DE3831561C2

DE3831561C2 -

Info

Publication number: DE3831561C2
Application number: DE19883831561
Authority: DE
Inventors: Christian Dr. Dr. 5000 Koeln De Hartmann
Original assignee: Individual
Current assignee: HARTMANN, CHRISTIAN, DR. DR., 5000 KOELN, DE RIECK
Priority date: 1987-09-16
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1990-08-02
Also published as: DE3831561A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung einer Zellvitalfärbung mit Hilfe der Spektrophotometrie.

Die herkömmliche Methode zur Quantifizierung von Zell schäden besteht darin, veränderte oder tote Zellen nach einer Vitalfärbung auszuzählen. Schrapel et al. (Schrapel A; Letko G; Giessmann H. G.; "Ein objektiver Schnelltest zur Vitalitätsbeurteilung des Hornhautendothels nach Konservierung", Klin. Mbl. Augenheilk. 1982; 180/1 : 53-57) haben als erste die Photometrie auf diesem Gebiet eingesetzt, um die Menge an Toluidinblau zu quantifizieren, die nach einer Vitalfärbung der Hornhaut extrahiert werden konnte. Ihr Verfahren weist jedoch mehrere Nachteile auf, die haupt sächlich die Extraktion der Vitalfarbe betreffen. Bei dem Verfahren von Schrapel et al. muß zunächst eine arbeits aufwendige Dissektion des Endothels zusammen mit der Descemet-Membran vorgenommen werden, was zu Artefakten führen kann. Danach wird das angefärbte Endothel-Descemet- Gemisch in 5 m NaOH aufgelöst. Diese Lösung ist fast immer unvollständig, wobei die nichtaufgelösten kleinen Gewebe teile möglicherweise die Photometrie beeinflussen. Schließ lich muß eine pH-Werteinstellung und eine Verdünnung mit einer Zwei-Stufen-Inversion der Farbreaktion von Toluidinblau vorgenommen werden, bevor schließlich die Photometrie durch geführt werden kann.

Weiterhin ist bekannt, daß Janusgrün zur Färbung von leben den Mäusepankreas-Zellen, insbesondere der Mitochondrien, verwendet werden kann (B. Romeis: Mikroskopische Technik, R. Oldenbourg-Verlag, München 1968, S. 189-191).

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen photo metrischen Assay zur Verfügung zu stellen, der es auf schnelle und einfache Art ermöglicht, eine Zellvitalfärbung zu quantifizieren.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem gattungsgemäßen Verfahren dadurch gelöst, daß die Zellen mit einem Vitalfarb stoff Janusgrün angefärbt werden, daß der Vitalfarbstoff an schließend mit einem Lösungsmittel extrahiert wird, das chemisch deutlich verschieden ist von dem Lösungsmittel, mit dem überschüssiger Vitalstoff entfernt wird, und daß abschließend die Extinktion des Extraktes spektrophotometrisch bestimmt wird.

Die Erfindung schlägt weiterhin vor, daß zur Erstellung eines linearen Standarddiagramms durch Vitalfärbung frischer bzw. durch Alkohol oder mechanisch geschädigter Zellen Referenz werte für eine 0%- bzw. 100%-Läsion ermittelt werden.

Insbesondere werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren menschliche oder tierische Gewebezellverbände isoliert und in Zellkultur verwendet, wobei eine einfache Vitalitätsbeurteilung dieser Zellverbände, z. B. für toxikologische Untersuchungen, möglich ist. Beispiels weise können Gewebe des Hornhautendothels und/oder Linsenepithels verwendet werden.

Dabei schlägt die Erfindung vor, daß dem angefärbten Ge webe mit Hilfe eines Trepans Stücke entnommen werden, um mit Hilfe der Lichtmikroskopie und/oder Photographie den Typus und die Ausdehnung der Zelläsion zu bestimmen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Vitalfärbung der Zellen mit Janusgrün mit der Anfärbung der Zellränder mit einem anderen Farbstoff, wie z. B. Alizarinrot, kombiniert.

Der erfindungsgemäße Vitalfarbstoff Janusgrün (JG) vereint als einzige Substanz sämtliche der folgenden Eigenschaften in sich:

1. selektive Färbung von geschädigten, keine Färbung von intakten Zellen;
2. gleichmäßig intensive Färbung aller Zellarten (z. B. bei Hornhautendothel von Endothelzellen und freigeleg ter Descement-Membran), was eine Fehleinschätzung des Zellschadens verhindert;
3. leichtes Extrahieren des Farbstoffes innerhalb von Se kunden mit einer kleinen Menge von Lösungsmittel, (bei Verwendung von BBS oder dergleichen als Spüllösung für überschüssigen Farbstoff z. B. bevorzugt absoluter Alkohol);
4. Lagerfähigkeit des extrahierten Vitalfarbstoffes über eine lange Zeit, wodurch experimentelle Reihenuntersuchungen in besonders ökonomischer Weise ermöglicht werden.

Der ebenfalls untersuchte Farbstoff Trypanblau zum Beispiel kann nicht in kurzer Zeit extrahiert werden. Darüber hinaus färbt Trypanblau z. B. die Descemet-Membran intensiver als das Endothel.

Im Vergleich mit dem photometrischen Verfahren von Schrapel et al. weist das erfindungsgemäße photometrische Vital färbeverfahren (vital staining photometry, VSP) folgende Vorteile auf:

1. Das VSP-Verfahren färbt das Endothel und die Descemet-Membran mit fast identischer Intensität

Der Gesamt-Endothelschaden (Zelltod und Zellverlust) kann so mit Hilfe des VSP-Verfahrens ohne das Risiko einer Fehlin terpretation bestimmt werden, das zum Beispiel dann besteht, wenn eine Vitalfarbe von Trypanblau verwendet wird, die die Descemet-Membran stärker anfärbt als das devitalisierte Horn hautendothel. Wenn man zwischen individuellem Zelltod und Zellverlust unterscheiden will, ist es notwendig, das VSP- Verfahren mit der üblichen Auszählung von angefärbten Zellen zu kombinieren, was vor der Elution von JG erfolgen kann. Es besteht jedoch kein Zweifel daran, daß es bei fortschreitendem Endotheltrauma, wobei Zelltod und Zellver lust großer Bereiche zusammen vorliegen, immer schwieriger wird, individuelle devitale Zellen zu zählen und die Bereiche der freigelegten Descemet-Membran zu bestimmen. Für die meisten klinischen und experimentellen Zwecke ist daher die Bestimmung des Gesamt-Endotheltraumas hinreichend.

2. Das VSP-Verfahren ist einfach und schnell durchzuführen

Unter standardisierten Bedingungen liegen zwischen der Exzision der Hornhaut und dem Ablesen des Prozentanteils der Endothel schadens nur wenige Minuten. Eine kurze Anfärbdauer (90 s) vermeidet das Problem einer möglichen Farbdiffusion über die Descemet-Membran und das Hornhautstroma. Besonders wichtig erscheint es, daß die sofortige und vollständige Extraktion von JG einfach durch Extrahieren der Farbe mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. absoluten Alkohol, ohne irgendwelche Gewebedissektion wie und Hornhautmanipulation, die möglicherweise Artefakte erzeugen können, durchgeführt werden kann.

Janusgrün färbt nicht nur die Zellkerne, sondern auch die Mito chondrien. Möglicherweise wird JG als alkalischer Farbstoff von den Zellkernen nicht in derselben stabilen Weise fixiert, wie es offensichtlich mit Trypanblau als saurem Farbstoff erfolgt.

Ein anderer Beitrag zur Vereinfachung ist die Möglichkeit, die eluierten JG-Lösungen ohne eine meßbare Farbänderung zu lagern. Dies ist sogar bei Raumtemperatur für mindestens zwei Monate möglich. Im Gegensatz dazu muß das Auszählen von devitalisierten Zellen, z. B. nach einer Trypanblau-/Alizarinrot-Färbung, sofort durchgeführt werden, wenn man nicht die gesamte Hornhaut fixieren will. Es hat sich gezeigt, daß die JG-Färbung mit einer Alizarin rot-Färbung der Zellränder kombiniert werden kann. Dies kann von Bedeutung sein, wenn man das VSP-Verfahren mit der üblichen Auszählung kombinieren will (siehe 1). Natürlich kann diese kom binierte Färbung nicht mit absolutem Alkohol fixiert werden.

3. Die Ergebnisse des VSP-Verfahrens werden ohne Zählen der nichtlebensfähigen Zellen sofort in prozentualen Anteilen des Endothelschadens ausgedrückt

Bei dem Verfahren von Schrapel et al. werden die E-Werte, die man mit der Photometrie erhält, mit den Ergebnissen einer parallelen Zählung von veränderten Zellen derselben Hornhaut, die man zum Aufstellen eines Standarddiagramms vor der Farb extraktion durchführt korreliert. Dies bringt eine wichtige zusätzliche Arbeit mit sich, die jedesmal dann wiederholt werden muß, wenn ein Parameter, wie z. B. der Trepandurch messer oder dergleichen, verändert wird.

Es erscheint daher vernünftig, das zeitaufwendige Verfahren von Schrapel et al. durch direktes Ausdrücken der Resultate als prozentuale Anteile des Gesamt-Endothelschadens zu ver einfachen, indem man für ein Standarddiagramm frische Horn häute und solche mit vollständiger Endothelläsion als 0-% und 100-%-Schadens-Referenzwerte verwendet. Ein Auszählen von Zellen erfolgt daher überhaupt nicht mehr. Nichtsdestoweniger sind die mit den erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse denjenigen von Schrapel et al. gleichwertig. Zum Beispiel er geben Endothelschäden zum Zeitpunkt 0 und nach 4 Tagen der Horn hautlagerung unter feuchten Kammerbedingungen mit beiden Ver fahren fast identische Werte.

Die vorstehenden Überlegungen beziehen sich auf die Anwendung des VSP-Verfahrens auf Hornhautendothel, da dies auch der Anwendungsbereich des Verfahrens von Schrapel et al. ist, sie gelten aber in analoger Weise bei Anwendung auf andere Zellen und Zellverbände.

Man mag gegen das VSP-Verfahren einwenden, daß die Gesamt- Zelldichte und -Zellpleomorphie, im Extremfall das Vorhanden sein von sehr großen und sehr kleinen Zellen, die Ergebnisse beeinflussen können. Die großen devitalen Zellen nehmen je doch wahrscheinlich mehr JG auf als die kleinen, und diese Farbaufnahme erfolgt proportional zur Zelloberfläche und zum Zellvolumen. Darüber hinaus können für die Untersuchungen standardisierte Bedinungen gewählt werden, z. B. indem man Schweinehornhäute von normalen, erwachsenen Tieren gleichen Alters verwendet, die eine gleichmäßige Endothelstruktur zeigen. Interindividuelle Faktoren einer schwankenden Zelldichte konnten bei Anwendung des Verfahrens auf Hornhautendothel durch den Vergleich von Extinktionswerten nach JG-Färbung von gepaarten oder ungepaarten Hornhäuten ausgeschlossen werden. Dennoch ist es notwendig, jeden JG-gefärbten Zellverband oder jede JG-gefärbte Zellkultur kurz bei kleiner Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop zu überprüfen, um unerwartete Zellanomali täten sicher auszuschließen.

Ein Hauptnachteil von JG ist seine Zelltoxizität. Andererseits besitzt Trypanblau, das z. B. in europäischen Augenbanken verwendet wird, um die Endothel-Lebensfähigkeit vor der Ver pflanzung zu überprüfen, bekanntermaßen teratogene Eigen schaften. Die bevorzugte JG-Extraktion mit absolutem Alkohol führt jedenfalls zu einer vollständigen Zerstörung der Zell vitalität. Entscheidendes Problem bleibt, daß man, wenn man die Vitalfärbung mit anschließender Farbextraktion kombinieren will, gezwungen ist, den Überschuß an Farbe mit einer nicht aggressiven Lösung wie BSS auszuspülen, ohne die bereits von den veränderten Zellen fixierte Farbe auszuwaschen. Daher muß dies Extraktionsmittel chemisch vollständig verschieden von der Spüllösung sein. Aufgrund dieser methodischen Prämissen ist das VSP-Verfahren nicht geeignet, um menschliches Gewebe, wie z. B. Hornhäute, von seiner Verwendung zur Transplantation zu überprüfen. Es handelt sich in diesen Fällen also um eine in-vitro-Technik vor allem für experimentelle Frage stellungen.

Im folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen noch näher erläutert werden.

Beispiel 1 Anwendung am Hornhautendothel und Linsenepithel in Zellkultur

Menschlische Hornhautendothelzellen wurden von Spenderhorn häuten entnommen und in Zellkultur gezüchtet. Menschliche Linsenepithelzellen wurden von intraoperativ entnommenen Linsenvorderkapseln in einschichtiger Lage in Gewebekultur gezüchtet.

Etwa 50 000 Hornhautendothel- bzw. Linsenepithelzellen pro Kulturschale in 2. und 3. Passage wurden auf ihre Vitalität mit dem VSP-Verfahren überprüft. Das Auswertungsverfahren ist dasselbe wie im Anwendungsbeispiel 2 ausführlich dargelegt.

Nach Kontakt des Vitalfarbstoffs Janusgrün mit dem kulti vierten Hornhautendothel bzw. Linsenepithel wird der Farbstoffüberschuß mit BSS abgewaschen und mit absolutem Alkohol extrahiert. Die Menge des spektrophotometrisch gemessenen Janusgrün bezogen auf die Gesamtoberfläche der untersuchten Linsenepithelzellkultur ist mit dem prozentua len Anteil der devitalen Zellen direkt korreliert. Dieser Prozentsatz liegt bei intakter Hornhautendothelzellkultur bei rund 3,5 Prozent, bei 10minütigem Kontakt mit einer zytotoxischen Substanz wie dem Daunomyzin bei rund 5,5 Pro zent. Beim Linsenepithel betragen die Werte 4,5 bzw. 9,5 Prozent.

Die VSP-Technik ist somit ein einfaches Verfahren zur Toxizitätsprüfung verschiedener Zelltypen in vitro und gegebenenfalls zum Ersatz von Tierversuchen bei der Prüfung von Pharmaka, Kosmetika etc. geeignet.

Dies soll im Anwendungsbeispiel 2 demonstriert werden, bei dem die Wirkung eines Hornhautkonservierungsmediums auf die Vitalität des Hornhautendothels untersucht wird. Das Hornhautendothel ist eine sehr empfindliche einschichtige Zellage, die für die Hornhautdurchsichtigkeit und damit die Sehfähigkeit des Auges mitverantwortlich ist.

Beispiel 2 Anwendung bei Hornhautendothel Material und Verfahren

Nach Messung des Extinktionsmaximums von JF (650 mm) wurde ein Standarddiagramm mit bekannten Konzentrationen von JG erstellt. Auf diesem linearen Standarddiagramm wurden die Konzen trationen und Extinktionswerte (E), die 0% bzw. 100% Endothel schaden entsprechen, folgendermaßen bestimmt:

- für die 0%-Läsion:
- - Frischexzidierte Schweinehornhäute (n = 32)
- für die 100%-Läsion:
- - Frischexzidierte Schweinehornhäute, behandelt mit absolutem Alkohol, um die Endothel-Lebensfähigkeit und die Durch lässigkeit der gesamten Endothelschicht zu verändern (n = 26) und
- - Schweinehornhäute mit freigelegter Descemet-Membran nach mechanischer Endothelabrasion unter einem Stereomikroskop (n = 10).

Schweineaugen wurden sofort nach dem Töten der Tiere im Schlachthaus enukleiert (etwa 9 Monate alten Tieren). Auf diese Weise stand reichlich frisches Hornhautmaterial zur Verfügung, ohne gezwungen zu sein, Kaninchen oder Katzen für die Ex perimente zu töten. Die ganzen Augen wurden bei Raumtemperatur in BSS mit 40 mg/l Nystatin und 20 mg/l Gentamycin transportiert und innerhalb von 30 bis 120 min nach der Enukleation weiter verarbeitet.

Um interindividuelle Faktoren, z. B. schwankende Zelldichte, welche die JG-Aufnahme beeinflussen könnten, auszuschließen, wurde eine Serie von gepaarten Hornhäuten, die aus beiden Augen der Tiere frisch exzidiert waren, genommen und mit den 32 ungepaarten Hornhäuten verglichen, die verwendet wurden, um die 0%-Läsion zu bestimmen. Alle Hornhäute wurden mit einem 1 mm breiten skleralen Rand exzidiert und mit 700 µl 1%iger JG-Lösung, hergestellt mit BSS, angefärbt. Die ganzen Hornhäute wurden mit der Endothelseite nach oben 90 s lang angefärbt mit anschließendem 2minütigen reichlichen Spülen in BSS.

In einer zusätzlichen Experimentalreihe wurden frisch exzidierte Hornhäute

- zweifach angefärbt, erst mit Trypanblau gefolgt von JG und umgekehrt, um sicherzustellen, daß JG dieselben devitalen Endothelzellen wie Trypanblau anfärbt, und
- gegengefärbt mit Alizarinrot, um zu sehen, ob JG Trypanblau bei einer Trypanblau-/Alizarinrot-Färbung Trypanblau voll ständig ersetzen kann.

Die Trepanation wurde mit einem 9 mm-Trepan unter einem Stereo mikroskop durchgeführt. Die Lichtmikroskopie und Photographie der 9 mm großen Stücke wurde durchgeführt, um den Typus (Zelltod/Zellverlust) und die Ausdehnung (diffus, lokalisiert) der Endothelläsion abzuschätzen.

Die Extraktion des JG-Farbstoffes wurde in einem Einwegtest röhrchen durchgeführt, das mit einem 1 ml absolutem Alkohol ge füllt war. Nach 90 s war die vollständige Extraktion der Farbe erreicht.

Die Spektrophotometrie des Extraktes wurde durchgeführt, wobei absoluter Alkohol als Nullwert genommen wurde. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur gelagert und jede Woche über einen Zeitraum von Monaten gemessen.

In einer Anwendungsreihe des VSP-Verfahrens wurden 40 Schweine hornhäute mit einem 1 mm breiten skleralen Rand unter dem Stereomikroskop exzidiert. Sie wurden bei 4°C in einem kommer ziell erhältlichen MK-Konservierungsmedium (Dispersa®) unter sterilen Bedingungen 4, 7, 10, 14 bzw. 20 Tage lang gelagert (n = 8 Hornhäute für jedes Intervall). Das verwendete MK-Medium enthält Dextran, Gentamycin und Polymyxin B. Nach etwa 15minütigem Erwärmen in BSS-Lösung bei Raumtemperatur wurden alle gelagerten Hornhäute in der beschriebenen Art und Weise weiterbearbeitet.

Ergebnisse

Die Experimentalreihe, die durchgeführt wurde, um die Vitalfärbe eigenschaften von JG und Trypanblau zu vergleichen, ergab die folgenden Ergebnisse: JG färbt genau die gleichen devitalen Endo thelzellen dergleichen Hornhaut, unabhängig davon ob die JG- nach der Trypanblau-Färbung erfolgt oder umgekehrt. JG ergab ein ausgeprägteres weniger blasses Färbeergebnis als Trypanblau, das hauptsächlich die Endothelzellkerne anfärbt. JG ergibt eine intensive dunkelblaue Färbung der Zellkerne mit einer weniger intensiven Färbung des Zytoplasmas. JG-angefärbte Zellen sind daher klar umrissen. JG kann Trypanblau auch in der kombinierten Trypanblau-/Alizarinrot-Färbung ersetzen.

Die Photometrie der 32 frisch exzidierten normalen Schweine hornhäute ergab einen Mittelwert der Extinktion (E) der verdünnten Farbe von E = 0,0558 ± 0,055.

Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen E dieser 32 ungepaarten und E der gepaarten Hornhäute bei Tieren etwa gleichen Alters. Um eine Unterschätzung selbst eines minimalen Endotheltraumas zu vermeiden, wurde nicht der Mittelwert von E = 0,0558 also 0%-Wert des Endothelschadens genommen, sondern E = 0. Dieser Wert entspricht einer Hornhaut ohne jeglichen Endothelschaden, ein Umstand, der offensichtlich nur sehr selten angetroffen wird. E der 26 Hornhäute, die mit absolutem Alkohol behandelt worden waren, lag bei 1,207 ± 0,076 mit dem niedrigsten E-Wert bei 1,1. E für die abradierten Hornhäute lag bei 1,3 ± 0,067. Es gab keinen signifikanten Unterschied von E zwischen den alkoholbehandelten und den abradierten Hornhäuten. Da ein photometrisches Ablesen bei E-Werten oberhalb von 1,4 schwierig wird, wurden nicht die Mittelwerte der Hornhäute mit einer 100%igen Endothelläsion als Schwellenwert des 100%-Schadens genommen, sondern der niedrigste Extinktionswert (E = 1,1). Diese Entscheidung könnte zu einer geringfügigen Überschätzung führen, vermeidet aber die gefährlichere Unterschätzung der Ausdehnung des Endotheltraumas. Alle Hornhäute mit einem mehr oder weniger vollständigen Endothelschaden lagen daher über dem 100%-Schadensschwellwert. Dennoch liegt der dadurch hervor gerufene methodische Fehler der Überschätzung bei weniger als 10%, wenn E = 1,1 anstelle des Mittelwertes von 1,2 als 100%-Schadensschwellwert genommen wird.

Wiederholte photometrische Messungen der Farblösungen, die bis zu 2 Monaten bei Raumtemperatur gelagert wurden, gaben stabile Ergebnisse.

Um die Verläßlichkeit des VSP-Verfahrens zu beweisen, wurden die Wirkungen von verschiedenen intraokularen Spüllösungen und Hornhautlagerlösungen auf die Lebensfähigkeit der Horn hautendothels verglichen. Die Ergebnisse sind sehr schlüssig:
die Extinktionswerte von 40 Hornhäuten, für jedes Zeitintervall in Gruppen zu 8 gelagert, schwankten nur in einem schmalen Bereich bis zum 14. Tag der Hornhautkonservierung.

Die kontinuierliche Zunahme des Gesamt-Endothelschadens nach dem vierten Tag der Konservierung zeigt, daß die Ergebnisse des VSP- Verfahrens nicht signifikant von Faktoren wie Zellpleomorphie und Zellverlust, die zu endothelfreien Bereichen der Descemet- Membran führen, beeinflußt werden. Wie durch SEM- und TEM-Studien gezeigt werden konnte, sind solche großen morphologischen Ver änderungen sogar bis zum 14. Tag der Lagerung in MK-Medium sehr selten. Die offensichtliche, sogar ultrastrukturelle Integrität der Endothelschicht ist jedoch nicht mit der Endothelvitalität fähigkeit bei Abschätzung durch eine Trypanblau-Vitalfärbung korreliert. Offensichtlich ist die Abschätzung der Endothel vitalität durch Vitalfärbung abhängig von der Temperatur der untersuchen Hornhaut. So führt das Erwärmen, z. B. durch zweistündiges Bebrüten bei 35°C, von bei 4°C gelagerten Horn häuten zu ultrastrukturellen Veränderungen, die ohne Inkubation vor dem SEM-/TEM-Studien nicht beobachtet werden konnten.

Mit dem VSP-Verfahren wurden 5% devitale Zellen bei frisch exzi dierten Hornhäuten festgestellt. Es muß daher angenommen werden, daß eine Rate von etwa 5% devitaler Zellen in jeder frischen Hornhaut zu finden ist, selbst nach einer noch so sorgfältigen Exzision. Das anfängliche etwa 5%ige Endotheltrauma entspricht den Streifen von vitalgefärbte Zellen, die man regelmäßig nach Hornhautexzision beobachtet und die möglicherweise ein Falt- oder Stromaschwellungs-Artefakt darstellen. Daten von Hornhäuten, die über längere Zeiträume in MK-Medium gelagert und mit Vital färbung abgeschätzt wurden, sind für Lagerzeiten über 5 Tagen rar und für Lagerzeiten über 14 Tagen nicht vorhanden. Ein Grund dafür kann sein, daß das Auszählen von devitalen Zellen mit der ansteigenden Zahl von devitalen oft zusammenfließenden individuellen Zellen und Zellbereichen immer schwieriger wird. Der Hauptgrund für das Nichtvorhandensein solcher Daten ist sicherlich, daß MK-Medium nur für Lagerzeiten bis zu 4 Tagen empfohlen ist. Stocker vermutete, daß eine Spenderhornhaut für die Transplantation ungeeignet ist, wenn sich mehr als 30% der Zellen mit Trypanblau färben. Nichtsdestoweniger bleibt der genaue prozentuale Anteil von lebensfähigen Spender endothelzellen, der notwendig ist, um die Transparenz einer verpflanzten Hornhaut zu gewährleisten, weiterhin unbekannt. Nach den aus dem VSP-Verfahren bekannten Daten erreichten Schweinehornhäute, die in MK-Medium gelagert waren, die 30%-Grenze nach 6 bis 7 Tagen. Solche Schweinehornhäute sind jedoch ideal, da sie von erwachsenen Tieren desselben Alters stammten und sofort nach dem Tod exidiert worden waren. Auch wenn die vorliegenden Daten nicht ohne weiteres auf die Kon servierung von menschlichen Hornhäuten extrapoliert werden können, bestätigen die Ergebnisse die empfohlene 4-Tage-Grenze der Hornhautlagerung in MK-Medium.

Das VSP-Verfahren stellt eine somit experimentelle Alter native zur zeitraubenden Zellzählung von vitalgefärbten Zellen dar, um den prozentualen Anteil von Zellschäden ab zuschätzen, die auf chirurgische Eingriffe, intraokulare Lösungen, IOLs, endothelschützende Verbindungen, Konder vierungslösungen für Gewebe usw. zurückgehen.

Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund seiner Einfachheit ohne große Schwierigkeiten zu automatisieren.

Der Anteil devitaler Zellen in einem zu untersuchenden Zellverband könnte somit apparativ in größerem, auch industriellen, Umfang bestimmt werden.

Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

1. Verfahren zur Quantifizierung einer Zell-Vitalfärbung mit Hilfe der Spektrophotometrie, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit dem Vitalfarbstoff Janusgrün angefärbt werden, daß der Vitalfarbstoff anschließend mit einem Lösungs mittel extrahiert wird, daß chemisch deutlich verschieden ist von dem Lösungsmittel, mit dem überschüssiger Vital farbstoff entfernt wird, und daß abschließend die Extinktion des Extraktes spektrophotometrisch bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erstellung eines linearen Standarddiagramms durch Vital färbung frischer bzw. durch Alkohol oder mechanisch ge schädigter Zellen Referenzwerte für eine 0%- bzw. 100%-Läsion ermittelt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß menschliche oder tierische Gewebezell verbände isoliert und in Zellkultur verwendet werden, wobei eine einfache Vitalitätsbeurteilung dieser Zell verbände, z. B. für toxikologische Untersuchungen, möglich ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anwendungsbeispiel Gewebe des Hornhautentdothels und/oder des Linsenepithels verwendet wird/werden.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß dem angefärbten Gewebe mit Hilfe eines Trepans Stücke entnommen werden, um mit Hilfe der Lichtmikroskopie und/oder Photographie den Typus und die Ausdehnung der Zelläsion zu bestimmen.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vitalfärbung der Zellen mit Janusgrün mit der Anfärbung der Zellränder mit einem anderen Farbstoff kombiniert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als anderer Farbstoff Alizarinrot verwendet wird.