DE3826040A1 - Verfahren zur herstellung von chinolinsaeure - Google Patents
Verfahren zur herstellung von chinolinsaeureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von Chinolinsäure (Pyridin-2,3-dicarbonsäure) mit
Hilfe gentechnisch modifizierter Mikroorganismen.
Chinolinsäure ist ein wichtiges Zwischenprodukt für
zahlreiche Pharmazeutika und Pflanzenschutzmittel. Sie
wird großtechnisch hergestellt durch
Oxidationsverfahren von Chinolin oder
Chinolinderivaten gemäß z. B. EP-B 82 542 oder
EP-A 1 49 857. Ein Nachteil dieser Verfahren ist es,
daß die verfügbare Rohstoffmenge nicht ausreicht, um
den stetig wachsenden Bedarf an Chinolinsäure zu
decken.
Es ist daher Aufgabe vorliegender Erfindung, ein
Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure
bereitzustellen, bei dem diese aus völlig anderen
unbegrenzt verfügbaren Rohstoffen in einem einfachen,
kostengünstigen und umweltfreundlichen Verfahren
gewonnen wird.
Aus einer älteren Anmeldung der Anmeldering (P 37 03 255.0)
ist ein Verfahren zur Herstellung von
Chinolinsäure mit Hilfe gentechnisch modifizierter
Mikroorganismen bekannt. Dabei wird der folgende
Metabolismus benutzt:
Im Stoffwechsel von Mikroorganismen erfolgt die
Chinolinsäuresynthese in zwei Reaktionsschritten:
Diese Reaktion wird durch L-Aspartatoxidase
katalysiert. Die Cyclisierung von Iminoaspartat mit
Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) zu Chinolinsäure wird
durch das Enzym Chinolinsäuresynthase katalysiert.
Nach dem in P 37 03 255.0 beschriebenen Verfahren
werden zur genetischen Modifizierung aus
Mikroorganismen, die die Chinolinsäuresynthese als
Teil des Stoffwechsels durchführen, DNA-Sequenzen
gewonnen, die für die Enzyme Chinolinsäuresynthese
(nadA) und L-Aspartatoxidase (nadB) codieren.
Die Isolierung kann z. B. aus folgenden
Mikroorganismen erfolgen:
Escherichia coli
Salmonella typhimurium
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium bovis
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
Salmonella typhimurium
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium bovis
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
In der Literatur sind nadA- und nadB-Mutanten von
E. coli K 12 beschrieben. Mutanten dieser Spezies
wurden auch von der Anmelderin zur Isolierung
entsprechender DNA-Sequenzen nadA und nadB verwendet.
Zur Modifikation geeigneter Mikroorganismen werden
folgende Schritte durchgeführt:
- - Identifizierung, Isolierung und Sequenzierung der DNA-Sequenz nadB, die für das Enzym L-Aspartatoxidase codiert,
- - Identifizierung, Isolierung und Sequenzierung der DNA-Sequenz nadA, die für das Enzym Chinolinsäuresynthase codiert,
- - Einbau der DNA-Sequenzen nadA und nadB in Plasmide, so daß jede DNA-Sequenz mit einer Expressions-Kontroll-Sequenz verbunden ist,
- - Einbringen der so hergestellten modifizierten Plasmide in einen transformierbaren Wirtsorganismus.
Die so hergestellten Mikroorganismen produzieren in
einem Nährmedium mit organischer C-Quelle und
anorganischer oder organischer N-Quelle Chinolinsäure,
die nicht mehr dem ursprünglichen Metabolismus gemäß
umgesetzt, sondern bevorzugt ausgeschieden wird.
Nach dem in P 37 03 255.0 beschriebenen Verfahren
wurden Plasmide konstruiert, die DNA-Sequenzen nadB
mit der folgenden Nukleotidsequenz enthalten:
Diese Nukleotidssequenz ist für die Bildung von
L-Aspartatoxidase verantwortlich.
In der gleichen Anmeldung ist weiterhin ein Verfahren
beschrieben zur Konstruktion von Plasmiden, die
DNA-Sequenzen nadA mit folgender Nukleotidsequenz
enthalten:
Diese Nukleotidsequenz ist für die Bildung von
Chinolinsäuresynthese verantwortlich.
Die isolierten DNA-Sequenzen nadA und nadB haben als
Expressions-Kontroll-Sequenzen genomische
Regulationssequenzen.
Die mitunter als rekombinante Expressionsplasmide
benannten Expressionsvektoren werden als Plasmide
bezeichnet. Sie werden in bekannter Weise erhalten
durch Ligation der einzelnen DNA-Fragmente und
Insertion der DNA-Fragmente in Plasmide.
Die erhaltenen Plasmide werden in üblicher Weise in
einen transformierbaren Wirtsorganismus, z. B. ein
E.-coli-Bakterium, eingebracht. Anschließend werden die
mit einem oder mehreren Plasmiden transformierten
Mikroorganismen in bekannter Weise in einem geeigneten
Nährmedium kultiviert.
Die Produktion und Gewinnung von Chinolinsäure erfolgt
in bekannter Weise durch die mit den entsprechenden
DNA-Sequenzen transformierten Mikroorganismen unter
geeigneten Bedingungen, wie Batch-, Fed-batch- oder
kontinuierliche Fermentation in Rühr- oder Airlift
oder ähnlichen Bioreaktoren, wobei einem
Mikroorganismus in einem Nährmedium eine organische
Kohlenstoffquelle und eine anorganische oder
organische Stickstoffquelle unter Wachstumsbedingungen
zur Verfügung gestellt werden.
Wie aus den Beispielen der Anmeldeschrift
P 37 03 255.0 zu ersehen ist, wird durch die
genetische Modifikation der Mikroorganismen bei allen
durchgeführten Versuchen eine erhöhte
Chinolinsäureausscheidung erzielt. Nachteilig sind
jedoch die noch sehr geringen Ausbeuten.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur
Herstellung von Chinolinsäure durch gentechnisch
modifizierte Mikroorganismen bereitzustellen, bei dem
bei verschiedenen, analogen Ansätzen hohe
reproduzierbare Ausscheidungsmengen erzielt werden
können.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt durch ein Verfahren
gemäß Anspruch 1 sowie durch dazu notwendige
Mikroorganismen gemäß Anspruch 2.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die von den
modifizierten Mikroorganismen ausgeschiedene Menge
beeinflußt werden kann durch die Wahl der verwendeten
Plasmide, in die die DNA-Sequenzen nadA und nadB
eingefügt wurden. Nicht durch Plasmide, die die nadA
und nadB-Sequenzen gemeinsam tragen, werden die
höchsten Ausscheidungsraten erzielt, sondern durch
jeweils nur nadA bzw. nadB tragende Plasmide, die
gemeinsam in die Zelle eingebracht werden.
In der Bakterienzelle haben Plasmide die Eigenschaft,
sich selbst auf eine bestimmte Kopienzahl zu
regulieren. Tabelle 1 zeigt für einige Plasmide
charakteristische Kopienzahlen:
Eine reproduzierbare Steigerung der
Chinolinsäuresynthese kann, wie bereits dargelegt,
dann erreicht werden, wenn die zur Modifizierung
verwendeten Gen-Sequenzen auf unterschiedliche, zu
verschiedenen Kopienzahlen führende, miteinander in
der Zelle und mit dem Mikroorganismenstamm kompatible
Basisvektoren etabliert werden. Die Wahl der
verwendeten Plasmide wird neben der Kopienzahl in der
Zelle durch die Antibiotikaresistenz bestimmt, durch
die sie gegeneinander selektiert werden können.
Es wurde nun gefunden, daß die Ausscheidungsrate von
Chinolinsäure erhöht wird, wenn in einem
Mikroorganismus nadA und nadB tragende Plasmide mit
einem Verhältnis der Kopienzahlen von 200 : 8 und 200 : 50
etabliert werden. Durch die Etablierung nadA und
nadB-tragender Plasmide in einem Verhältnis von 200 : 50
kann die Chinolinsäureausscheidungsrate gegenüber
derjenigen nicht modifizierter Mikroorganismen von
durchschnittlich 10 mg/l×OD auf durchschnittlich
81 mg/l×OD erhöht werden.
Bei einem Verhältnis von nadA- zu nadB-tragender
Plasmide von 200 : 8 wird eine Erhöhung auf
100 mg/l×OD der Ausscheidungsmenge erzielt.
Offensichtlich werden durch die Wahl der verwendeten
Plasmide optimale nadA- und nadB-Plasmid-Verhältnisse
in den Wirtszellen eingestellt, die zu einer erhöhten
Chinolinsäureausscheidung führen.
Verwendete Abkürzungen:
| Ap | |
| Ampicillin | |
| DNA | Desoxyribonukleinsäure |
| E. coli | Escherichia coli |
| HPLC | High Performance Liquid Chromatography |
| kb | Kolobasenpaare |
| Km | Kanamycin |
| LB | Luria-Bertani |
| Tc | Tetracyclin |
Zusammensetzung der verwendeten Lösungen:
| LB-Medium | |
| 10 g Caseinhydrolysat oder Pepton | |
| 5 g Hefeextrakt | |
| 5 g NaCl | |
| ad 1000 ml H₂O, pH 7,4 | |
| LB/Ap-Medium | LB mit 100 mg/l Ap |
| LB/Tc-Medium | LB mit 2 mg/l Tetracyclin |
| LB/Km-Medium | LB mit 25 mg/l Kanamycin |
DNA-Klonierung in Plasmiden sowie Transformation von
Wirtstämmen erfolgten nach den bekannten
Standardmethoden (z. B. Maniatis).
Kompetente Zellen der nadC-Mutante W 4546 werden mit
den Plasmiden pQAB520 bzw. pQAB102 transformiert und
auf LB-Ap- bzw. LB-Tc-Medium selektioniert.
Vom Stamm W4546/pQAB520 wurden kompetente Zellen
hergestellt und diese mit dem Plasmid pQAA168
transformiert. Der Stamm W4546/pQAB520+pQAA 168 wurde
durch Selektion auf LB-Ap-Km-Medium erhalten.
Der Stamm W4546/pQAB102+pQAA168 wurde durch
Transformation von kompetenten Zellen von
W4546/pQAB102 mit dem Plasmid pQAA168 und Selektion
auf LB-Tc-Km-Medium erhalten.
Die Konstruktion des Plasmids pQAB520 ist in
P 37 03 255.0, Beispiel 3 (dort mit pCH 101
bezeichnet), beschrieben. Die Konstruktion des Plasmids
pQAA168 beschreibt Beispiel 7 aus P 37 03 255.0 (dort
pCH202). Plasmid pQAB102 wurde durch Klonierung des
3,3 kb großen, Gen nadB enthaltenden,
HindIII-NruI-Fragments aus pQAB520 in den Vektor
pLG339 (Lit.: N. G. Stoker et ol. Gene 18 [1982]
335-341) kloniert, der zuvor mit den
Restriktions-Enzymen HindIII und SmaI hydrolysiert
worden war.
Die in Beispiel 1 beschriebenen rekombinanten
nadC-Mutanten und der Ausgangsstamm wurden in einem
Medium, enthaltend 5 g/l Glycerin, 0,5 g/l Na-citrat,
5 g/l Casamino acids, 1 g/l NH₄NO₃, 0,4 g/l
MgSO₄×7H₂O, 7 g/l K₂HPO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 10-6 Mol/l
Nicotinsäure sowie die erforderlichen Antibiotika
(vgl. Tabelle), 24 h bei 37°C unter Schütteln
kultiviert. Danach wurde zur Bestimmung der Zellmasse
die optische Dichte bei 578 nm bestimmt, sodann die
Zellen durch Zentrifugation sedimentiert.
Die im klaren Überstand befindliche Chinolinsäure
wurde mittels HPLC quantitativ bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Chinolinsäure durch
genetisch modifizierte Mikroorganismen, die nadA-
und nadB-DNA-Sequenzen tragende Plasmide
enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die
Mikroorganismen für nadA und nadB codierende
Plasmide im Verhältnis 200 : 50 und 200 : 8
enthalten.
2. Mikroorganismen zur Herstellung von Chinolinsäure
nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie
für Chinolinsäuresynthese und für
L-Aspartatoxidase codierende DNA-Sequenzen nadA
und nadB tragende Plasmide enthalten, die sich
mit einem Kopienverhältnis von 200 : 50 und 200 : 8
in der Zelle etablieren.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19883826040 DE3826040A1 (de) | 1988-07-30 | 1988-07-30 | Verfahren zur herstellung von chinolinsaeure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19883826040 DE3826040A1 (de) | 1988-07-30 | 1988-07-30 | Verfahren zur herstellung von chinolinsaeure |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3826040A1 true DE3826040A1 (de) | 1990-02-08 |
Family
ID=6359976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19883826040 Withdrawn DE3826040A1 (de) | 1988-07-30 | 1988-07-30 | Verfahren zur herstellung von chinolinsaeure |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3826040A1 (de) |
-
1988
- 1988-07-30 DE DE19883826040 patent/DE3826040A1/de not_active Withdrawn
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