einzigen Arbeitsgang durch Passage eines basischen Mittels über die Säule erfolgt, weil die erhaltenen Regenerate zuerst neutral sind und dann basisch werden und der größte Teil der in diesen Säulen zurückgehaltenen aromatischen Aminosäuren in diesen basischen Regeneraten in zu starker Verdünnung eluiert ist.
Erfindungsgemäß erfolgt die Elution-Regeneration einer Säule S&sub1;, indem man als Elutionsmittel die basischen Regenerate verwendet, die aus einer vorhergehenden Elution-Regeneration einer anderen Säule S&sub2; stammen.
Eine solche Vorgehensweise erreicht das fortschreitende Konzentrieren der Lösung der neutralen Regenerate der aromatischen Aminosäuren bis zu einem annehmbaren Gehalt.
Die Abtrennung jeder einzelnen Aminosäure aus einer auf einer Säule fixierten Fraktion, die mehrere dieser Säuren erneut zusammenfaßt, kann nach jeder geeigneten Technik erfolgen.
Eine Technik besteht erfindungsgemäß darin, eine oder mehrere Elutionslösungen oder eine oder mehrere Regenerationslösungen in die Säule zu leiten, die aufeinanderfolgende Entfernungen der auf der Säule fixierten Aminosäuren durch Modifikation der inneren Pufferwirkung erlauben, insbesondere durch Ersatz eines sauren Aminosäurepuffermediums durch ein basisches Aminosäurepuffermediums und umgekehrt.
Wie aus dem nachfolgenden Beispiel 2 ersichtlich, kann auf diese Weise eine Säule des kationischen Harzes, die eine Arginin, Lysin und Histidin umfassende Mischung basischer Aminosäuren zurückgehalten hat, eluiert werden, wodurch man Arginin und dann, getrennt, eine im wesentlichen aus Lysin und Histidin bestehende Mischung erhält.
Nach der gleichen Vorgehensweise der Erfindung kann man über eine Säule auch einen Teil der dort fixierten Aminosäuren abziehen, indem man diese Säule an eine Antagonistensäule, z.B. eine kationische Säule an eine anionische Säule, anschließt und dieses Säulenpaar, wie oben erläutert, mit einer geeigneten Elutionslösung im Kreislauf arbeiten läßt.
Andererseits ist auch bekannt, daß man Säulen, die mit absorbierendem Material ebenso wie mit anionischem Harz gefüllt sind, durch Passage einer Sodawaschlauge und abschließendes Spülen mit Wasser zur Eliminierung des Natriums regenerieren kann.
Dennoch ist es schwierig, daß Soda aufgrund seiner Viskosität und seiner Absorption auf den Körnern des absorbierenden Materials oder des Harzes zu eliminieren, und oft ist hierzu ein sehr langes abschließendes Spülen nötig.
Zur Behebung dieses Nachteils kann man erfindungsgemäß den abschließenden Spülvorgang nach der Regeneration einer Säule S oder A oder B durchführen, indem man diese Säule im Kreislauf mit einer Antagonistensäule, nämlich einer mit kationischem Harz gefüllten Säure C, arbeiten läßt, die das Natrium fixiert und so das im Spülwasser enthaltene Natrium eliminiert.
So erfordert eine durch eine Sodawäsche behandelte stark anionische Säule A normalerweise die Passage des 14-fachen ihres Volumens an Wasser während 8 h, um ein Eluat zu erhalten, das weniger als 100 ppm Natrium enthält, während diese gleiche mit einer stark kationischen Säule C verbundene Säule nur die Passage ihres 2-fachen Volumens an Wasser während 4 h benötigt, um ein weniger als 5 ppm Natrium enthaltendes Eluat zu erhalten.
Ein anderes wichtiges Charakteristikum des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Vorbehandlung mindestens einer und vorzugsweise jeder der mit absorbierenden Material (S), anionischem Harz (A oder B) oder kationischem Harz gefüllten Säulen mit einem Oxidationsmittel.
Diese Behandlung besteht im Füllen der zu behandelnden Säule mit einer Mischung einer geeigneten Oxidationsflüssigkeit, z.B. Eau de Javel, oxygeniertem Wasser oder einer Perboratlösung, und im leichten Erhitzen zwecks Einleitung einer exothermen Verbrennung der organischen Verunreinigungen, wobei man das Erhitzen auf eine Temperatur nicht über 50 bis 60ºC begrenzt.
Im Verlauf dieser Oxidation werden außer den Verunreinigungen die Monomerenrückstände, die in den Säulen vorliegen können, unter Bildung von kohlensaurem Gas oxidiert, und man eliminiert die primären Aminfunktionen der anionischen Harze, die die selektiven Ionenaustauscheigenschaften der letzteren stören können.
Dank dieser Vorbehandlung einer Regeneration des Typs Red/Ox, die aus der klassischen Regenerationsbehandlung des pH-Typs von Säulen anionischer oder kationischer Harze und deren abschließender Spülung durch Kreislaufbetrieb mit einer Antagonistensäule stammt, kann man die durch eine solche Säule fixierte Menge einer Aminosäure, wie Arginin, um das Fünffache multiplizieren.
Das gesamte Aminosäuretrennungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen durch die Herstellung von mindestens 10 oder mehr Aminosäuren durch aufeinanderfolgende Entfernung von mindestens sieben Fraktionen aus einem Schwefelsäurehydrolysat von Schweineborsten veranschaulicht.
Das erste Beispiel betrifft den ersten Schritt der kontinuierlichen Perkolation, das zweite die Argininproduktion aus den Ammoniakeluaten der Säule C&sub1;, das dritte die letzte Kreislaufperkolation, das vierte die Abtrennung der Threonin-Serin-Fraktion und das fünfte die Vorbehandlung einer Säule mit einem Oxidationsmittel.

Beispiel 1

Die Hydrolyse von Schweineborsten nach dem in der FR-Patentanmeldung 86 04 441, eingereicht am 27. März 1986 für Michel Flork, beschriebenen Verfahren wird durchgeführt, indem man in einem Bottich eine Schwefelsäurelösung von mindestens 12N auf eine Temperatur von mindestens 100ºC erhitzt und gleichzeitig Schweineborsten und die entsprechende Schwefelsäuremenge zufügt, die zur Neutralisation der Aminfunktionen der aus der Hydrolyse der Proteine aus den Borsten stammenden Aminosäuren nötig ist, wobei die Hydrolyse durch Verdünnen unterbrochen wird.
Der pH-Wert des so erhaltenen Hydrolysates wird durch Kreidezugeabe auf 0,8 eingestellt, und die sich bildenden ausgefallenen Sulfate werden durch ein Bandsperrfilter eliminiert.
Die so neutralisierte Hydrolyselösung wird dann auf Brix 10 verdünnt, was einem Aminosäuregehalt von etwa 150 g/l entspricht.
Der Brix-Index einer Lösung entspricht dem Zehnfachen des Zuckergehaltes, ausgedrückt in g/l, den eine Saccharoselösung in Wasser hätte, die die gleiche Refraktion weißen Lichtes bewirken würde.
Diese Lösung läßt man durch kontinuierliche Perkolation über in Reihe angeordnete Säulen S&sub1;-S&sub2;-B-A&sub1;-C&sub2;-C&sub2; laufen, die alle den durch die FR-Patentanmeldung 85 17 898, eingereicht am 27. Nov. 1985 für Michel Flork, vorgegebenen Anordnungen entsprechen, um einen homokinetischen Fluß sicherzustellen.
Zur Wiederholung eines industriellen Beispiels sind die Dimensionen der zylindrischen Röhren der Säulen: 1,45 m Durchmesser und 3,50 m Höhe, und das Volumen des Beladungsmasterials in jeder Säule beträgt 5 m³.
Die Säulen S&sub1; und S&sub2; sind mit Aktivkohlegranulaten gefüllt, die Säule B mit schwach anionischem Harz, die Säulen A&sub1; und A&sub2; mit stark anionischem Harz und die Säulen C&sub1; und C&sub2; mit stark kationischem Harz.
Nachdem die Säulen vorher durch Passage der Waschlösung im Kreislauf über eine Antagonistensäule regeneriert und gewaschen wurden, läßt man 15 m³ der neutralisierten und verdünnten Hydrolyselösung durch sie hindurchlaufen, die mit 50 m³ Wasser in die Reihe der Säulen eingeführt werden, um am Ausgang 20 m³ Wasser und dann 45 m³ Perkolate (Brix etwa 3) zu gewinnen, die zum Suspendieren des Cystins auf Brix 20 konzentriert werden.
Die Säule S&sub1; wird regeneriert, indem man durch sie nacheinander 9 m³ der aus einer vorhergehenden Regeneration stammenden basischen Regenerate, dann 600 l 2N NaOH und schließlich 12 m³ Wasser hindurchführt, wobei letzteres mit einer Antagonistensäule im Kreislauf läuft. Man erhält zuerst 5 m³ neutrale Regenerate, die die Fraktion Tyr-Phe enthalten, und 16 m³ basische Regenerate, die auf 9 m³ konzentriert werden, um in einem nachfolgenden Regenerationsvorgang verwendet zu werden.
Ein Solches Vorgehen bei der Regeneration der Säule S&sub1; braucht dank der Erfindung nur einmal pro vier Perkolationen durchgeführt zu werden.
Nach dieser Regeneration von S&sub1; können die Säulen S&sub1; und S&sub2; umgestellt werden.
Die Säule C&sub1; wird mit der ersten, auf 20 m³ konzentrierten Hälfte des Eluates aus der vorhergehenden Elution, dann mit 5 m³ 0,5N NH&sub4;OH, dann mit der zweiten, auf 20 m³ konzentrierten Hälfte des Eluates der vorhergehenden Elution und schließlich mit 5 m³ 5N NH&sub4;OH eluiert.
Nach vier Rückführungen gewinnt man die 5N Eluate zur Herstellung von Arginin (vgl. Beispiel 2).
Die Säule wird nach jeder Elution durch Passage der auf 15 m³ konzentrierten sauren Regenerate des vorhergehenden Regenerationsvorganges, dann von 1 m³ 6N H&sub2;SO&sub4; und schließlich von 10 m³ Wasser regeneriert. Am Ausgang gewinnt man etwa 6 m³ Ammoniumsulfatlösung zur landwirtschaftlichen Verwendung und die sauren Regenerate zur Rückführung in den nachfolgenden Regeerationsvorgang.
Nach der Regeneration der Säule C&sub1; können die Säulen C&sub1; und C&sub2; umgestellt werden.
Die Säulen B,A&sub1; und A&sub2; werden in Reihe mit 20 m³ der basischen Regenerate der vorangehenden Regeneration, dann mit 1 m³ 9N NaOH und schließlich mit 10 m³ Wasser regeneriert. Am Ausgang gewinnt man zuerst 11 m³ neutrale Regenerate, die verworfen und zu einer Reinigungsanlage geleitet werden, und dann 20 m³ saure Regenerate, die in den nachfolgenden Regenerationsvorgang dieser Säulen zurückgeführt werden.

Beispiel 2

Nach vier Rückführungen werden die 20 m³ der 5N Eluate der Säule C&sub1; auf 6m³ konzentriert, um Ammoniak zu eliminieren. Die Lösung mit etwa Brix 12 ist bereits mit Arg relativ angereichert, weil der andere Teil der Elution (0,5N) einen beträchtlichen Teil der anderen basischen Aminosäuren Lys und His mitgeführt hat. Es genügt diese 6m³ über die anionische Säule A zu führen, wobei man sie mit 15 m³ Wasser vorwärtstreibt. Die Säule A hält verschiedene Verunreinigungen fest, ebenso wie die Reste von Lys und His. Nach Passage der Säule A wird die Lösung dann bei einer Temperatur von 50ºC auf Brix 50 konzentriert. Das Arg fällt bei Abkühlen aus und braucht nur abfiltriert zu werden, ohne daß ein Entfärbungsmittel zur Erzielung von reinem Arg zugefügt wird.

Beispiel 3

Nach Passage der gemäß Beispiel 1 von Cystin befreiten Lösung über ein im Kreislauf arbeitendes Paar der Säulen A-C gewinnt man eine Lösung von Brix 3 bis 4 in Chargen von 5 m³.
Man läßt diese verschiedenen Chargen über ein Paar der schwach anionischen absorbierenden Säule B und der stark kationischen Säule C laufen, die mit einer Rotationszeit von etwa 1 h pro Kreislauf im Kreislauf arbeiten.
Dieser Vorgang wird drei- oder viermal wiederholt.
Nachdem die Gesamtheit dieser Vorgänge beendet ist, enthält die flüssige Phase keine Sulfationen, und die Sauersten Aminosäuren Asp und Glu sind auf der Säule B fixiert, während die stärker basischen Säuren Pro, Gly, Ala, Val und Met auf der kationischen Säule C zurückgehalten sind und nur The und Ser in den Perkolaten verbleiben.

Beispiel 4

Die Fraktion Thr,Ser von Beispiel 3, die im Perkolat in Lösung ist, wird einfach auf einer absorbierenden Säule eines schwach anionischen Harzes B behandelt, die Thr fixiert und Ser hindurchlaufen läßt.
Dieses Beispiel 4 zeigt die Fähigkeit eines gleichen Ionenaustauscherharzes, gemäß den Eigenschaften der perkolierten Lösung eine unterschiedliche selektive Wirkung auszuüben.
Nach dem ersten Einsatz in der Reihe der Perkolationen von Beispiel 1 hält die Säule B Sulfationen und färbende Bestandteile zurück, läßt jedoch alle Aminosäuren passieren.
Im Kreislauf B-C von Beispiel 3 hält die gleiche Säule B Asp und Glu zurück, läßt jedoch die anderen Aminosäuren, einschließlich Thr, passieren.
Schließlich befindet sich im vorliegenden Beispiel diese gleiche Säule B unter den für das Zurückhalten von Thr beabsichtigten Bedingungen.

Beispiel 5

Dieses Beispiel soll die Vorbehandlung einer Säule mit einem Oxidationsmittel veranschaulichen, die mit absorbierenden Material oder einem Austauscherharz gefüllt ist.
Der wiederholte Einsatz einer solchen Säule bewirkt in der Tat das Zurückhalten von Verunreinigungen, die sich ansammeln und die Wirksamkeit stark beeinträchtigen, durch diese Säule.
Die Moleküle der Verunreinigungen, die im Inneren der Körner des absorbierenden Materials oder des Ionenaustauscherharzes eingeschlossen sind, können nicht mehr entweichen und erfordern den Ersatz der Harzes nach einigen Monaten Verwendung.
Daher ist eine mit neuem quaternärem Ammoniumharz beladene Säule hellgelb und wird nach mehreren Perkolationen dunkelbraun.
Über eine Säule, die 5 m³ Nutzvolumen eines solchen Anionenaustauscherharzes enthält, läßt man 5 m³ einer industriellen Natriumhypochloritlösung einer Chlorometrie von 47,5º laufen, die auf ein Viertel verdünnt war, was eine Chlorometrie von 12º ergibt.
Im Verlauf dieser 1 h dauernden Perkolation erhöht sich die Temperatur auf etwa 60º.
Man eliminiert das Hypochlorit, das in der Säule ruhen kann, indem man anschließend 5 m³ Wasser hindurchlaufen läßt, worauf man die Säule durch eine bekannte Sodawäsche regeneriert und erneut ein Harz von blaßgelber Farbe erhält.
Nachdem man die Säule einer solchen Vorbehandlung mit diesem Oxidationsmittel unterzogen hat, zeigt sie eine Fixierungskapazität für Aminosäuren, die derjenigen der mit neuen Harz beladenen gleichen Säule äquivalent oder sogar überlegen ist, weil letztere immer einige Verunreinigungen und Monomere enthält.
Aus diesem Grund kann es interessant sein, eine Oxidationsvorbehandlung der Säulen gemäß der Erfindung durchzuführen, selbst wenn die Säule mit neuem Harz gefüllt ist.
Es wurde gefunden, daß eine mit Ionenaustauscherharz beladene Säule, die eine solche Behandlung einmal pro 250 Perkolationen erfährt, eine Lebensdauer von 3 Monaten bis zu 7 Jahren hat.

Claims

1. Verfahren zur Trennung von Aminosäuren in Mischung in einer wäßrigen Lösung durch Passage der wäßrigen Lösung über eine Säule eines anionischen Harzes und dann über eine Säule eines kationischen Harzes oder umgekehrt, gekennzeichnet durch mindestens eine erneute Passage derselben Lösung über dasselbe Paar derselben, in derselben Reihenfolge angeordneten Säulen und die Tatsache, daß die aufeinanderfolgenden Passagen über die Säulen ohne irgendwelche Zugabe neuer Substanzen erfolgen, wobei die Entwicklung der selektiven Wirkung einer Säule allein aus der Modifikation der Zusammensetzung der Lösung durch Ionenaustausch über der Antagonistensäule resultiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Passage der Lösung über eine Gesamtheit von Säulen, umfassend die Säulen anionischer Harze und kationischer Harze gemäß Anspruch 1 und fakultativ andere Säulen anionischer oder kationischer Harze oder adsorbierender Materialien, wobei diese aufeinanderfolgenden Passagen dieser Lösung über alle Säulen ohne irgendeine Zugabe neuer Substanzen erfolgen und die Einstellung der selektiven Wirkung einer Säule allein aus der Modifikation der Zusammensetzung der Lösung resultiert, die durch die Wirkung der vorhergehenden Säulen herbeigeführt wurde.

3. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung von Aminosäuren eine wäßrige basische Lösung ist, die insbesondere aus Zuckersäften der Runkelrübenindustrie stammt.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung von Aminosäuren eine wäßrige saure Lösung ist, die insbesondere aus der Hydrolyse von Proteinen stammt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die fragliche saure Lösung zuvor nacheinander über Säulen läuft, die in Reihe angeordnet sind und mindestens eine mit adsorbierendem Material gefüllte Säule, dann eine mit anionischem Harz gefüllte Säule und dann eine mit kationischem Harz gefüllte Säule umfassen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit adsorbierendem Material gefüllte Säule (S) mindestens eine Säule verwendet, die mit granulierter Aktivkohle gefüllt ist und die aromatischen Aminosäuren Tyr und Phe zurückhalten soll.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Passage über mindestens eine mit adsorbierendem Material gefüllte Säure (S) die die Aminosäuren enthaltende Lösung dann über eine Säule eines schwach basischen anionischen Harzes (B), dann über eine Säule eines stark basischen anionischen Harzes (A) und dann über eine Säule eines stark sauren kationischen Harzes (C&sub1;) läuft, um auf dieser letzteren die basischen Aminosäuren Hist, Lys und Arg zurückzuhalten, und sie schließlich möglicherweise erneut über eine zweite Säule eines stark basischen anionischen Harzes (A&sub2;) und eine zweite Säule eines stark sauren kationischen Harzes (C&sub2;) läuft.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man nach den aufeinanderfolgenden Passagen über die mit adsorbierendem Material gefüllte Säule (S) und vorzugsweise auch über die mit Anionenaustauscherharz gefüllten Säulen (A oder B) und Kationenaustauscherharz gefüllte Säule (C) die in Wasser weniger löslichen Aminosäuren, wie Cys, durch jedes bekannte Mittel, insbesondere durch Konzentration und Abkühlen, Ausfällen, Filtrieren oder einfaches Dekantieren, abtrennt.

9. Verfahren nach Anspruch 5 in Kombination mit einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der aufeinanderfolgenden Passage der die Mischung von Aminosäuren enthaltenden Lösung über die mit adsorbierendem Material gefüllte Säule (S), die mit Anionenaustauscherharz gefüllten Säulen (A oder B) und die mit Kationenaustauscherharz gefüllte Säule (C) und der Ausfällung der in Wasser wenig löslichen Aminosäuren die Lösung über eine Säule (A), die mit stark basischem Anionenaustauscherharz gefüllt ist, dann über eine mit stark saurem Kationenaustauscherharz gefüllte Säule (C) leitet und die Passage der Lösung über diese beiden letztgenannten Säulen (A und C) mindestens einmal wiederholt, um die Aminosäuren Leu und Ile auf diesen letzteren zu fixieren.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man anschließend die Lösung über eine mit schwach basischem Anionenaustauscherharz gefüllte Säule (B), dann über eine Säule eines stark sauren Kationenaustauscherharzes (C) leitet und mindestens einmal die Passage der Lösung über diese beiden letztgenannten Säulen (B und C) wiederholt, um die Aminosäuren Asp und Glu auf der ersten (B) und die neutralen Aminosäuren Pro, Gly, Ala, Val und Met auf der zweiten (C) zu fixieren, wobei nur die Aminosäuren Thr und Ser in Lösung verbleiben.

11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die die Mischung von Aminosäuren enthaltende Lösung aus dem Produkt der Hydrolyse von Proteinen durch eine starke Mineralsäure besteht, wobei dieses Hydrolyseprodukt vorzugsweise eine Konzentration zwischen 30 und 300 g/l bei einem pH-Wert zwischen 0,5 und 2,5 hat.

12. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine und vorzugsweise jede der verschiedenen mit adsorbierendem Material (S), mit anionischem Harz (A oder B) oder mit kationischem Harz (C) gefülten Säulen vorher mit einem Oxidationsmittel behandelt wurde, das insbesondere Eau de Javel, oxygeniertes Wasser oder ein Perborat sein kann.