DE3874901T2

DE3874901T2 - Verfahren zur herstellung von einzelstraengigen dna.

Info

Publication number: DE3874901T2
Application number: DE8888102033T
Authority: DE
Inventors: Shuntaro Hosaka; Yasuo Murao
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1987-02-12
Filing date: 1988-02-11
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2008-02-12
Also published as: EP0278513A3; JPS6420088A; EP0278513B1; KR880010128A; EP0278513A2; DE3874901D1

Description

Hintergrund dieser Erfindung

I. Gebiet dieser Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein verfahren zur Herstellung von einzelsträngigen Desoxyribonucleinsäuren (DNA bzw. DNS, nachfolgend als DNS bezeichnet). Die einzelsträngigen DNS sind für die Verwendung von DNS-Proben bzw. -Sonden (nachfolgend als DNS-Proben bezeichnet) geeignet, um die DNS von Interesse zu ermitteln

II. Beschreibung des Standes der Technik

Die Basenfolge von DNS oder Ribonucleinsäure (RNS) ist für einen Virus oder Organismus, der DNS oder RNS enthält, einzigartig. Diese DNS oder RNS hybridisiert sich spezifisch mit einer dazu komplementären DNS oder RNS, um eine doppelsträngige Kette (Hybrid) zu bilden. Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft wurden kürzlich DNS-Proben zur Bestimmung und mengenmäßigen Erfassung von DNS und RNS entwickelt, und das DNS-Proben verwendende Versuchszubehör ist im Handel erhältlich.
Bei der Bestimmung von DNS oder RNS unter Verwendung einer derartigen Probe wird typischerweise eine poröse Nitrozellulose-Membran oder poröse Nylon-Membran als Adsorptionsmittel für die Adsorption von DNS oder RNS verwendet. D. h., daß die Lösung der versuchsprobe zuerst auf der Adsorptionsmittelmembran verteilt oder durch diese hindurchgeleitet wird, um die zu bestimmende DNS oder RNS auf der Membran zu adsorbieren, danach erfolgt das Erwärmen der Membran, um die zu bestimmende DNS oder RNS zu fixieren. Danach wird die Adsorptionsmittelmembran mit einer DNS oder RNS behandelt, z. B. Lachssperma-DNS, die zur bestimmenden DNS oder RNS nicht komplementär ist, damit gesichert ist, daß die Probe nicht unspezifisch auf der Membran adsorbiert wird. Anschließend wird diese Membran mit einer DNS-Probe behandelt, die eine Basenfolge enthält, die zumindest zu einem Teil der zu bestimmenden DNS oder RNS komplementär ist, und die eine bestimmbare Markierung oder funktionelle Gruppe aufweist, die mit dieser Markierung gekennzeichnet werden kann. Wenn die zu bestimmende DNS oder RNS auf dieser Membran vorhanden ist, hybridisiert diese DNS-Probe damit und bildet ein Hybrid. Nach der Behandlung mit dieser Probe wird die Membran gewaschen, um die nicht hybridisierte DNS-Probe zu entfernen. Die Proben, die hybride gebildet werden, werden dann unter Verwendung der Markierung bestimmt, die von der Probe getragen wird oder die in die Probe eingeführt wurde, um die zu bestimmende DNS oder RNS zu erkennen.
Die meisten herkömmlichen DNS-Proben werden aufgebaut, indem die zu bestimmende DNS aus einem Virus, einem Mikroorganismuß oder einer Tier- oder Pflanzenzelle in einem geeigneten Vektor rekombiniert wird, z. B. in einem pBR322-Plasmidvector und M13RF-Phagenvector. Folglich enthalten die meisten herkömmlichen DNS-Proben einen DNS-Bereich, der von diesem Vektor stammt, und sind doppelsträngig. Wenn die DNS-Probe einen DNS- Bereich enthält, der von diesem Vektor stammt und wenn diese Versuchsprobe mit einer DNS vom gleichen Ursprung wie der Vektor verunreinigt ist, wird die Probe mit der DNS- Verunreinigung hybridisiert und ergibt ein unechtes positives Ergebnis. Die herkömmlichen DNS-Proben, die aufgrund des vorhandenseins eines vom Vektor abstammenden DNS-Bereichs groß sind, werden wahrscheinlich nicht spezifisch auf der Membran adsorbiert und erzeugen einen starken Hintergrund, da die DNS mit größerer Wahrscheinlichkeit auf der Adsorptionsmittelmembran adsorbiert wird, je größer das DNS- Molekül ist. Aufgrund der starken Größe der Probe dauert es außerdem lange, damit die Probe mit der zu bestimmenden DNS oder RNS hybridisiert, so daß für diesen Versuch ein langer Zeitraum erforderlich ist. Wenn die Probe doppelsträngig ist, ist die Wirksamkeit der Hybridisierung mit der zu bestimmenden DNS oder RNS gering. Deshalb ist die Probe vorzugsweise einzelsträngig.

Zusammenfassung dieser Erfindung

Die Aufgabe dieser Erfindung besteht folglich in der Schaffung eines Verfahrens zur praktischen und wirksamen Herstellung von einzelsträngiger DNS, die keinen unerwünschten Bereich, wie z. B. den vom Vektor abgeleiteten Bereich enthält, wobei diese einzelsträngige DNS, wenn sie als DNS-Probe verwendet wird, die nicht spezifische Adsorption verringern und die Zeit verkürzen kann, die für die Feststellung der zu bestimmenden DNS oder RNS erforderlich ist.
Beim ersten Schritt dieser Erfindung wird eine einzelsträngige DNS, die einen DNS-Templatbereich enthält, bereitgestellt. Dieses DNS-Templat weist eine Basenfolge auf, die zu der der herzustellenden DNS komplementär ist. Wenn diese einzelsträngige DNS als DNS-Probe verwendet wird, hat der DNS-Templatbereich eine Basenfolge, die durch die Probe bestimmt werden soll. Danach erfolgt am 5'-Endabschnitt des DNS-Templats eine Maßnahme zum Abschluß des Wachstums der zu bildenden DNS-Kette, wobei dieses DNS-Templat in einem späteren Schritt als Templat verwendet wird. Danach wird zumindest ein Primer mit einem Teil des DNS-Templats hybridisiert. Anschließend wird dieses Primer verlängert, wobei das DNS-Templat als Templat verwendet wird. Zum Schluß wird die durch Verlängerung des Primers gebildete einzelsträngige DNS abgetrennt und gewonnen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können einzelsträngige DNS praktisch und effektiv hergestellt werden. Wenn die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte einzelsträngige DNS als DNS-Probe verwendet wird, wird ein irreführendes positives Ergebnis aufgrund der Verunreinigung durch DNS vom selben Ursprung wie der Vektor vermieden, da diese einzelsträngige DNS keinen vom Vektor abgeleiteten Bereich enthält. Da die Größe der einzelsträngigen DNS gering ist, wird darüberhinaus die unspezifische Adsorption an der Adsorptionsmittelmembran verringert. Folglich kann die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte einzelsträngige DNS als empfindliche DNS-Probe verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die Figur stellt eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch dar.

Detaillierte Beschreibung der bevorzuaten Ausführungsformen

Wie oben aufgeführt wurde, wird im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens einzelsträngige DNS geschaffen, die einen DNS-Templatbereich enthält, der eine Basenfolge aufweist, die zu der der herzustellenden einzelsträngigen DNS komplementär ist. Wenn diese hergestellte einzelsträngigen DNS als DNS- Probe verwendet werden soll, hat der DNS-Templatbereich eine Basenfolge, die im wesentlichen die gleiche wie die des Teils der zu bestimmenden DNS oder RNS ist. Die einzelsträngige DNS, die das DNS-Templat enthält, kann z. B. wie folgt hergestellt werden: Wie es in Fig. 1 gezeigt ist, wird der doppelsträngige Vektor (A) zuerst mit einem geeigneten Restriktionsenzym digeriert bzw. aufgeschlossen, um den Vektor (B) abzuspalten. Wie es allgemein bekannt ist, setzen einige Phagenvektoren, wie z. B. die der M13-Reihe und φX174, einzelsträngige kreisförmige DNS aus einer Wirtszelle frei, in der sie in der Replikationsform (RF) vorliegen, so daß ein derartiger Vektor vorzugsweise verwendet werden kann. Auf der anderen Seite wird ein doppelsträngiges DNS-Fragment (C) hergestellt, indem DNS mit dem gleichen Restriktionsenzym getrennt wird, das für die Abspaltung des Vektors verwendet wird. Eine der Ketten des DNS- Fragments (C) ist die DNS, die durch das erf indungsgemäße Verfahren hergestellt werden soll. Wenn die einzelsträngige DNS, die durch dieses erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurde, als DNS-Probe verwendet wird, wird das Fragment (C) folglich von einem Virus, einem Mikroorganismus, einer Tierzelle, einer Pflanzenzelle oder ähnlichem abgeleitet, die bestimmt werden sollen. Danach werden der abgetrennte Vektor (B) und das DNS-Fragment (C) rekombiniert, um einen doppelsträngigen rekombinierten Vektor (D) zu bilden. Dieses Rekombinationsverfahren an sich ist in der Technik allgemein bekannt. Der rekombinierte Vektor wird dann in eine Wirtszelle, wie z. B. eine E. Coli-Zelle übertragen. Dieses Transfektionsverfahren ist ebenfalls in der Technik gut bekannt. Durch Kultur der Wirtszelle wird die einzelsträngige rekombinierte DNS (E) aus der Wirtszelle abgegeben.
Im zweiten Schritt wird am 5'-Endabschnitt des DNS-Templats eine Maßnahme zum Abschluß des Wachstums der zu bildenden DNS- Kette vorgenommen, wobei dieses DNS-Templat in einem späteren Schritt als Templat verwendet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt diese Maßnahme zum Abschluß des Wachstums der DNS-Kette durch Abtrennen des 5'-Endabschnitts des DNS- Templats. Das Wachstum der DNS-Kette wird an der schnittstelle beendet. Das Abtrennen des 5'-Endabschnitts des DNS-Templats kann durchgeführt werden, indem ein DNS-Oligomer zuerst mit dem 5'-Endabschnitt des DNS-Templats hybridisiert wird, um einen doppelsträngigen Abschnitt zu bilden (Fig. 1 (F)) und anschließend der so gebildete doppelsträngige Abschnitt mit einem Restriktionsenzym abgetrennt wird, das im doppelsträngigen Abschnitt eine Restriktionsstelle aufweist (Fig. 1 (G)). Dieses DNS-Oligomer weist vorzugsweise 10 bis 20 Basen und noch bevorzugter 15 Basen auf.
Danach werden ein oder mehrere Primere mit diesem Teil des DNS- Templats hybridisiert (Fig. 1 (H)). Das Primer enthält vorzugsweise 10 bis 20 Basen und noch bevorzugter 15 bis 17 Basen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vielzahl von Primeren hybridisiert. Dies ist bevorzugt, da in einem einzelnen Verfahren eine Vielzahl einzelsträngiger DNS hergestellt werden kann. Wenn eine Vielzahl von Primeren hybridisiert wird, ist es bevorzugt, daß die Primere an Abschnitten mit einem Intervall von 100 bis 1000 Basen, noch bevorzugter 150 bis 500 Basen hybridisiert werden. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß diese Primere an Abschnitten mit im wesentlichen einheitlichen Intervallen hybridisiert werden. Da das Primer zu dem Abschnitt des DNS-Templats komplementär ist, mit dem es hybridisiert wird, muß die Basenfolge zumindest für diesen Abschnitt bekannt sein.
Dann werden das eine Primer oder mehrere verlängert, wobei das große Fragment der DNS-Polymerase I in Gegenwart von vier Arten von Desoxyribonucleosidtriphosphat verwendet wird, und zwar dATP, dTTP, dGTP und dCTP (Fig. 1 (I)). Dieses Wachstumsverfahren ist in der Technik allgemein bekannt. Die durch Verlängerung der Primere gebildeten DNS-Ketten sind die gewünschten DNS.
Abschließend werden die so durch Verlängerung der Primere gebildeten DNS vom DNS-Templat abgetrennt und gewonnen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird diese Abtrennung und Gewinnung der gebildeten einzelsträngigen DNS durch alkalische Gelelektrophorese durchgeführt. Wie es in Fig. 1 (J) gezeigt ist, bedeutet dies, daß eine Kammer durch eine Gelmembran getrennt wird, z. B. durch eine Membran aus Agar-Gel und Acrylamid-Gel. In eine Kammer wird eine Alkalilösung gegeben, die die im vorangegangenen Schritt gebildete teilsweise doppelsträngige DNS enthält. Die Dicke der Gelmembran beträgt vorzugsweise 1-10 mm und noch bevorzugter 2-5 mm. Der Lösung wird eine basische Substanz, wie z. B. NaOH, zugesetzt, um den doppelsträngigen Abschnitt zu denaturieren. Dann wird entlang der Gelmembran eine Spannung angewendet, so daß die negative Spannung auf die DNS-Lösung gebracht wird, damit die Elektrophorese durchgeführt wird. Diese Spannung kann z. B. 50 bis 100 V betragen. Die Dauer der Elektrophorese hängt von der angewendeten Spannung ab und beträgt z. B. 20 Minuten, wenn die Spannung 70 V beträgt. Wie es in Fig. 1 (K) gezeigt ist, wandern die gewünschten einzelsträngigen DNS durch diese Elektrophorese durch die Gelmembran in die andere Kammer, wobei die einzelsträngige DNS, die das DNS-Templat enthält, in der Kammer verbleibt, in die die DNS-Lösung ursprünglich gegeben wurde.
Wenn die durch das erfindungsgemäße Verfahren gebildete einzelsträngige DNS als DNS-Probe verwendet wird, muß die einzelsträngige DNS bestimmbar sein. Die hergestellte einzelsträngige DNS kann durch ein allgemein bekanntes herkömmliches Verfahren gekennzeichnet werden. D. h., daß die hergestellte einzelsträngige DNS mit einer radioaktiven Markierung, einem Enzym, Biotin und ähnlichem gekennzeichnet werden kann. Die hergestellte einzelsträngige DNS kann z. B. mit Photobiotin (im Handel von Biotechnology Research Enterprizes erhältlich) oder Chemiprobe (von Orgenics, Ltd. im Handel erhältlich) behandelt werden. In einer bevorzugteren alternativen Ausführungsform wird Desoxyribonucleosidtriphosphat mit einer Markierung, z. B. einer radioaktiven Markierung, einem Enzym, Biotin und Hapten, oder einer funktionellen Gruppe, wie z. B. einer Aminogruppe oder einer Carboxylgruppe, an die die Markierung, wie Hapten, Biotin und Enzym später angebracht werden kann, für die Verlängerung des Primer verwendet. Wenn mit einer Markierung gekennzeichnetes Desoxyribonucleosidtriphosphat für die Verlängerung des Primers verwendet wird, wird folglich die hergestellte einzelsträngige DNS mit dieser Markierung gekennzeichnet. Wenn Desoxyribonucleosidtriphosphat mit einer funktionellen Gruppe, an die die Markierung angebracht werden kann, verwendet wird, kann die hergestellte einzelsträngige DNS leicht mit einer Markierung gekennzeichnet werden. In Anbetracht der Tatsache, daß die Verlängerung des Primers durch das Vorhandensein der Markierung nicht gehindert wird, ist es bevorzugt, daß das Desoxyribonucleosidtriphosphat eher eine funktionelle Gruppe aufweist, an die die Markierung später angebracht werden kann, als daß es eine Markierung aufweist. Die Kennzeichnung der DNS und die Einführung der funktionellen Gruppe in das Desoxyribonucleosidtriphosphat sind in der Technik an sich bekannt und werden z. B. in der internationalen Anmeldung, die unter der PCT-Nummer WO87/04165 veröffentlicht wurde, ausführlich diskutiert, die hier als Bezug aufgenommen wird. Diese gekennzeichnete einzelsträngige DNS kann in herkömmlicher Weise als DNS-Probe verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben. Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung der Erfindung und sollen diese in keiner Weise einschränken.

Beispiel 1

(1) Herstellung von einzelsträngiger DNS M13mp19, in die der Virus Hepatitis B (HBV) eingesetzt ist (HB/M13)

Nach dem Verfahren, das in "Cloning and Dideoxy Sequence Method Using M13 Phage", Seiten 24-31, von Amersham Japan veröffentlicht (1. Januar 1984) wurde HB/M13 erhalten, bei dem 1,4 kb des DNS-Fragments mit einem Restriktionsenzyin BamHI von HBV herausgetrennt waren.

(2) Abspaltung und Ringöffnung von HB/M13

15 ml einer Lösung des DNS-Oligomers mit einer Basenfolge von 5'AAGCTTGCATGCCTG3' mit einer Konzentration von 5 OD(optische Dichte)/ml bei 260 nm und 100 ul HB/M13 mit einer Konzentration von 5 ug/ul wurden vermischt und diese Mischung wurde 5 Minuten lang bei 55ºC und anschließend 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um das DNS-Oligomer mit der 5'- Klonstelle zu hybridisieren. Die oben beschriebene Basenfolge des Oligomers enthält die Restriktionsstelle von HindIII. Danach wurden der Mischung bis zu einer Endkonzentration von 7 mM bzw. 60 mM MgCl&sub2; und NaCl zugesetzt. Danach wurden der Mischung 8 ul (10 Einheiten/ul) HindIII zugesetzt, und die Mischung wurde 3 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, um den doppelsträngigen Abschnitt von HB/M13 abzutrennen, der mit dem DNS-Oligomer hybridisiert ist.

(3) Hybridisierung von Primeren und deren Verlängerung

15 ml von sechs Lösungen, die jeweils ein DNS-Oligomer (Primer) enthielten, das folgende Basenfolge aufwies:
5'GCGGCTAGGAGTTCC3', 5'CCTGTTTAGCTTGTA3', 5'ATGTAGCCCATGAAG3', 5'AATGGCACTAGTAAA3', 5'TGGAATTAGAGGACA3' oder 5'TTGAGAGAAGTCCAC3', wurden mit einer Lösung vermischt, die das in (2) gewonnene HB/M13 mit geöffnetem Ring enthielt, und diese Mischung wurde 5 Minuten lang bei 55ºC und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch das Primer mit den Abschnitten des vom HBV abgeleiteten Bereichs von HB/M13 hybridisiert wurde, wobei diese Abschnitte in Intervallen von 200 Basen vom 5'-Ende des von HBV abgeleiteten Bereichs angeordnet waren. Danach wurden 100 ul einer Pufferlösung (67 mM Kaliumphosphat, 6,7 mM MgCl&sub2;, pH = 7,4), die jeweils 1 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP enthielt, und 3 ul des großen Fragments von DNS-Polymerase (4,2 Einheiten/ul) zugesetzt, und die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 25ºC inkubiert, wodurch sich die Primere verlängerten. Danach wurden 250 mM einer wäßrigen Lösung von EDTA zugesetzt, und die DNS wurde durch Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol gewonnen.

(4) Abtrennung und Gewinnung der verlängerten DNS

Eine Kammer aus einer semipermeablen Zellulosemembran wurde durch eine Membran aus 3%igem Agar-Gel getrennt, um zwei Kammern zu bilden. Die in (3) gewonnene DNS-Lösung, die 50 mM NaOH und 1 mM EDTA enthielt, wurde in eine Kammer gegeben, und eine Elektrophoreselösung, die 30 mM NaOH und 1 mM EDTA enthielt, wurde in die andere Kammer gegeben. Dann wurde 20 Minuten lang entlang der Gelmembran eine elektrische Spannung von 70 V angewendet, so daß die negative Spannung auf die Kammer angewendet wurde, in der die DNS-Lösung enthalten ist.
Durch diese Elektrophorese wurden einzelsträngige DNS erthalten, die jeweils 200 Basen enthielten. Dies wurde durch eine typische herkömmliche Gelelektrophorese bestätigt, wobei eine Markierung verwendet wurde.

Beispiel 2

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß zur Verlängerung des Primers der Mischung 5 ul einer wäßrigen Lösung von 1 mM Allylamin-dUTP zugesetzt wurden (das nach den Ausführungen von Proc. Natl. Acad. Sci. USA Band 78, Nr. 11, Seiten 6633-6637, November 1981 hergestellt worden war).
Nachdem die einzelsträngigen DNS wie im Beispiel 1 gewonnen waren, wurde die die einzelsträngigen DNS enthaltende Lösung mit einer 0,1 m NaHCO&sub3;-Lösung dialysiert, um eine 0,1 in NaHCO&sub3;- Lösung zu erhalten, die die einzelsträngigen DNS enthält. Zu 900 ul dieser Lösung wurden 25 ul einer Lösung &epsi;-caproylamidobiotin-N-hydroxysuccinimidester (von BRL, USA im Handel erhältlich) (10 ug/ul) in DMF zugesetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Mischung mit TE-Puffer dialysiert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH = 8,0). Die resultierende Lösung wurde auf einer Nitrozellulosemembran verteilt und die Punkte wurden mit konjugiertem saurem Phosphatase-Avidin geprüft, um zu bestätigen, daß das Biotin mit der einzelsträngigen DNS verbunden war.

Claims

1) Verfahren zur Herstellung von einzelsträngiger DNS, welches die Schritte umfaßt:

Bereitstellung einer einzelsträngigen DNS, die einen DNS- Templatbereich fit einer Basenfolge enthält, die der der herzustellenden einzelsträngigen DNS komplementär ist;

Schaffung einer Maßnahme am 5'-Endabschnitt des DNS-Templates zum Abschluß des Wachstums der zu bildenden DNS-Kette, wobei das DNS-Templat in einem späteren Schritt als Templat verwendet wird;

Hybridisierung von zumindest einem Primer mit einem Teil des DNS-Templates;

Verlängerung des Primers, wobei das DNS-Templat als Templat verwendet wird; und

Abtrennung und Gewinnung der durch die Verlängerung des Primers gebildeten einzelsträngigen DNS.

2) Verfahren nach Anspruch 1, worin die Maßnahme zum Abschluß des Wachstums der DNS-Kette durch Abtrennen des 5'-Endabschnittes des DNS-Templates geschaffen wird.

3) Verfahren nach Anspruch 2, worin der 5'-Endabschnitt des DNS-Templates durch Hybridisierung eines DNS-Oligomers mit dein 5'-Endabschnitt des DNS-Templates abgetrennt wird, um einen doppelsträngigen Abschnitt zu bilden, und danach der so gebildete doppelsträngige Abschnitt mit einem Restriktionsenzym abgetrennt wird, das im doppelsträngigen Abschnitt eine Restriktionsstelle hat.

4) Verfahren nach Anspruch 1, worin eine Vielzahl von Primeren mit dem DNS-Templat hybridisiert wird.

5) Verfahren nach Anspruch 1, worin die Primer mit Abschnitten des DNS-Templates mit einem Intervall von 100 bis 1000 Basen hybridisiert werden.

6) Verfahren nach Anspruch 5, worin der Intervall zwischen den Primer 150 bis 500 Basen beträgt.

7) Verfahren nach Anspruch 4, worin die Primer mit Abschnitten des DNS-Templates mit im wesentlichen einheitlichen Intervallen hybridisiert werden.

8) Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem den Schritt der Kennzeichnung der gebildeten einzelsträngigen DNS umfaßt.

9) Verfahren nach Anspruch 1, worin die Verlängerung des Primers unter Verwendung von Desoxyribonukleosidtriphosphat mit einer Markierung oder einer funktionellen Gruppe, an der die Markierung angefügt werden kann, durchgeführt wird.

10) Verfahren nach Anspruch 9, worin die Verlängerung des Primers unter Anwendung von Desoxyribonukleosidtriphosphat mit einer funtkionellen Gruppe durchgeführt wird, an die die Markierung angefügt werden kann.

11) Verfahren nach Anspruch 10, worin die funtkionelle Gruppe eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe ist.

12) Verfahren nach Anspruch 10, worin die Markierung Biotin ist.

13) Verfahren nach Anspruch 1, worin die Abtrennung und Gewinnung der einzelsträngigen DNS durch alkalische Gel-Elektrophorese durchgeführt wird, wobei eine Gelmembran angewendet wird.

14) Verfahren zur Herstellung einer einzelsträngigen DNS, welches die Schritte umfaßt:

Wiedervereinigung eines Phagenvektors, der eine Phage in Einzelstrangform freisetzt, mit einem DNS-Templat, das eine Basenfolge aufweist, die der der herzustellenden einzelsträngigen DNS komplementär ist;

Transfektion einer Wirtszelle durch die rekombinierte DNS;

Kultivierung der Wirtszelle, um die einzelsträngige DNS freizusetzen, die eine Wiedervereinigung des Phagenvektors und des DNS-Templates darstellt;

Hybridisierung des DNS-Oligomers mit dem 5'-Endabschnitt des DNS-Templates, um einen doppelsträngigen Bereich am 5'-Endabschnitt des DNS-Templates zu bilden;

Abtrennen des so gebildeten doppelsträngigen Bereiches mit einem Restriktionsenzym, um den 5'-Endabschnitt des DNS- Templates abzutrennen;

Hybridisierung einer Vielzahl von Primer mit Abschnitten des DNS-Templates, die einen im wesentlichen gleichmäßigen Abstand aufweisen;

Verlängerung der Primer, wobei das DNS-Templat als Templat verwendet wird, und

Abtrennung und Gewinnung der durch Verlängerung der Primer gebildeten einzelsträngigen DNS.