DE3811193A1

DE3811193A1 - Neue peptide, verfahren zu ihrer herstellung und diese peptide enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE3811193A1
Application number: DE19883811193
Authority: DE
Inventors: Guenther Prof Dipl Chem Jung; Annette Dipl Chem Beck; Gerd Dipl Chem D Schnorrenberg; Wolfram Dr Gaida; Rudolf Prof Lang
Original assignee: Boehringer Ingelheim GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim GmbH
Priority date: 1988-04-01
Filing date: 1988-04-01
Publication date: 1989-10-19

Description

Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel I

R₁-U-X-Y-Z-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-X-W-X-Z-NH₂ (I)

deren pharmazeutisch annehmbaren Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.

In Formel I steht

R₁ für R₂-CO oder für einen peptidisch gebundenen Di-, Tri-, Tetra- oder Pentapeptid-Rest der Zusammensetzung H-Z-Pro-S-X-V-, H-Z-Pro-S-V-, H-Z-Pro-V-, H-Z-V- oder Acetyl-Z-Pro-S-X-V-,
S für Ser, Glu, Cys oder eine Bindung,
U für eine aliphatische Aminosäure wie Leu, Ile, Val, Ala oder eine Bindung,
X für eine basische Aminosäure wie Arg, Lys, Orn und Homo-Arg oder für eine basische Aminosäure, bei der die Aminogruppe der Seitenkette acetyliert ist (z. B. Lys(Ac), Orn(Ac)), oder eine Bindung,
Y für eine Aminosäure wie His, Trp, Phe und Tyr oder eine Bindung,
Z für eine Aminosäure wie Tyr, Phe, His, Trp oder eine unnatürliche Aminosäure wie z. B. Naphthylalanin oder substituierte Phenylalanin-Derivate oder wenn Z nicht C-terminal steht auch für Cys,
W für eine Aminosäure wie Gln, Asn, Glu, Asp,
V für einen ω-Aminoalkansäure-Rest wie ε-Aminocapronsäure-Rest oder einen Rest der allgemeinen Formel NH-(CH₂)_n-CO oder NH-(CH₂)_n-CONH-(CH₂)_n CO mit n=2 bis 15 oder eine Aminosäuresequenz mit Turn-Struktur wie z. B. Pro-Gly-T, Asn-Ser-T und Cys-Cys bzw. Homo-Cys-Homo-Cys, die jeweils über ihre Seitenketten disulfidisch miteinander ringgeschlossen sein können,
T für eine der natürlichen Aminosäuren,
R₂ für C₁- bis C₇-Alkyl oder Benzyl.

Wenn S für Glu und das nicht C-terminale Z für Tyr steht, kann die Seitenkette-Carboxylgruppe mit der phenolischen OH-Gruppe des Tyrosins esterartig verknüpft sein.

Falls S für Cys und das nicht C-terminale Z für Cys stehen, können die Seitenketten dieser Aminosäuren disulfidisch miteinander verknüpft sein.

In dem Sequenzteil U-X-Y-Z sind Aminosäuren bevorzugt, die in Verbindung mit dem Pentapeptid Ile-Asn-Leu-Ile-Thr alphahelikale Konformationen begünstigen.

Bevorzugt sind Verbindungen, worin die Symbole der Formel I folgende Bedeutungen haben:

R₁: R₂-CO, H-Z-Pro-S-X-V-, H-Z-Pro-S-V-, H-Z-Pro-V-, H-Z-V- oder Acetyl-Z-Pro-S-X-V-,
S: Ser oder Glu,
U: Leu oder eine Bindung,
X: Arg, Lys, Orn oder Homo-Arg,
Y: His oder Trp,
Z: Tyr oder Phe,
W: Gln oder Asn,
V: ω-Aminoalkansäure-Rest wie HN-(CH₂)_n-CO und NH-(CH₂)_n-CONH-(CH₂)_n-CO mit n=2 bis 10,
R₂: für C₁- bis C₇-Alkyl oder Benzyl.

Verbindungen der allgemeinen Formel I besitzen Säuregruppen, hauptsächlich Carboxylgruppen, oder phenolische Hydroxygruppen und/oder basische Gruppen wie z. B. Guanidino- oder Aminofunktionen. Verbindungen der allgemeinen Formel I können deshalb entweder als innere Salze, als Salze mit pharmazeutisch verwendbaren Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Sulfonsäure oder organische Säuren oder als Salze mit pharmazeutisch verwendbaren Basen wie Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxiden oder Carbonaten, Zink- oder Ammoniumhydroxiden oder organischen Aminen wie z. B. Diethylamin, Triethylamin, Triethanolamin u. a. vorliegen.

Verbindungen der allgemeinen Formel I enthalten Aminosäuren, welche entweder in ihrer L-Form oder D-Form vorliegen können. Verbindungen der Formel I können deshalb entweder aus Aminosäure-Resten mit L-Konfiguration aufgebaut sein, oder einzelne oder mehrere der Aminosäure-Reste der Verbindungen liegen in der D-Konfiguration vor.

Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind

1) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Arg-His-Tyr-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
2) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Leu-Arg-His-Tyr- Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
3) H-Tyr-Pro-Ser-NH-(CH₂)₇-CO-Arg-His-Tyr-Ile-Asn- Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
4) Ac-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Arg-His-Tyr-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
5) H-Tyr-Pro-NH-(CH₂)₁₀-CO-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu- Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
6) H-Tyr-Pro-NH-(CH₂)₁₀-CO-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr- Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
7) H-Tyr-NH-(CH₂)₁₀-CO-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg- Gln-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
8) H-Tyr-Pro-Ser-NH-(CH₂)₅-CO-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
9) H-Phe-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Arg-His-Tyr-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
10) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₇-CO-Arg-His-Tyr-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
11) H-Tyr-Pro-Ser-NH-(CH₂)₁₀-CO-Arg-His-Tyr-Ile-Asn- Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
12) H-Tyr-NH-(CH₂)₁₂-CO-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
13) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Lys-His-Tyr-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
14) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Lys-His-Tyr-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Lys-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
15) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Lys-His-Tyr-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Lys-Gln-Lys-Tyr-NH₂,
16) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Arg-Trp-Tyr-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
17) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₇-CO-Arg-His-Tyr-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
18) H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Arg-His-Phe-Ile- Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂,
19) CH₃-CO-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg- Tyr-NH₂,
20) CH₃-CO-Lys-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg- Tyr-NH₂,
21) CH₃-CO-Lys-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Lys-Gln-Arg- Tyr-NH₂,
22) CH₃-CO-Lys-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Lys-Gln-Lys- Tyr-NH₂,
23) CH₃-CO-Lys(Ac)-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Lys(Ac)- Gln-Lys(Ac)-Tyr-NH₂,
24) CH₃-CO-Orn-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Orn-Gln-Orn- Tyr-NH₂.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I stellen Segmente, diskontinuierliche miteinander verknüpfte Segmente und Analoge des Neuropeptid Y dar.

Neuropeptid Y (NPY) ist ein aus 36 Aminosäuren bestehendes Peptid, das erstmals 1982 im Gehirn von Schweinen nachgewiesen wurde (K. Tatemoto u. a., Nature 296, 659 [1982]). Inzwischen wurde NPY in allen bisher untersuchten Tierspezies und auch beim Menschen nachgewiesen (J. M. Lundberg u. a., Neurosci. Lett., 42, 167 [1983]). Es kommt im Organismus nahezu ubiquitär vor, besonders hohe Konzentrationen werden im Gehirn und in Organen, die vom sympathischen Nervensystem innerviert werden (Herz, Nieren, Nebennieren, Gefäßsystem), nachgewiesen (T. L. O'Donohue u. a., Peptides, 6, 755 [1985]). Vielfach ist NPY zusammen mit Noradrenalin (NA) in den Nervenendigungen lokalisiert und wird auf Nervenimpuls hin freigesetzt (J. M. Lundberg u. a., Regulatory Peptides, 13, 41 [1985]). Hervorstechende Eigenschaft von exogen in die Körperperipherie zugeführtem NPY ist eine markante Blutdrucksteigerung. Zusammen mit NA, Vasopressin (VP) und Angiotensin II (AII) zählt NPY zu den stärksten bekannten körpereigenen gefäßkontrahierenden, d. h. blutdrucksteigernden Substanzen (P. C. Emson u. a., TINS, 1984, 31). Lokale Injektion von NPY in das Gehirn verursacht Blutdrucksenkung (ähnlich Adrenalin und NA) sowie eine drastische Steigerung der Nahrungsaufnahme (T. S. Gray u. a., Life Sci., 38, 389 [1986]).

Hauptangriffsorte von NPY in der Peripherie sind das Herz (starke Koronarkonstriktion), die Nieren (Minderdurchblutung) und das arterielle Gefäßsystem (Erhöhung des peripheren Widerstandes). Zusätzlich zu seiner gefäßkontrahierenden Eigenwirkung potenziert NPY auch die Wirkung der obengenannten Neurotransmitter (NA, VP, AII) sowie anderer körpereigener vasopressorischer Substanzen (L. Edvinsson u. a., Br. J. Pharacol., 83, 519 [1984]).

Aus diesen Wirkungen sowie dem gehäuften Vorkommen von NPY in den Geweben, die für den Blutdruck relevant sind, kann geschlossen werden, daß NPY bei der Blutdruckregulation involviert ist.

Überraschenderweise besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen NPY-agonistische, besonders aber auch NPY-antagonistische Wirksamkeit.

Eine NPY-agonistische, d. h. blutdrucksteigernde Wirkung wurde an narkotisierten, despinalisierten Ratten nachgewiesen. Nach intravenöser Applikation verschiedener Dosen der jeweiligen Testsubstanz wurde der Blutdruckanstieg registriert und ED₂₀-Werte ermittelt. Der ED₂₀-Wert bezeichnet hier die Dosis der Testsubstanz, die den Blutdruck um 20 mm Hg steigert.

Es ergaben sich folgende ED₂₀-Werte:

NPY
6,3×10^-10 M/kg
Verbindung Beispiel 1	5×10^-8 M/kg
Verbindung Beispiel 2	2×10^-8 M/kg
Verbindung Beispiel 19	2×10^-7 M/kg
Verbindung Beispiel 20	2×10^-7 M/kg

Die NPY-antagonistische Wirkung wurde an narkotisierten Ratten ermittelt. Registriert wurde die Hemmung der durch eine definierte Dosis NPY ausgelöste Blutdrucksteigerung nach Vorbehandlung mit der Testsubstanz gegenüber den Kontrollwerten von nicht vorbehandelten Tieren.

Es ergaben sich bei einer Dosierung von 1 bis 2×10^-6 M/kg Testsubstanz folgende Hemmwerte:

Verbindung Beispiel 1    83%,
Verbindung Beispiel 2    84%,
Verbindung Beispiel 19   94%,
Verbindung Beispiel 20   62%.

Wegen der oben geschilderten Wirksamkeit können Verbindungen der allgemeinen Formel I zur Therapie cardiovasculärer Erkrankungen wie Hypertension, koronarer, cerebraler und renaler Vasospasmen sowie Obesitas verwendet werden. Darüber hinaus können diese Verbindungen als wertvolle Hilfsmittel zur Erzeugung und Reinigung (Affinitätschromatographie) von Antikörpern und in RIA- oder ELISA-Assays Anwendung finden.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Heilmittel und pharmazeutische Zubereitungen, die diese Verbindungen enthalten. Bevorzugt ist die Anwendung am Menschen. Zur parenteralen Applikation werden die Verbindungen der Formel I oder deren physiologisch verträglichen Salze, eventuell mit den dafür üblichen Substanzen wie Lösungsvermittler, Emulgatoren oder weitere Hilfsstoffe in Lösung, Suspension oder Emulsion gebracht. Als Lösungsmittel kommen z. B. in Frage: Wasser, physiologische Kochsalzlösungen oder Alkohole, z. B. Ethanol, Propandiol oder Glycerin, Zuckerlösungen wie Glucose- oder Mannit-Lösungen oder auch eine Mischung aus verschiedenen Lösungsmitteln.

Außerdem können die Verbindungen durch Implantate, z. B. aus Polylactid, Polyglycolid oder Polyhydroxybuttersäure bzw. intranasale Zubereitungen appliziert werden.

Die oben angegebenen Verbindungen können nach allgemein bekannten Methoden der Peptidchemie, wie z. B. in Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 15/2, beschrieben oder bevorzugt nach der Festphasenpeptidsynthese (z. B. B. Barany, R. B. Merrifield in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2, 2-284 [1980], Academic Press, New York, oder R. C. Sheppard, Int. J. Pept. Prot. Res., 21, 118 [1983]) oder gleichwertigen bekannten Methoden hergestellt werden. Als Aminoschutzgruppen werden die in Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 15/1, beschriebenen verwendet, bevorzugt werden Urethanschutzgruppen wie z. B. die Fluorenylmethoxycarbonyl- oder die tert-Butyloxycarbonylschutzgruppe angewendet. Zur Verhinderung von Nebenreaktionen sind in der Regel eventuell vorhandene funktionelle Gruppen in den Seitenketten der Aminosäuren durch geeignete Schutzgruppen (siehe z. B. T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis) zusätzlich geschützt. Bevorzugt verwendet werden dabei Arg(NO₂), Arg(Mtr), Arg(di-Z), Arg(Pmc), Tyr(t-Bu), Tyr(Bzl), Tyr(Br-Z), Ser(t-Bu), Ser(Bzl), Glu(t-Bu), Glu(Bzl), Lys(BOC), Lys(Z), His(Trt), His(Bum), His(Dnp), His(Z), Thr(t-Bu), Thr(Bzl), Cys(Acm), Cys(4-Me-Bzl), Cys(t-Bu), Asp(t-Bu), Asp(Bzl), Orn(BOC), Orn(Z).

Zur Synthese der Verbindungen der allgemeinen Formel I nach der Festphasensynthese sind als Ankergruppen alle diejenigen geeignet, die bei der Abspaltung des Peptids vom polymeren Träger Peptidamide liefern. In Kombination mit der BOC-Aminoschutzgruppe werden bevorzugt die Benzhydrylamino-Ankergruppe (P. G. Pietta u. a., J. Org. Chem., 39, 44 [1974]) und die 4-Methylbenzhydrylaminankergruppe (G. R. Matsueda u. a., Peptides, 2, 45 [1981]) verwendet. In Kombination mit der Fmoc-Schutzgruppe sind verschiedene Ankergruppen anwendbar:
p-Aminomethyl-phenoxymethyl-Gruppe (P. Pietta u. a., J. Org. Chem., 40, 2995 [1975]),
Bis- und Trialkoxybenzylamin-Linker (F. Albericio, G. Barany, Int. J. Pept. Prot. Res., 30, 206 [1987]) Benzhydrylalkohol-Linker (G. Breipohl u. a., Tetrah. Lett., 28, 5651 [1987]).

Besonders der Dimethoxyphenoxyvaleriansäure-Anker, der an mit Alanin beladenes Benzhydrylamin-Polystyrol über die Carboxygruppe geknüpft wurde, bewährt sich. Nach Kupplung der C-terminalen Fmoc-geschützten Aminosäure mit Standardmethoden, z. B. DCCI oder DIC/HOBt bei Raumtemperatur über Nacht.

Nach Abspaltung der Aminoschutzgruppe der an das Harz gekuppelten Aminosäure mit einem geeigneten Reagenz, z. B. Trifluoressigsäure in Dichlormethan im Falle der BOC-Gruppe oder einer 20-50%igen Lösung von Piperidin in DMF im Falle der Fmoc-Gruppe, werden die geeignet geschützten Aminosäuren angekuppelt. Dieser Cyclus wird nacheinander so oft durchlaufen bis das gewünschte Harz-gebundene Peptid entstanden ist.

Zur Kupplung können die in der Peptidchemie bekannten Methoden (s. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 15/2) angewendet werden. Bevorzugt verwendet werden Carbodiimide, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid oder Ethyl-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid oder O-Benzotriazol-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphat oder Benzotriazol-1-yl-oxy- tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat. Durch Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) oder 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrobenzotriazin (HOObt) kann gegebenenfalls die Racemisierung unterdrückt bzw. die Reaktionsgeschwindigkeit gesteigert werden. Die Aminosäuren Asn und Gln werden bevorzugt in Form ihrer N-geschützten p-Nitrophenylester gekuppelt. Die Kupplungen werden normalerweise mit einem 2- bis 5fachen Überschuß an N-geschützter Aminosäure und Kupplungsreagenz in Lösungsmitteln wie Dichlormethan, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon (NMP) oder Gemischen aus diesen durchgeführt. Der Verlauf der Kupplungsreaktion wird durch den Kaiser-Test (E. Kaiser u. a., Anal. Biochem., 34, 595 [1970]) oder durch den TNBS-Test verfolgt. Falls eine unvollständige Acylierung festgestellt wird, wird die Kupplung bis zur Vollständigkeit wiederholt. Die Festphasensynthese kann sowohl manuell als auch automatisch mit Hilfe eines Peptidsynthesizers erfolgen.

Bevorzugt werden Festphasensynthesen unter Verwendung des Dimethoxyvaleriansäure-Linkers, Fmoc-Aminoschutzgruppen und des automatischen Synthesizers von ABI mit selbst entwickelten Syntheseprogrammen. Es werden Doppelkupplungen durchgeführt; die erste mit DCC/HOBt in DMF, die zweite mit symmetrischen Anhydriden in N-Methylpyrrolidon. Nach der ersten Kupplung wird ein Waschschritt mit E-Ethylmorpholin in NMP zwischengeschaltet. Nach der zweiten Kupplung erfolgt Capping mit Acetanhydrid und N-Ethylmorpholin. Gewaschen wird das Harz nach jedem Kupplungsschritt mit DMF, NMP und Isopropanol.

Die zum Teil bei den Sequenzen der vorliegenden Erfindung auftretende N-terminale Acetylgruppe wird durch Acetylierung des Peptids am Harz mit Acetanhydrid oder Acetylimidazol in DMF oder NMP mit eventuellem Zusatz von Pyridin als Base eingeführt.

Nach Aufbau der Peptide am Harz kann das Peptid mit geeigneten Reagenzien wie flüssigem Fluorwasserstoff im Falle der nach der BOC-Strategie aufgebauten Peptide oder Trifluoressigsäure im Falle der nach der Fmoc-Strategie aufgebauten Peptide vom polymeren Träger abgespalten werden. Bei Verwendung der oben angeführten Ankergruppen erhält man direkt die entsprechenden Peptidamide. Mit diesen Reagenzien werden in der Regel und bei Verwendung der entsprechenden Seitenkettenschutzgruppen auch die funktionellen, während der Synthese geschützten Gruppen des Peptids freigesetzt.

Üblicherweise werden bei der Abspaltung des Peptids vom Harz als Kationenfänger Substanzen wie Phenol, Kresol, Anisol, Thiokresol, Thioanisol, Indol, Dimethylsulfid oder Ethylmethylsulfid oder eine Mischung dieser Substanzen dem Fluorwasserstoff bzw. der Trifluoressigsäure zugesetzt.

Der Aufbau der Disulfidbrücke erfolgt nach Abspaltung der Peptide vom Harz nach üblichen Methoden, z. B. Houben-Weyl, Bd. 15/1, oder B. Kamber u. a., Helv. Chim. Acta, 61, Fasc 4, 899 (1980), bevorzugt mit Luftsauerstoff oder Jod in Methanol oder Essigsäure.

Die beschriebenen Homoarginin enthaltenden Peptide werden durch Umsatz der entsprechenden Lysin-Derivate mit O-Methylisoharnstoff hergestellt oder durch direkten Einsatz geeignet geschützter Homoarginin-Derivate.

Die Reinigung der erhaltenen Rohprodukte erfolgt mittels Gelchromatographie z. B. an Sephadex G25 (MR<1400) oder G15 (MR<1400) mit 1%iger oder 5%iger Essigsäure. Falls erforderlich erfolgt die weitere Aufreinigung mittels präparativer RP-HPLC mit Methanol- oder Acetonitril-Wasser-Gradienten unter Zusatz von 1 bis 2% Trifluoressigsäure. Zur Reinigung können auch Kationenaustauscher auf Sephadex- oder Polystyrol-Basis angewendet werden.

Analytik

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können mittels RP-HPLC auf Reinheit geprüft werden. Es wird jeweils eine Aminosäureanalyse am Ionenaustauscher (LKB) und am Gaschromatographen an chiraler Säule zur zusätzlichen Racemisierungskontrolle durchgeführt. Darüber hinaus werden 13C-NMR-Spektren (Bruker 400 MHz) sowie FAB-Massenspektren (MAT711, Varian) aufgenommen. Die Prüfung auf Peptidamide erfolgt mittels Resistenzermittlung gegenüber Carboxypeptidase Y.

Die Sequenzbestimmung erfolgt mittels Gasphasensequenzierung.

Die für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen entsprechen dem üblichen Dreibuchstabencode wie er z. B. in Europ. J. Biochem., 138, 9 (1984), beschrieben ist. Die übrigen Abkürzungen werden nachfolgend erklärt.

Ac
= Acetyl
Acm	= Acetamidomethyl
BOC	= tert-Butyloxycarbonyl
t-Bu	= tert-Butyl
Bum	= tert-Butyloxymethyl
Bzl	= Benzyl
Cl-Z	= 4-Chlorbenzyloxycarbonyl
DCC	= Dicyclohexylcarbodiimid
DIC	= Diisopropylcarbodiimid
DMF	= N,N-Dimethylformamid
Dnp	= 2,4-Dinitrophenyl
Fmoc	= 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt	= 1-Hydroxybenzotriazol
4-Mebzl	= 4-Methylbenzyl
Mtr	= 4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenylsulfonyl
Mts	= Mesitylen-2-sulfonyl
Pmc	= 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
pNP	= 4-Nitrophenyl
Trt	= Trityl

Beispiel 1 H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Arg- His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg- Tyr-NH₂

Die Synthese erfolgte mit einem Peptidsynthesizer Modell 430A der Fa. Applied Biosystems unter Anwendung der Fmoc-Strategie unter Verwendung der Dimethoxyvalerianoyloxybenzylamid-Ankergruppe (Beladung ca. 0,5 mmol/g Harz), beginnend mit der Ankondensation von Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH an das Harz mittels DIC/HOBt in DMF (Doppelkupplung von jeweils 2 Moläquivalenten). Die Synthese wurde über ein modifiziertes Steuerungsprogramm durchgeführt. Folgende Aminosäure-Derivate wurden verwendet: Fmoc-Arg(Mtr)-OH, Fmoc-Gln-OpNP, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-NH-(CH₂)₅-COOH, Fmoc-Lys(BOC)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Pro-OH und BOC-Tyr(t-Bu)-OH.

Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurde mit 25%iger Piperidin-Lösung in DMF durchgeführt (2×10 min), anschließende Waschschritte mit DMF. Die erste Kupplung erfolgte jeweils mit Fmoc-Aminosäure/DIC/HOBt mit jeweils 2 Moläquivalenten (30 min Voraktivierung), die Kupplungszeit 60 oder 90 min. Die Voraktivierungszeit bei Fmoc-Gln-OH/pNP-OH und Fmoc-Asn-OH wurde auf 10 min reduziert. Lösungsmittel war DMF, im Fall von Fmoc-Gln-OpNP NMP. Danach wurde mit DMF, NMP, Isopropanol und N-Ethylmorpholin in NMP gewaschen; die zweite Kupplung mit den symmetrischen Anhydriden der Fmoc-Aminosäuren erfolgte in NMP. Dann wurde mit DMF, NMP und Isopropanol gewaschen und der Cyclus mit der nächsten Aminosäure angeschlossen. Die Abspaltung des Peptids vom polymeren Träger geschah mit Trifluoressigsäure (4h). Der vollständigen Abspaltung der Mtr-Schutzgruppe diente die 30minütige Behandlung des Rohpeptids mit Trifluoressigsäure bei 50°C. Die Reinigung wurde mittels Gelchromatographie an Sephadex G15 mit 1%iger Essigsäure durchgeführt. Das saubere Peptid wurde lyophilisiert.

HPLC an Nucleosil C18,5 u, 4,6×250 mm; Detektion bei 220 nm Gradient: 15% B auf 60% B in 30 min, linear (A=Wasser/Trifluoressigsäure 100 : 0,1, B = Acetonitril/Trifluoressigsäure 100 : 0,1) Fluß 1 ml/min;
Retentionszeit 22,3 min;
Aminosäureanalyse: gemessen (theoretisch)
Arg 3.00(3), Asn 1.07(1), Thr 1.04(1), Gln 0.99(1), Leu 0.93(1), Ile 1.91(2), His 1.03(1), Tyr 2.77(3), Pro 0.82(1), Ser 0.86(1), Lys 0.85(1);
Racemisierung <3,5%;
kein Verdau mit Carboxypeptidase Y;
Gasphasensequenzierung: Tyr-Pro-Ser-Lys-Ende des Edman- Abbaus.

Beispiel 2 H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Leu- Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln- Arg-Tyr-NH₂

Wie unter Beispiel 1 beschrieben, wurde die Synthese durchgeführt.

HPLC: Retentionszeit 24,6 min;
Aminosäureanalyse:
Arg 3.00(3), Asn 1.02(1), Thr 1.05(1), Gln 1.02(1), Leu 2.11(2), Ile 2.04(2), His 0.94(1), Tyr 2.71(3), Pro 0.95(1), Ser 1.05(1), Lys 0.97(1);
Racemisierung <3,4%;
kein Verdau mit Carboxypeptidase Y;
Gasphasensequenzierung: Tyr-Pro-Ser-Lys-Ende des Edman- Abbaus.

Beispiel 4 Ac-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₅-CO-Arg-His- Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr- NH₂

Wie unter Beispiel 1 beschrieben, wurde die Synthese durchgeführt. Abweichungen: Die Kupplung des N-terminalen Tyrosins wurde als Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH mit anschließender Fmoc-Abspaltung und Acetylierung mit Acetylimidazol in DMF (5 Moläquivalente, 30 min) durchgeführt.

HPLC: Retentionszeit 18,5 min;
Aminosäureanalyse:
Tyr 2,71(3), Pro 0.96(1), Ser 0.86(1), Lys 1.00(1), His 1.09(1), Ile 1.90(2), Leu 1.04(1), Asn 0.97(1), Thr 1.00(1), Gln 0.95(1), Arg 3.23(3).

Beispiel 6 H-Tyr-Pro-NH-(CH₂)₁₀-CO-Tyr-Ile-Asn- Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂

Die Synthese erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.

HPLC: Retentionszeit 23,4 min;
Aminosäureanalyse:
Tyr 2.53(3), Pro 0.93(1), Ile 1.96(2), Leu 1.00(1), Asn 0.99(1), Thr 1.00(1), Gln 1.02(1), Arg 2.09(2).

Beispiel 7 H-Tyr-NH-(CH₂)₁₀-CO-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂

Die Synthese erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.

HPLC: Retentionszeit 24,9 min;
Aminosäureanalyse:
Tyr 3.26(3), Ile 1.97(2), Leu 1.05(1), Asn 0.98(1), Thr 1.00(1), Gln 1.09(1), Arg 2.17(2).

Beispiel 8 H-Tyr-Pro-Ser-NH-(CH₂)₅-CO-Tyr-Ile-Asn- Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH₂

Die Synthese erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.

HPLC: Retentionszeit;
Aminosäureanalyse:
Tyr 2.61(3), Pro 1.10(1), Ser 0.93(1), Ile 1.90(2), Leu 1.00(1), Asn 1.04(1), Thr 1.00(1), Gln 1.00(1), Arg 2.07(2).

Beispiel 10 H-Tyr-Pro-Ser-Lys-NH-(CH₂)₇-CO-Arg-His- Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr- NH₂

Die Synthese erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.

HPLC: Retentionszeit 19,3 min;
Aminosäureanalyse:
Tyr 2.97(3), Pro 0.90(1), Ser 0.83(1), Lys 0.94(1), His 1.10(1), Ile 1.92(2), Leu 1.08(1), Asn 0.97(1), Thr 1.00(1), Gln 1.03(1), Arg 3.03(3).

Beispiel 11 H-Tyr-Pro-Ser-NH-(CH₂)₁₀-CO-Arg-His- Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg- Tyr-NH₂

Die Synthese erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.

HPLC: Retentionszeit;
Aminosäureanalyse:
Tyr 2.70(3), Pro 0.90(1), Ser 0.90(1), His 1.05(1), Ile 2.00(2), Leu 1.04(1), Asn 0.99(1), Thr 1.00(1), Gln 1.04(1), Arg 3.15(3).

Beispiel 19 Ac-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg- Gln-Arg-Tyr-NH₂

Die Synthese erfolgte analog zu der in Beispiel 4 beschriebenen Weise.

HPLC: Retentionszeit 25,6 min;
Aminosäureanalyse:
Thr 0.98(1), Ile 1.82(2), Leu 1.00(1), Gln 1.09(1), Tyr 1.86(2), Arg 2.73(3), Asn 1.00(1), His 1.01(1);
FAB-MS: M+H 1673.

Beispiel 20 Ac-Lys-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg- Gln-Arg-Tyr-NH₂

Die Verbindung wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen Weise hergestellt.

HPLC: Retentionszeit 22,3 min;
Aminosäureanalyse:
Arg 2.00(2), Tyr 2.06(2), Gln 1.03(1), Thr 1.07(1), Ile 1.80(2), Leu 0.99(1), Asn 1.00(1), His 0.98(1), Lys 0.97(1).

Beispiel 22 Ac-Lys-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Lys-Gln- Lys-Tyr-NH₂

Die Verbindung wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen Weise erhalten.

HPLC: Retentionszeit 24,1 min;
Aminosäureanalyse:
Thr 0.95(1), Ile 2.07(2), Leu 1.01(1), Gln 0.99(1), Tyr 2.06(2), Lys 3.03(3), His 0.95(1);
FAB-MS: M+H 1589.

Beispiel 23 Ac-Lys(Ac)-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr- Lys(Ac)-Gln-Lys(Ac)-Tyr-NH₂

Die Verbindung wurde analog der in Beispiel 4 angegebenen Art synthetisiert. Nach Abspaltung des Peptids vom Harz wurden die ε-Seitenkettenaminogruppen mit Acetylimidazolin in DMF acetyliert.

HPLC: Retentionszeit 27,8 min;
FAB-MS: m+H 1589.

Beispiel 24 Ac-Orn-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Orn- Gln-Orn-Tyr-NH₂

Die Verbindung wurde analog der in Beispiel 4 angegebenen Weise erhalten.

HPLC: Retentionszeit 24,1 min;
Aminosäureanalyse:
Thr 0.95(1), Ile 1.93(2), Leu 1.05(1), Gln 0.99(1), Tyr 2.00(2), Orn 3.12(3), Asn 1.00(1), His 0.93(1).

Die übrigen obengenannten Verbindungen (Verbindungen 3, 5, 9, 12-18 und 21) werden analog hergestellt.

Injektionslösung
Verbindung aus Beispiel 1	8 g
Methylparaben	5 g
Polyparaben	1 g
Natriumchlorid	25 g
Wasser für die Injektion	5 l

Die Verbindung, die Konservierungsstoffe und Natriumchlorid werden in 3 l Wasser für die Injektion gelöst und auf 5 l mit Wasser für die Injektion aufgefüllt. Die Lösung wird steril gefiltert und aseptisch in vorsterilisierte Flaschen gefüllt, die mit sterilisierten Gummikappen verschlossen werden. Jede Flasche enthält 5 ml Lösung.

Claims

1. Verbindung der allgemeinen Formel I R₁-U-X-Y-Z-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-X-W-X-Z-NH₂ (I)und deren pharmazeutisch annehmbare Salze, worin
R₁ für R₂-CO oder für einen peptidisch gebundenen Di-, Tri-, Tetra- oder Pentapeptid-Rest der Zusammensetzung H-Z-Pro-S-X-V-, H-Z-Pro-S-V-, H-Z-Pro-V-, H-Z-V- oder Acetyl-Z-Pro-S-X-V-,
S für Ser, Glu, Cys oder eine Bindung,
U für eine aliphatische Aminosäure wie Leu, Ile, Val, Ala oder eine Bindung,
X für eine basische Aminosäure wie Arg, Lys, Orn und Homo-Arg oder für eine basische Aminosäure, bei der die Aminogruppe der Seitenkette acetyliert ist (z. B. Lys(Ac), Orn(Ac)), oder eine Bindung,
Y für eine Aminosäure wie His, Trp, Phe und Tyr oder eine Bindung,
Z für eine Aminosäure wie Tyr, Phe, His, Trp oder eine unnatürliche Aminosäure wie z. B. Naphthylalanin oder substituierte Phenylalanin-Derivate oder wenn Z nicht C-terminal steht auch für Cys,
W für eine Aminosäure wie Gln, Asn, Glu, Asp,
V für einen ω-Aminoalkansäure-Rest wie ε-Aminocapronsäure-Rest oder einen Rest der allgemeinen Formel NH-(CH₂)_n-CO oder NH-(CH₂)_n-CONH-(CH₂)_n CO mit n=2 bis 15 oder eine Aminosäuresequenz mit Turn-Struktur wie z. B. Pro-Gly-T, Asn-Ser-T und Cys-Cys bzw. Homo-Cys-Homo-Cys, die jeweils über ihre Seitenketten disulfidisch miteinander ringgeschlossen sein können,
T für eine der natürlichen Aminosäuren,
R₂ für C₁- bis C₇-Alkyl oder Benzyl
steht und worin ferner
wenn S für Glu und das nicht C-terminale Z für Tyr steht, die Seitenkette-Carboxylgruppe mit der phenolischen OH-Gruppe des Tyrosins esterartig verknüpft sein kann und
falls S für Cys und das nicht C-terminale Z für Cys stehen, die Seitenketten dieser Aminosäuren disulfidisch miteinander verknüpft sein können.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Symbole der Formel I folgende Bedeutungen haben:
R₁: R₂-CO, H-Z-Pro-S-X-V-, H-Z-Pro-S-V-, H-Z-Pro-V-, H-Z-V- oder Acetyl-Z-Pro-S-X-V-,
S: Ser oder Glu,
U: Leu oder eine Bindung,
X: Arg, Lys, Orn oder Homo-Arg,
Y: His oder Trp,
Z: Tyr oder Phe,
W: Gln oder Asn,
V: ω-Aminoalkansäure-Rest wie HN-(CH₂)_n-CO und NH-(CH₂)_n-CONH-(CH₂)_n-CO mit n=2 bis 10,
R₂: für C₁- bis C₇-Alkyl oder Benzyl.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ die Gruppe CH₃CO bedeutet.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin in der Definition von R₁ Z für Tyr oder Phe steht, S für Ser oder eine Bindung und X für Lys oder eine Bindung.

5. Verbindung nach Anspruch 1 oder 4, worin V die Gruppe HN-(CH₂)_5-10-CO- bedeutet.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin in der Sequenz -U-X-Y-Z- U für Leu oder eine Bindung, X für Arg, Lys, Lys(Ac), Orn oder eine Bindung, Y für His, Trp oder eine Bindung und Z für Tyr oder Phe steht.

7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin in der Sequenz -X-W-X-Z- X für Arg, Lys, Lys(Ac) oder Orn, W für Gln und Z für Tyr steht.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 durch schrittweise Kondensation der jeweiligen Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch den Gehalt einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.