DE3787539T2

DE3787539T2 - Vorrichtung für die kontinuierliche Filtration von Zellkulturen.

Info

Publication number: DE3787539T2
Application number: DE87870014T
Authority: DE
Inventors: Raymond Charles Geimer; William Robert Tolbert
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-02-03
Filing date: 1987-02-02
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2007-02-03
Also published as: CA1267623A; DE3787539D1; JPS62210980A; ES2000168A4; JPH0817691B2; EP0233168A2; CA1267623C; US4639422A; EP0233168B1; ATE95229T1; EP0233168A3; AU6821587A; ES2000168T3; AU599074B2

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues Zellkultursystem und insbesondere eine verbesserte kontinuierliche Zellkulturfiltervorrichtung und ein Verfahren, das zur Züchtung von Zellen von Säugern in großem Umfang geeignet ist.
Die Entwicklung von Reaktionsgefäßen und ähnlichen Vorrichtungen zum Züchten großer Mengen fragiler, komplexer Zellen, welche Zellen kommerziell wertvolle Proteine synthetisieren, in einer Kultur hat in den letzten Jahren eine wesentliche Bedeutung erlangt. Verfahren für eine solche Züchtung von Zellen von Säugern in großem Umfang sind wohlbekannt und beispielsweise in mehreren Artikeln von Tolbert et al., Biotech. Bioeng. XXIV, 1671-1679 (1982); Tolbert and Feder, Ann. Rept. Ferm. Proc., Bd. 6, Kap. 3, S. 35-74 (1983); Harakas, Ibid., Bd. 7, Kap. 7, S. 159-211 (1984); und in diesen Publikationen zitierten Literaturstellen beschrieben.
Die Verwendung eines Zellkulturreaktionsgefäßes mit gesteuertem Rühren mittels eines Magnetrührstabes oder eines mechanisch angetriebenen Rührflügels auf einer Welle ist ein typisches Merkmal von Suspensionszellkulturvorrichtungen. Beispiele für eine solche Vorrichtung sind in den U.S. Patenten Nr. 2,958,517; 3,039,932; 3,572,651; 3,622,122; und 3,649,465 beschrieben. Diese sind im wesentlichen Rotationskulturgeräte vom Chargentyp oder Rotationskolben, in welchen die Zellen in einer bestimmten Menge an Nährstoff unter geeigneten Kulturbedingungen bis zum Aufhören des Zellwachstums inkubiert werden.
Kontinuierliche Zellkultursysteme und Vorrichtungen, bei welchen frisches Medium zugesetzt und verbrauchtes Medium von den wachsenden Zellen durch Filtration abgetrennt und kontinuierlich oder halbkontinuierlich aus dem Kolben abgezogen werden kann, sind auch schon früher beschrieben worden, wie aus den U.S. Patenten Nr. 4,166,768 und 4,178,209 ersichtlich.
Zum sanften Rühren des Suspensionszellkultursystems wurde eine Vorrichtung mit biegsamen Blättern am Betätigungsarm vorgesehen, die sich mit dem Flüssigkeitsstrom während der Rotation des Rührarms biegen und wie ein Segel schwellen können, wie im U.S. Patent 4,289,854 geoffenbart.
Ungeachtet der Vorteile des zuvor erwähnten Zellkultursystems mit den biegsamen Rührblättern kam es zu Schwierigkeiten mit den Möglichkeiten zum Zusammenbauen und Zerlegen der Vorrichtung. Es ist erwünscht, diese Schwierigkeiten zu verringern und die Vorrichtung für die kommerzielle Verwendung bei der Herstellung von medizinisch wichtigen Proteinen und Hormonen zu verbessern. Eine vollständige Reinigung der Vorrichtung zwischen verschiedenen Zellkulturläufen zur Erreichung der Bestätigung durch die Food and Drug Administration (FDA) würde durch verbesserte Möglichkeiten zum Zusammenbauen und Zerlegen der Vorrichtung erleichtert.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine verbesserte kontinuierliche Zellkulturfiltervorrichtung und ein Verfahren zur Züchtung von Zellen von Säugern in großem Umfang geschaffen. Dieses System ist zum praktischen händischen Zusammenbauen und Zerlegen innerer Teile und Austauschen von Filtereinheiten ausgelegt.
Die Vorrichtung dieser Erfindung weist somit auf:
(A) ein Hohlgefäß mit einer Öffnung an seiner Oberseite,
(B) eine ortsfeste Hohlwelleneinrichtung, die innerhalb des Gefäßes in Fluidverbindung mit der oberen Öffnung des Gefäßes positioniert und von dort nach unten hängend ohne jegliches unteres Lager abgestützt ist,
(C) eine ortsfeste Filtereinheit, die ohne jegliches unteres Lager und ohne jegliche sich bewegende Dichtungen zwischen der Filtereinheit oder jeglichem sich bewegenden Filterträgermittel, das die Zellsuspension berühren könnte, von der Welleneinrichtung nach unten ragend abgestützt ist, welcher Filter
(1) einen Fluidsammelhohlraum in direkter Verbindung mit dem Inneren der Welleneinrichtung und der Oberseite des Gefäßes, und
(2) eine poröse äußere Oberfläche mit einer Porengröße, die kleiner als die zu züchtenden Zellen oder die Trägerteilchen, an welchen diese Zellen haften, ist, doch groß genug ist, um ein Permeieren von Fluid in den Fluidsammelhohlraum zu ermöglichen, aufweist,
(D) eine drehbare Rühreinrichtung, die von der Welleneinrichtung nach unten ragend abgestützt und zwecks Drehung konzentrisch um die Filtereinheit herum so angeordnet ist, daß sie von Lagerungen, die mit geringer Reibung an der Hohlwelleneinrichtung angreifen, herunterhängt,
(E) wobei die Welleneinrichtung einen zwischen der Filtereinheit und den Lagerungen positionierten vorspringenden Bund und einen Federsitz hat, die zur Halterung von zwischen dem vorspringenden Bund und der Filtereinheit positionierten Federmitteln verwendbar sind,
(F) wobei die Rühreinrichtung eine Mehrzahl von an ihr aufgehängten biegsamen Flügeln aufweist, die in Umfangsrichtung im wesentlichen im gleichen Abstand voneinander angeordnet sind und sich im wesentlichen durch die gesamte Länge der Filtereinheit erstrecken, wobei diese Flügel zwischen einem Paar scheibenförmiger Haltemittel sowohl am oberen als auch am unteren Ende der Flügel quer zur Achse der Rühreinrichtung gehaltert sind, wobei das untere Element des oberen Paares und das obere Element des unteren Paares der Haltemittel in Umfangsrichtung im Abstand voneinander befindliche Seitenschlitze zur Aufnahme der Breite der Flügel aufweisen, und wobei diese Flügel an jedem Ende elastomere Elemente aufweisen, die zwischen dem entsprechenden Paar Haltemittel zusammengedrückt sind.
Die vorstehende Vorrichtung kann zur Durchführung des Filtrationsschritts beim Verfahren zur Züchtung von Tierzellen in einer gerührten flüssigen Suspension eines nährenden Kulturmediums in einem Chargen- oder in einem kontinuierlichen System verwendet werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Obgleich die Beschreibung mit Ansprüchen endet, die den Gegenstand, der als die vorliegende Erfindung angesehen wird, besonders herausstreichen und genau beanspruchen, wird angenommen, daß die Erfindung aus der folgenden Beschreibung in Zusammenhang mit den beiliegenden Zeichnungen besser verstanden wird, worin:
Fig. 1 eine Seitenansicht, teilweise im Querschnitt ist, die eine Ausführungsform der Zellkulturfiltervorrichtung der vorliegenden Erfindung zeigt;
Fig. 2 eine Draufsicht auf die Vorrichtung der Fig. 1 ist;
Fig. 3 eine perspektivische, teilweise weggebrochene Ansicht ist, die einen Rührflügel der Fig. 1 zeigt;
Fig. 4 eine Endansicht einer oberen Klemmplatte für eine Mehrzahl von Rührflügeln der Fig. 3 ist;
Fig. 5 eine Endansicht einer unteren Klemmplatte für eine Mehrzahl von Rührflügeln der Fig. 3 ist;
Fig. 6 eine Endansicht der Rührrahmenaufhängevorrichtung der Fig. 1 ist;
Fig. 7 eine Seitenansicht ist, die teilweise im Querschnitt und teilweise weggebrochen eine andere Ausführungsform der für die Vorrichtung der Fig. 1 ausgelegten Filtereinheit zeigt.
Unter besonderer Bezugnahme auf die Fig. 1 bis 6 bezieht sich das Bezugszeichen 10 allgemein auf ein Zellkulturfiltergefäß, das bei der kontinuierlichen Suspensionskultur von Zellen von Säugern verwendet werden kann. Es ist besonders zur Verwendung als Nebengefäß durch geeignete Schlauchmittel in einer Reihe mit anderen Zellkulturreaktionsgefäßen ausgelegt. Beispielsweise kann das Zellkulturgefäß 10 als Filtermittel für ein (nicht dargestelltes) Hauptzellkulturgefäß, das für das Wachstum der Zellen verwendet wird, dienen. Das Gefäß 10 ist vorzugsweise aus durchsichtigem Glas oder nicht-toxischen, starren Kunststoffmaterialien, kann aber auch aus biologisch verträglichen Metallen, wie beispielsweise rostfreiem Stahl, sein. Es ist gezeigt, daß das Gefäß 10 eine im allgemeinen zylindrische Form mit Seitenwänden 11, einem Boden 12 und einer Öffnung 13 aufweist. Es ist dargestellt, daß die Öffnung mit einer Abdeckplatte 14 geschlossen ist, die in ihrer Mitte einen erhöhten rohrförmigen Abschnitt 15 aufweist.
Das Zellkulturfiltergefäß 10 ist auch mit einer Mehrzahl von Öffnungen in den Seitenwänden ausgestattet. So kann eine rohrförmige Öffnung 16 nahe dem Boden des Gefäßes zur Zugabe oder zum Entfernen von Kulturfluid durch eine Leitung zum Hauptkulturreaktionsgefäß (nicht dargestellt) verwendet werden. Zusätzliche Öffnungen, wie sie für den Fluidtransfer u. dgl. erwünscht sein können, können sich in den Seitenwänden befinden. Bei der illustrativen Ausführungsform der Fig. 1 sind zwei obere rohrförmige Seitenöffnungen 17 und 18 zur Aufnahme von Fluidniveausonden 19 bzw. 20 ausgelegt, die zur Bestimmung des Fluidniveaus im Zellkulturgefäß verwendet werden. Praktischerweise können diese Sonden in den Öffnungen 17 und 18 mittels geeigneter Mittel gehaltert sein, wie beispielsweise Gummistopfen, oder mittels einer in der Öffnung befindlichen zusammendrückbaren O-Ringdichtung 22, die zum Andrücken an einen die Sonde enthaltenden gleitfähigen Einsatz ausgelegt ist. Eine weitere rohrförmige Öffnung 21 zur Zirkulation von Kulturfluid ist an der gegenüberliegenden Seitenwand der Ausführungsform der Fig. 1 gezeigt.
Eine drehbare Rühreinheit 25, die um den Umfang einer länglichen, ortsfesten Welle 26 herum aufgehängt ist, ist vertikal im Zellkulturfiltergefäß 10 positioniert. Die Rühreinheit umfaßt eine Rührerrahmenaufhängevorrichtung 27, einen offenen, in Umfangsrichtung verlaufenden Rührerrahmen 28, einen Magneten 23 und eine Mehrzahl von biegsamen Segeln oder Flügeln 30.
Es ist gezeigt, daß die längliche Hohlwelle 26 kleine Löcher 31 aufweist, die durch beide Seiten der Welle im unteren Abschnitt des Gefäßes angeordnet sind. Diese Öffnungen gestatten das Abziehen von filtriertem Kulturfluid aus der Gefäßkammer an der Oberseite durch Hindurchtreten durch die Bohrung der Welle 26.
Eine ortsfeste, ersetzbare Filtereinheit oder Patrone 35 ist ebenfalls vertikal innerhalb des Zellkulturgefäßes 10 angeordnet und in Umfangsrichtung um die Welle 26 im Rührerrahmen aufgehängt. Es ist gezeigt, daß die Filtereinheit einen im allgemeinen zylindrischen Körper mit einem inneren Sammelhohlraum aufweist. Sie besteht vorzugsweise aus mikroporösem Porzellan, gesintertem rostfreiem Stahl, Teflon®-Kunststoff oder anderen derartigen mikroporösen Filtermaterialien. Durch Anordnung der Löcher 31 in einer Weise, daß sie sich in den Hohlraum der Filtereinheit 35 öffnen, kann verbrauchtes Kulturfluid filtriert und durch die Welle 26 abgezogen werden.
Die Rührerrahmenaufhängevorrichtung 27 weist ein im allgemeinen zylindrisches, drehbares Außenrohr 36 mit einem ringförmigen Flansch 37 von vergrößertem Durchmesser an seiner Basis, eine fixierte, konzentrische Innenhülse 38 und ein Paar Kugellageranordnungen 39 und 40 auf, die sich zwischen und an gegenüberliegenden Enden der Innenhülse und des Außenrohres befinden. Das Rohr 36 ist konzentrisch zur Welle 26 und so positioniert, daß es knapp über dem einen vergrößerten Durchmesser aufweisenden Abschnitt 41 der Welle endet. Die Hülse 38 hat an entgegesetzten Enden Abschnitte mit verringertem Außendurchmesser, um die Lager 39 und 40 aufzunehmen. Die Lager werden weiters durch einen einen verringerten Innendurchmesser aufweisenden Abschnitt 42 des Rohres 36 an seinem unteren Ende, einen auf dem unteren Rohrende befindlichen inneren O-Ring 43 und ringförmige, konzentrische Lagerklemmplatten 44 und 45 am oberen Ende des Rohres 36 gehalten. Der Außendurchmesser der Klemmplatte 44 ist etwas kleiner als der Innendurchmesser der Klemmplatte 45, um eine Unabhängigkeit der Lagerringe und eine Druckverteilung zwischen den Lagern 39 und 40 zu ermöglichen. Die innere Klemmplatte 44 hat drei Löcher, die sich in Umfangsrichtung im gleichen Abstand voneinander befinden, zur Aufnahme von drei mit einem Gewinde versehenen Stäben 46, die im oberen Rand oder vorspringenden Bund 47 des vergrößerten Rohrabschnitts 41 befestigt sind. Muttern 49 mit entsprechenden Sicherungsscheiben halten dann die Platte 44 fest. Gewünschtenfalls können zusätzliche Niederhaltestäbe mit Befestigungsmitteln verwendet werden, doch ist eine Anzahl von drei bevorzugt. Eine äußere Klemmplatte 45 hat ebenfalls drei Löcher, die sich in Umfangsrichtung im gleichen Abstand voneinander befinden und die über drei mit einem Gewinde versehene Ansätze 29 im oberen Rand des Rohres 36 passen, welche drei Muttern 48 mit entsprechenden Sicherungsscheiben aufnehmen, die die Platte 45 am Rohr 36 befestigen.
Ein geeignetes Spiel zur Drehung des Rohres 36 um die ortsfeste Hülse 38 wird dadurch aufrecht erhalten, daß der Boden des Innenringes des unteren Lagers 40 auf dem oberen vorspringenden Bund 47 des Rohrabschnitts 41 sitzt. Der O-Ring 43 dient zur Vorbelastung der Lageranordnungen, so daß sich die Außenringe mit dem Rohr 36 drehen. Die Innenringe werden durch mechanischen Druck zusammengehalten, da die innere Klemmplatte 44 auf das obere Lager 39 drückt. Durch diese Ausgestaltung der Lageranordnung wird die Verwendung eines herkömmlichen Preßsitzes vermieden und die rasche Zusammenbau- und Zerlegbarkeit der vorliegenden Erfindung erleichtert. Ein Spiel der Teile wird beibehalten, um ein passendes Aufschieben der Lager auf Teile von Hand aus zu ermöglichen.
Um ein Autoklavieren oder eine Dampfsterilisation der inneren Teile der Rührerrahmenaufhängevorrichtung zu erleichtern, ist das Rohr 36 mit einer oberen Öffnung 32 und einer unteren Öffnung 33 durch gegenüberliegende Seitenwände versehen.
Der Rührerrahmen 28 umfaßt eine Anzahl von drei Stäben 50, die durch Löcher 34 hindurchgehen, welche sich in Umfangsrichtung im gleichen Abstand voneinander im Flansch 37 befinden. Der Rührerrahmen hängt von der Rührerrahmenaufhängevorrichtung 27 nach unten und ist so ausgelegt, daß er eine Mehrzahl biegsamer Flügel 30 hält. Vorzugsweise werden etwa 3 bis 12 Flügel verwendet. Zur Veranschaulichung sind sechs Flügel gezeigt, die vertikal zwischen einer oberen ringförmigen Flügelklemmplatte 51 und einer unteren ringförmigen Flügelklemmplatte 52, die im Rührerrahmen fixiert ist, aufgehängt sind. Der Klarheit halber sind in der Absicht der Fig. 2 nur zwei Flügel gezeigt. Die obere ringförmige Flügelklemmplatte 51 hat drei Löcher 53, die sich in Umfangsrichtung im gleichen Abstand voneinander befinden, um Stäbe 50 aufzunehmen. Eine untere ringförmige Flügelklemmplatte 52 hat auf ähnliche Weise drei mit Gewinde versehene Löcher 58 zur Befestigung an Stangen 50. Wie am besten in den Fig. 4 und 5 ersichtlich, hat jede solche Klemmplatte auch sechs Schlitze 54, die tangential durch die Plattendicke geschnitten sind und die tief genug in die Seite reichen, um die Breite des Flügels 30 aufzunehmen. Es ist gezeigt, daß jeder solche Schlitz in einem kleinen Loch 55 endet, das gegebenenfalls in der Platte zur mechanischen Entlastung gebildet sein kann. Die Schlitze sind somit vorzugsweise von der Außenseite der Platte her in einem Winkel von etwa 5 bis etwa 45 Grad in bezug auf eine Tangente an den äußeren Eintritt des Schlitzes eingeschnitten. Anpassungen dieses Winkels sind vorgesehen, um weniger oder mehr als die beim in den Fig. 4 und 5 gezeigten Winkel vorhandenen sechs Flügel zu haltern. Klemmplatten 51 und 52 sind im Rührerrahmen so positioniert, daß die vordere Kante des Flügels unten sich vor der oben gelegenen vorderen Kante des Flügels befindet, wobei die Schrägstellung der Flügel während der Drehung der Rührereinheit im Uhrzeigersinn bewirkt, daß sich die Flüssigkeit nach oben und radial in die Filtereinheit hinein bewegt. Die Stäbe 50 sind an beiden Enden mit einem Gewinde versehen, um am ringförmigen Flansch 37 und an der Platte 52 mit Muttern 56 befestigt zu werden.
Die biegsamen Flügel 30 können aus feinmaschigem Tuch oder Stoff, Kunststoffilm oder Metallfolie und anderen solchen permeablen oder impermeablen biegsamen Bahnmaterialien sein, beispielsweise einem Nylonsiebtuch oder einer biegsamen Fiberglasbahn. Ein Monofilament-Nylonsiebtuch, das unter dem Warenzeichen NITEX® von der Firma Tetko Inc. in Elmsford, N.Y., erhältlich ist und einen Nennwert der Maschenöffnungen von etwa 110 u und eine Dicke von etwa 0,005 Inch (0,0127 cm) aufweist, ist für diesen Zweck hervorragend geeignet.
Wie am besten aus Fig. 3 ersichtlich, ist ein elastisches Rohr 60, das fest oder hohl sein kann, in jedes der Enden der Flügel 30 eingenäht. Die Flügel sind dann im Rührerrahmen in ihrer Position gehalten, da diese Rohre zwischen einem Satz oberer Klemmplatten 51 und 61 an einem Ende und zwischen einem Satz unterer Klemmplatten 52 und 62 am anderen Ende eingezwängt sind. Die Klemmplatten 52 und 61 haben drei im gleichen Abstand voneinander befindliche Löcher 63 zur Aufnahme von Schrauben 64, die die oberen Platten 51 und 61 und die unteren Platten 52 und 62 zusammenhalten, während sie in mit Gewinde versehene Löcher in den Platten 51 und 62 eingeschraubt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist durch das Aufbringen von Druckfedern 71 auf die Stäbe 50 direkt unterhalb der Flügelklemmplatte 51 eine nach oben gerichtete Spannung auf die biegsamen Flügel 30 vorgesehen. Kragen 72 auf den Stäben 50 sind so ausgelegt, daß sie diese Zugfedern stützen. Eine solche Federbelastung der oberen Klemmplatten macht es leichter, die Flügel während aller Betriebsbedingungen in der bevorzugten Konfiguration zu halten.
Ein Magnet 23 vom Keramiktyp, der mit einem für Zellen nicht-toxischen Material, wie Teflon, beschichtet ist, ist an die Unterseite der Klemmplatte 62 mittels einer geeigneten Haltevorrichtung 24 befestigt gezeigt. Die Haltevorrichtung kann eine zwischen mehreren, in der Klemmplatte 62 gehalterten vertikalen Stiften positionierte Federklemme sein, wie in Fig. 1 gezeigt, oder ein anderes herkömmliches Haltemittel. Die Rührereinheit 25 kann durch Aktivieren eines unterhalb des Zellkulturfiltergefäßes 10 positionierten, sich drehenden U- förmigen, ringförmigen oder stabförmigen Magnets (nicht dargestellt) um die Welle 26 in Drehung versetzt werden. Alternativ kann eine Mehrzahl von Magnetrührstäben (nicht dargestellt), an der Unterseite der Klemmplatte 62 oder auf andere Weise am Boden der Rührereinheit 25 befestigt sein.
Es wird im Zellkulturfiltergefäß dafür gesorgt, daß Änderungen der körperlichen Größe einer Einweg-Kunststofffilterpatrone und eine Austauschbarkeit zwischen Einweg- Kunststoffiltern und festen Porzellanfiltern möglich sind. Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform ist das Zellkulturgefäß so ausgelegt, daß ein Einweg-Kunststoffilter 35 im Rührerrahmen 28 aufgehängt wird. Die Filterpatrone mit Gummidichtungen 65 und 66, die um die obere bzw. die untere Öffnung des Filters placiert sind, ist zwischen der ringförmigen oberen Filterverschlußplatte 67 und der ringförmigen unteren Filterverschlußplatte 68 eingeklemmt. Da die untere Filterverschlußplatte am unteren Ende der Welle 26 mittels einer Zylinderkopfschraube 69 befestigt ist, wird die obere Filterverschlußplatte durch eine Druckfeder 75, die zwischen einem Federsitz 76 und der Unterseite des vergrößerten Rohrabschnitts 41 getragen wird, verstellbar in Position gehalten. Ein unterer vorspringender Bund 77 auf dem Rohrabschnitt 41 dient zum Zentrieren der Feder 75. Die Feder 75 ermöglicht somit praktische Änderungen in der Größe der Filterpatrone. Sie ermöglicht auch eine Ausdehnung und ein Zusammenziehen des Filters infolge von Temperaturveränderungen während der Autoklaviervorgänge. Ein flüssigkeitsdichtes Erfassen des Filters wird durch eine zwischen dem Federsitz 76 und einer ringförmigen Ausnehmung in der Oberseite der oberen Filterverschlußplatte 67 positionierte O-Ringdichtung 78, durch eine O-Ringdichtung 79, die zwischen einer ringförmigen Ausnehmung in der Unterseite der unteren Filterverschlußplatte 68 und einer Unterlagsscheibe 70 positioniert ist und eine Zylinderkopfschraube 69, die durch das Mittelloch der Filterverschlußplatte 68 placiert und in die mit einem Gewinde versehene Öffnung der Welle 26 festgezogen ist, geschaffen.
Es ist gezeigt, daß das Zellkulturfiltergefäß 10 aus Stabilitätsgründen auf einer ringförmigen Basis 80 ruht, die eine abgeschrägte Innenkante 81 aufweist, um die Krümmung des Gefäßbodens 12 aufzunehmen. Die Abdeckplatte 14 ist über der Gefäßöffnung 13 durch eine Anzahl von drei Stäben 82 gehalten, die durch Löcher 87, die sich in Umfangsrichtung im gleichen Abstand voneinander in der Abdeckplatte befinden, hindurch und in die entsprechenden Löcher in der Basis 80 placiert sind. Die Stäbe 82 sind an ihrem unteren Ende zwecks Fixieren an der ringförmigen Basis mittels Muttern 83 mit einem Gewinde versehen. Die Abdeckplatte ist über der Kulturgefäßöffnung mittels Rändelknöpfen 84, die zum Eingreifen über den oberen, mit Gewinde versehenen Enden der Stäbe 82 mit einem Gewinde versehen sind, festgezogen. Ein Silikongummi oder eine andere derartige, zusammendrückbare O-Ringdichtung 85, die zwischen einer in Umfangsrichtung verlaufenden Ausnehmung in der Unterseite der Abdeckplatte 14 und dem Rand des Kulturgefäßes 10 positioniert ist, schafft einen flüssigkeitsdichten, abschließenden Eingriff.
Die Abdeckplatte 14 ist mit einer Öffnung zur Aufnahme einer Vakuum/Druck-Leitung 86 versehen, welche zur Erhöhung oder Verringerung des Flüssigkeitsniveaus im Kulturgefäß verwendet werden kann. Eine Anzahl von drei kurzen Haltestiften 91, die sich in Umfangsrichtung im gleichen Abstand voneinander befinden und von der Unterseite der Abdeckplatte 14 nach unten ragen, sind so ausgelegt, daß sie in die Innenwände des Zellkulturgefäßes gleitend eingreifen, um das richtige Positionieren der Abdeckplatte auf dem Gefäß zu erleichtern.
Eine leichte Zusammenbau- und Zerlegbarkeit der Zellkulturvorrichtung der vorliegenden Erfindung wird weiter durch eine äußere Beilagscheibe 90, eine Klemme 92 und eine innere O-Ring- Rohr-Paßanordnung 93 für die Welle 26 an der unteren Seite der Abdeckplatte 14 zur Bildung eines Magnetspiels an der Unterseite des Gefäßes 10 geschaffen.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wie in Fig. 7 gezeigt, in welcher Teile, die jenen der Fig. 1 ähnlich sind, mit den gleichen Bezugszeichen gezeigt sind, kann eine mikroporöse Porzellanfilterpatrone 100 rings um die zentrale Welle 26 herum aufgehängt und zwischen der ringförmigen oberen Filterverschlußplatte 67 und einer modifizierten unteren Filterverschlußplatte 101 eingeklemmt sein. Bei dieser Ausführungsform ruht die Filterpatrone auf einer Gummidichtung 102, die zwischen der unteren Kante des Filters und der Platte 101 positioniert ist. An der Oberseite des Filters ist eine O-Ring-Gummidichtung 103 zwischen der Platte 67 und einer ringförmigen Ausnehmung im oberen Rand der Filterpatrone positioniert. Die Druckfeder ist in der Ausführungsform der Fig. 7 weggelassen, und der Federsitz 76 ist direkt gegen den Boden des unteren vorspringenden Bundes 77 des Abschnitts 41 mit dem größeren Durchmesser der Welle 26 gehalten.
Im Betrieb bietet die Zellkulturvorrichtung der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Steuerung einer Bewegung von flüssigem Kulturmedium durch Erstellung eines Gleichgewichts zwischen dem Zellkulturfiltergefäß 10 und einem (nicht dargestellten) Zellkultur-Hauptreaktionsgefäß. Das System kann durch Umkehrung des Druckdifferentials über dem Flüssigkeitsniveau im Filtergefäß 10 unter Verwendung von steriler Luft und/oder von Vakuum an der Leitung 86 und Niveausonden bei 19 und 20 als ein Zellkulturdurchströmungs-Chemostatsystem ohne Verwendung von Pumpen, Ventilen oder anderen Einrichtungen unter dem Flüssigkeitsniveau, welche Zellen zerreiben, verwendet werden. So kann ein Vakuum an das System angelegt werden, um Flüssigkeit auf das Niveau der oberen Sonde bei 19 zu ziehen, und alternativ kann Druck angelegt werden, bis der Flüssigkeitsspiegel unter das Niveau der unteren Probe bei 20 sinkt.
Beim Betrieb der Zellkulturvorrichtung in einem anderen Modus kann eine kontinuierliche Strömung von Medium zur Herstellung eines Gleichgewichts praktischerweise aufrechterhalten werden, indem Kulturmedium an der Öffnung 16 eingezogen und Kulturmedium an der Öffnung 21 ausgestoßen wird, und zwar durch die Verwendung (nicht dargestellter) äußerer Einwegdurchflußventile.
Man wird verstehen, daß das Zellzüchtungsverfahren und die Vorrichtung dieser Erfindung an die Verwendung jedes der bekannten Gewebskulturmedien, wie beispielsweise Basal Medium Eagle's (BME), Eagle's Mininum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Medium 199, RPMI Medium 1640 und ausgewogene Salzlösungen (balanced salt solutions, BSS), wie jene von Eagle und Hanks, verstärkt mit verschiedenen Nährstoffen, adaptierbar sind. Diese sind im Handel erhältliche Gewebskulturmedien und sind im Detail von H. J. Morton, In Vitro 6, 98-108 (1970) beschrieben. Diese herkömmlichen Kulturmedien enthalten Aminosäuren, Mineralsalze, Vitamine und Kohlehydrate und sind oft mit Seren von Säugern, wie fötalem Rinderserum, verstärkt.
Die vorliegende Erfindung ist an alle Arten von Tierzellen, beispielsweise Zellen von Säugern, Geflügel und Amphibien, sowie an Pflanzenzellen, z. B. Karottenzellen, adaptierbar. Primärzellen von embryonalem-, Erwachsenen- oder Tumorgeweben sowie Zellen kontinuierlicher Zellinien können so verwendet werden. Beispiele für typische Zellen dieser Art sind primäre Rhesusaffen-Nierenzellen, Kleinhamster-Nierenzellen, Mäuseembryo- Fibroblasten, normale Humanlungen-Embryofibroblasten, HeLa- Zellen, primäre und sekundäre Hühnerfibroblasten und verschiedene, mit SV-4O oder Polyoma-Virus transformierte Zellen, sowie gentechnisch hergestellte rekombinante Zellen. Bei Verwendung primärer und nicht-kontinuierlicher Zellinien ist es im allgemeinen vorzuziehen, Mikroträger in den Kulturmedien zur Zellbefestigung zu inkludieren. Während die gezüchteten Zellen wertvolle Proteine und Hormone in das Kulturmedium abgeben, kann das verbrauchte Kulturmedium durch die Filtereinheit abgezogen und von den Zellen abgetrennt und in ein Nebengefäß ausgetragen werden, von wo die erwünschten Proteine und Hormone durch verschiedene herkömmliche Protein-Isolier- und Reinigungstechniken gewonnen werden können.
Obwohl verschiedene Konstruktionsmaterialien der Vorrichtung der Erfindung veranschaulicht sind, wird man verstehen, daß verschiedene andere Materialien verwendet werden können. Die Innenteile sollten jedoch aus mit den Zellen und dem Kulturmedium verträglichen Materialien konstruiert sein.

Claims

1. Kontinuierliche Zellkulturfiltervorrichtung mit

(A) einem Hohlgefäß (10) mit einer Öffnung (13) an seiner Oberseite,

(B) einer ortsfesten Hohlwelleneinrichtung (26), die innerhalb des Gefäßes (10) in Fluidverbindung mit der oberen Öffnung (13) des Gefäßes (10) positioniert und von dort nach unten ragend ohne jegliches unteres Lager abgestützt ist,

(C) einer ortsfesten Filtereinheit (35), die ohne jegliches unteres Lager und ohne jegliche sich bewegende Dichtungen zwischen der Filtereinheit oder jeglichem sich bewegenden Filterträgermittel, das die Zellsuspension berühren könnte, von der Welleneinrichtung (26) nach unten ragend abgestützt ist, welcher Filter

(1) einen Fluidsammelhohlraum in direkter Verbindung mit dem Inneren der Welleneinrichtung (26) und der Oberseite des Gefäßes, und

(2) eine poröse äußere Oberfläche mit einer Porengröße, die kleiner als die zu züchtenden Zellen oder die Trägerteilchen, an welchen diese Zellen haften, ist, doch groß genug ist, um ein Permeieren von Fluid in den Fluidsammelhohlraum zu ermöglichen, aufweist,

(D) einer drehbaren Rühreinrichtung (25), die von der Welleneinrichtung (26) nach unten ragend abgestützt und zwecks Drehung konzentrisch um die Filtereinheit (35) herum so angeordnet ist, daß sie von Lagerungen (39), (40), die mit geringer Reibung an der Hohlwelleneinrichtung (26) angreifen, herunterhängt, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Vorrichtung, die für ein leichtes händisches Zusammenbauen und Auseinandernehmen ausgelegt ist, weiters:

(E) die Welleneinrichtung (26) einen zwischen der Filtereinheit (35) und den Lagerungen (39), (40) positionierten vorspringenden Bund (77) und einen Federsitz (76) hat, die zur Halterung von zwischen dem vorspringenden Bund (77) und der Filtereinheit (35) positionierten Federmitteln (75) verwendbar sind,

(F) die Rühreinrichtung (25) eine Mehrzahl an ihr aufgehängter biegsamer Flügel (30) aufweist, die in Umfangsrichtung im wesentlichen im gleichen Abstand voneinander angeordnet sind und sich im wesentlichen durch die gesamte Länge der Filtereinheit (35) erstrecken, wobei diese Flügel (30) zwischen einem Paar scheibenförmiger Haltemittel (51, 61) am oberen Ende und einem Paar scheibenförmiger Haltemittel (52), (62) am unteren Ende der Flügel quer zur Achse der Rühreinrichtung (25) gehaltert sind, wobei das untere Element (51) des oberen Paares und das obere Element (52) des unteren Paares der Haltemittel in Umfangsrichtung im Abstand voneinander befindliche Seitenschlitze zur Aufnahme der Breite der Flügel (30) aufweisen und wobei diese Flügel (30) an jedem Ende elastomere Elemente aufweisen, die zwischen dem entsprechenden Paar Haltemittel zusammengedrückt sind.

2. Zellkulturfiltervorrichtung nach Anspruch 1 mit unterhalb der oberen scheibenförmigen Haltemitteln (51) positionierten federbeaufschlagten Mitteln (71) zur Aufrechterhaltung einer aufwärts gerichteten Spannung auf den Flügeln (30).

3. Zellkulturfiltervorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Lagerung (27) der Rühreinrichtung eine Innenhülse (38) in Reibungsschluß mit der Hohlwelleneinrichtung (26) aufweist, sowie ein Außenrohr (36), das zur Innenhülse (38) konzentrisch ist und mit dieser unter geringer Reibung in Eingriff steht, und hiezu der Einsatz eines Paares von Kugellageranordnungen (39), (40) zwischen der Innenhülse (38) und dem Außenrohr (36) an gegenüberliegenden Enden derselben vorgesehen ist.

4. Zellkulturfiltervorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Rührflügel (30) durch die Haltemittel (52) am unteren Ende der Flügel, in bezug auf die Rotationsrichtung der Rühreinheit (25) vor dem oberen Ende der Flügel, abgestützt sind, um eine Kulturfluidbewegung nach oben und radial in die Filtereinheit (35) zu schaffen.

5. Zellkulturfiltervorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Lagerung (27) eine Innenhülse (38) in Reibungsschluß mit der Hohlwelleneinrichtung (26) aufweist, sowie ein Außenrohr (36), das zur Innenhülse (38) konzentrisch ist und mit dieser unter geringer Reibung in Eingriff steht, und hiezu der Einsatz eines Paares von Kugellageranordnungen (39), (40) zwischen der Innenhülse (38) und dem Außenrohr (36) an gegenüberliegenden Enden derselben vorgesehen ist, und die Flügel (30) der Rühreinrichtung durch die Haltemittel (52) am unteren Ende der Flügel, in bezug auf die Rotationsrichtung der Rühreinheit (25) vor dem oberen Ende der Flügel, abgestützt sind, um eine Kulturfluidbewegung nach oben und radial in die Filtereinheit (35) zu schaffen.

6. Zellkulturfiltervorrichtung nach Anspruch 5 mit federbeaufschlagten Elementen (71) unterhalb der oberen scheibenförmigen Haltemittel (51) zur Aufrechterhaltung einer aufwärts gerichteten Spannung auf den Flügeln (30).

7. Verfahren zur Züchtung von Tierzellen in einer gerührten flüssigen Suspension eines nährenden Kulturmediums, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtrierschritt in der Vorrichtung nach Anspruch 1 durchgeführt wird.

8. Verfahren zur Züchtung von Tierzellen in einer gerührten flüssigen Suspension eines nährenden Kulturmediums, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtrierschritt in der Vorrichtung nach Anspruch 2 durchgeführt wird.

9. Verfahren zur Züchtung von Tierzellen in einer gerührten flüssigen Suspension eines nährenden Kulturmediums, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtrierschritt in der Vorrichtung nach Anspruch 5 durchgeführt wird.

10. Verfahren zur Züchtung von Tierzellen in einer gerührten flüssigen Suspension eines nährenden Kulturmediums, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtrierschritt in der Vorrichtung nach Anspruch 6 durchgeführt wird.