DE3629924A1

DE3629924A1 - Immunologische messung von erythropoietin

Info

Publication number: DE3629924A1
Application number: DE19863629924
Authority: DE
Inventors: Hakuji Matsumoto; Keiko Tamabuchi; Masatsugu Ueda; Akihiko Murakami
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; Toyobo Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; Toyobo Co Ltd
Priority date: 1986-04-07
Filing date: 1986-09-03
Publication date: 1987-10-08
Also published as: FR2596867A1; JPS62235564A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine immunologische Messung von Erythropoietin und insbesondere ein verbes sertes Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Erythropoietin (im folgenden gelegentlich als "EPO" bezeichnet) mittels einer sogenannten Sandwich-Methode unter Verwendung eines ersten, eines zweiten und eines dritten Antikörpers.

EPO wird hauptsächlich in den Nieren produziert und ist ein Hormon, das ein Molekulargewicht von etwa 40 000 besitzt und die Bildung roter Blutkörperchen in Organis men stimuliert. Es ist bekannt, daß die Menge EPO in den Körperflüssigkeiten bei verschiedenen Fällen von Anämie und von Erythrocytosen erhöht oder vermindert wird, und aus diesem Grunde ist es sehr wichtig, für die Diagnose dieser Blut-Krankheiten die Menge des EPO in Körperflüs sigkeiten präzise zu messen.

Bekannt sind verschiedene Methoden zur Messung des EPO, nämlich eine Bioassay-Methode mit Hilfe von Kleintieren (z. B. Mäusen oder Ratten) [vgl. "Rinsho Kensa" (Clinical Test) Vol. 22, Nr. 2, 1978], eine Methode der Messung der ⁵⁹Fe-Aufnahme durch die Knochenmark-Zellen von Mäusen (vgl. J. Lab. Clin. Med., Vol. 97, Nr. 2, 158-169, 1981) und eine Methode unter Verwendung fötaler Mäuse- Zellen (vgl. Acta Haematal JAPAN, Vol. 44, Nr. 6, 1981). Von diesen ist die Bioassay-Methode die zuverlässigste, aber sie hat ungünstigerweise eine geringere Nachweis empfindlichkeit, benötigt eine lange Zeitdauer für die Messung und ist außerdem kostspielig, da sie eine große Zahl Versuchstiere braucht.

In neuerer Zeit wurde eine immunologische Methode, ins besondere ein Enzymimmunoassay, für die Bestimmung von Stoffen entwickelt, die in sehr kleinen Mengen in den Körperflüssigkeiten anwesend sind. Jedoch ist der Enzym immunoassay für den Nachweis von Stoffen im Vergleich zum Radioimmunoassay weniger empfindlich, und infolge dessen sind seine Anwendungsmöglichkeiten begrenzt. Insbesondere ist EPO in einer sehr geringen Menge wie 10 bis 20 mU/ml (0,1 bis 0,3 ng/ml) in normalem Blut ent halten, und deshalb wurde bisher angenommen, daß es durch bekannte Enzymimmunoassays kaum zu bestimmen ist.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung stellten Unter suchungen mit dem Ziel der Verbesserung des Immunoassays zur EPO-Messung an und haben dabei eine verbesserte Immunoassay-Methode für die Bestimmung von EPO gefunden, die die Umsetzung eines antikörpergebundenen unlöslichen Trägers, worin ein gegenüber EPO spezifisch reaktions fähiger Antikörper an einen unlöslichen Träger gebunden ist, einer EPO enthaltenden Test-Probe und eines enzym markierten Antikörpers, worin der gegenüber EPO spezi fisch reaktionsfähige Antikörper mittels eines Enzyms markiert ist, wodurch ein antikörper-EPO-markierter Antikörper-Komplex auf dem antikörpergebundenen unlösli chen Träger gebildet wird, und anschließend die Messung der Menge des markierten Produkts auf dem antikörper gebundenen unlöslichen Träger umfaßt (vgl. die JP- Patentanmeldung 39 687/1980). In diesem Verfahren hat jedoch der gegenüber EPO spezifisch reaktionsfähige Antikörper einen kleineren Titer, und infolgedessen kann es nicht notwendigerweise auch für eine präzise Messung der sehr kleinen Menge EPO in der normalen Blutprobe geeignet sein. Es wird angenommen, daß der kleine Titer des gegenüber EPO spezifisch reaktionsfähigen Anti körpers auf den raschen Stoffwechsel von EPO in dem Fall zurückzuführen ist, in dem Tiere statt des Menschen mit EPO immunisiert werden, und weiterhin durch die Tatsache bedingt wird, daß die Tiere, denen EPO verabreicht wurde, physiologisch mit dem EPO reagieren und aufgrund dessen bei ihnen eine schwere Anämie ausgelöst wird.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben weitere Untersuchungen angestellt, die auf eine weiter verbes serte Methode der immunologischen Bestimmung von EPO mit hoher Empfindlichkeit zielen, die in einem gewöhnlichen Testraum innerhalb eines sehr kurzen Zeitraums mit ge ringen Kosten durchgeführt werden kann; dabei haben sie gefunden, daß die gewünschte Bestimmung mittels der so genannten Sandwich-Methode durchgeführt werden kann, bei der ein enzymmarkierter dritter Antikörper eingesetzt wird, der gegenüber dem Immunoglobulin desjenigen Tieres spezifisch reaktionsfähig ist, das zur Herstellung des zweiten Antikörpers dient.

Ein Ziel der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfah ren zur immunologischen Messung von Erythropoietin ver fügbar zu machen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, einen verbesserten Enzymimmunoassay mittels einer Sandwich-Methode zur Messung von Erythropoietin in den Körperflüssigkeiten verfügbar zu machen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine immuno logische Erythropoietin-Bestimmung verfügbar zu machen, die für die Diagnose verschiedener Blutkrankheiten wie Anämie und Erythrocytose geeignet sind. Diese und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für Fachleute aus der folgenden Beschreibung deutlich.

Fig. 1 zeigt eine in der vorliegenden Erfindung benutzte Standard-Eichkurve für EPO.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur immunologi schen Bestimmung von Erythropoietin umfaßt die Reaktion eines antikörpergebundenen unlöslichen Trägers, worin ein gegenüber Erythropoietin spezifisch reaktionsfähiger erster Antikörper an einen unlöslichen Träger gebunden ist, mit einer Erythropoietin enthaltenden Test-Probe und einem zweiten Antikörper, der gegenüber Erythropoie tin spezifisch reaktionsfähig ist und dadurch herge stellt worden ist, daß eine Tier-Species, die von dem für die Herstellung des ersten Antikörpers eingesetzten Tier verschieden ist, immunisiert wird, anschließend die Reaktion einer festgelegten Menge eines markierten drit ten Antikörpers, der spezifisch gegenüber dem Immunglo bulin der Tier-Species, die für die Herstellung des zweiten Antikörpers eingesetzt wurde, reaktionsfähig ist, mit dem vorhergehenden Reaktionssystem und danach die Messung der Menge des markierten Antikörpers, der an den antikörpergebundenen unlöslichen Träger gebunden ist, oder der Menge des ungebundenen markierten Antikör pers.

Selbst dann, wenn der spezifisch gegenüber EPO reak tionsfähige zweite Antikörper einen kleineren Titer hat, kann gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung der Titer dadurch verstärkt werden, daß der markierte dritte Antikörper eingesetzt wird, der speziell gegenüber dem Immunoglobulin derjenigen Tier-Species reaktionsfähig ist, die zur Herstellung des zweiten Antikörpers heran gezogen wurde, und dadurch kann EPO in wirksamer Weise immunologisch gemessen werden. Der dritte Antikörper läßt sich in einfacher Weise dadurch herstellen, daß eine Tier-Species, die von der für die Herstellung des zweiten Antikörpers eingesetzten Tier-Species verschie den ist, mit dem Immunoglobulin der letzteren Tier- Species immunisiert wird, und der auf diese Weise ge wonnene Antikörper hat einen weitaus höheren Titer als der zweite Antikörper.

Der erste und der zweite Antikörper, die in der vorlie genden Erfindung verwendet werden, werden dadurch herge stellt, daß statt des Menschen verschiedene Tier-Species wie Kaninchen, Rind, Ziege, Schaf, Meerschweinchen etc. mit gereinigtem EPO immunisiert werden, das aus dem Harn von Patienten gewonnen wird, die an Panmyelophthisis (aplastischer Anämie) leiden und die eine vergleichswei se große Menge EPO produzieren. Beide Antikörper, sowohl der erste als auch der zweite, können monoklonale Anti körper sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der erste Antikörper ein Antikörper, der durch Immunisieren einer Tier-Species wie Kaninchen, Ziege oder Rind mit gereinigtem EPO her gestellt wird, der zweite Antikörper ist ein von der Maus stammender monoklonaler Antikörper, und der dritte Antikörper ist ein Antikörper, der durch Immunisieren eines anderen Tieres als der Maus mit einem Immunoglobu lin der Maus hergestellt wurde.

Die Reinigung von EPO kann mittels einer Kombination bekannter Reinigungsverfahren wie Affinitätschromatogra phie, Gelfiltration und dergleichen durchgeführt werden. Um einen Antikörper mit hoher Spezifität zu erhalten, wird das EPO so hoch wie möglich gereinigt. Das gerei nigte EPO wird subkutan Tieren wie Kaninchen oder Rin dern, die dadurch immunisiert werden, verabreicht, um den ersten und den zweiten Antikörper zu verabreichen. Der dritte Antikörper, der spezifisch reaktionsfähig gegenüber dem Immunoglobulin der für die Herstellung des zweiten Antikörpers benutzten Tier-Species ist, wird dadurch hergestellt, daß ein von dem für die Herstellung des zweiten Antikörpers eingesetzten Tier verschiedenes Tier mit einem gereinigten Immunoglobulin des letzteren Tieres immunisiert wird. Der spezifisch gegenüber EPO reaktionsfähige monoklonale Antikörper wird mittels eines bekannten Verfahrens hergestellt, beispielsweise durch Immunisieren von BALB/C-Mäusen mit gereinigtem EPO, Isolieren der Milz-Zellen aus dem immunisierten Mäusen, Fusionieren der Zellen mit Myelom-Zellen mit Hilfe von Polyethylenglycol und Widerholen der Klonie rung der fusionierten Zellen in HAT-Medium.

Der wie oben hergestellte erste Antikörper wird an einen unlöslichen Träger gebunden. Zu den unlöslichen Trägern gehören Polystyrol-Schlauch, Polystyrol-Perlen, Silicon- Fragmente, Mikroplatten und dergleichen, vorzugsweise Polystyrol-Schlauch und Polystyrol-Perlen. Das Binden des ersten Antikörpers an den unlöslichen Träger erfolgt durch Kombination bekannter chemischer oder physikali scher Methoden. Beispielsweise umfaßt die physikalische Methode das Auflösen des ersten Antikörpers in einer geeigneten Puffer-Lösung, das Zusetzen des unlöslichen Trägers zu derselben, das Stehenlassen der Mischung bei 0°C bis Raumtemperatur während mehrerer Stunden bis zu einer Nacht, vorzugsweise 4 bis 16 h bei 4°C bis 20°C, das Waschen des erhaltenen antikörpergebundenen unlösli chen Trägers mit physikalischer Kochsalz-Lösung etc., wonach der gewünschte antikörpergebundene unlösliche Träger (im folgenden einfach als "antikörpergebundener Träger" bezeichnet) erhalten wird. Der antikörpergebun dene Träger kann wenigstens für die Dauer eines Jahres dadurch stabil aufbewahrt werden, daß man ihm einen Sta bilisator wie Rinderserumalbumin zusetzt.

Der mit einem Markierungsmittel markierte dritte Anti körper (im folgenden einfach als "markierter Antikörper" bezeichnet) wird wie folgt hergestellt.

Der dritte Antikörper ist ein Antikörper gegen ein Immu noglobulin einer Tier-Species, die für die Herstellung des zweiten, spezifisch gegenüber EPO reaktionsfähigen Antikörpers herangezogen wird. Wenn beispielsweise der zweite Antikörper ein Mäusen entstammender monoklonaler Antikörper ist, ist der dritte Antikörper ein Antikörper gegen Mäuse-Immunoglobulin, und wenn der zweite Anti körper ein unter Einsatz von Kaninchen hergestellter Antikörper ist, ist der dritte Antikörper ein Antikörper gegen das Kaninchen-Immunoglobulin. Zu den in der vor liegenden Erfindung verwendeten Markierungsmitteln zählen Enzyme, Isotope, Fluoreszenzmittel, metallische Stoffe und dergleichen. Bevorzugte Markierungsmittel sind Enzyme wie Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucose-Oxidase, Glucose-6-phosphor säure-Dehydrogenase, Glucose-Dehydrogenase und derglei chen, wovon Peroxidase, Glucose-Oxidase und Glucose-6- phosphorsäure-Dehydrogenase die besonders bevorzugten Markierungsmittel sind. Das Markieren des dritten Anti körpers durch die Enzyme kann mittels bekannter Verfah ren durchgeführt werden, beispielsweise durch Oxidieren der Zucker-Kette des Enzyms mit Periodsäure und Binden der erzeugten Aldehyd-Gruppe an die Amino-Gruppe des dritten Antikörpers oder durch Einführen der Malein imido-Gruppe in das Enzym und anschließendes Binden dieser Gruppe an die Thiol-Gruppe des dritten Anti körpers.

Unter Verwendung des wie vorstehend hergestellten anti körpergebundenen Trägers und des markierten Antikörpers kann die Messung des EPO in der folgenden Weise durchge führt werden.

Zunächst wird der antikörpergebundene Träger mit einer EPO enthaltenden Test-Probe und dem spezifisch gegenüber EPO reaktionsfähigen zweiten Antikörper eine Stunde bis eine Nacht bei 0°C bis 50°C, vorzugsweise 2 bis 4 h bei 15°C bis 37°C umgesetzt. Die EPO enthaltende Testprobe umfaßt Serum, Blut-Plasma, Urin etc. Der an einen unlöslichen Träger zu bindende erste Antikörper und der zweite Antikörper sollten unter Einsatz von einander verschiedener Tier-Species hergestellt sein. Wenn der erste Antikörper und der zweite Antikörper unter Einsatz der gleichen Tier-Species hergestellt werden, wird der markierte dritte Antikörper gegen ein Immuno globulin des vorgenannten Tieres unspezifisch und ohne Bezug zu dem in der Testprobe vorhandenen EPO gebunden, und aufgrunddessen ist es möglich, die Menge des EPO zu messen.

Durch die obige Reaktion wird der antikörpergebundene Träger mit dem zweiten Körper proportional zu der EPO- Menge gebunden. Mit dem erhaltenen Reaktionsprodukt wird der markierte Antikörper eine Stunde bis eine Nacht bei 0°C bis 50°C, vorzugsweise 2 bis 4 h bei 15°C bis 37°C umgesetzt, wodurch der markierte dritte Antikörper an den antikörpergebundenen Träger proportional zu der Menge des EPO gebunden wird.

Schließlich wird die Menge des an den antikörpergebunde nen Träger gebundenen Antikörpers gemessen, und die in der Test-Probe enthaltene Menge EPO wird auf der Grund lage der Eichkurve errechnet, die vorher mit Hilfe von Standard-EPO-Proben aufgestellt wurde. Wenn das Markie rungsmittel ein Enzym ist, wird die Enzym-Aktivität gemessen, und wenn das Markierungsmittel ein Isotop ist, wird die Radioaktivität gezählt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Titer des Antikörpers durch den dritten Antikörper vervielfacht, und aus diesem Grunde kann das Verfahren zur EPO-Messung mit hoher Empfindlichkeit selbst bei so kleinen Mengen wie 10 bis 20 mU/ml (0,1 bis 0,3 ng/ml) in normalem Blut herangezogen werden, auf die sich die bekannten Methoden nicht anwenden ließen. Somit ist das Verfahren der vor liegenden Erfindung zur quantitativen Bestimmung von Erythropoietin in Körperflüssigkeiten brauchbar und eignet sich folglich für die Diagnose verschiedener Blutkrankheiten wie Anämie und Erythrocytose, wobei Erythropoietin in ungewöhnlicher Weise erhöht oder er niedrigt ist.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Bei spiele näher erläutert, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.

Beispiel 1 (a) Herstellung des antikörpergebundenen Trägers:

Herstellung des polyklonalen Antikörpers: Ein polyklona ler Antikörper gegen Erythropoietin wird hergestellt durch dreimaliges Immunisieren von Kaninchen mit einem gereinigten EPO (das von einem an Anämie leidenden Patienten stammte), und das resultierende Antiserum wird in üblicher Weise behandelt, um gereinigtes IgG herzu stellen.

Erste Immunisierung: Gereinigtes EPO (400 µg/ml) wird in PBS (phosphat-gepufferter Kochsalz-Lösung) gelöst, und die Lösung wird mit einer gleichen Menge des Freund′schen Adjuvans vermischt, wodurch eine Emulsion entsteht. Die Emulsion (1,5 ml) wird subkutan einem Kaninchen (das etwa 2 kg wiegt) an 10 bis 15 Punkten entlang der Wirbelsäule injiziert.

Zweite Immunisierung: Zwei Wochen nach der ersten Immu nisierung wird die gleiche Emulsion wie oben (1 ml) an 10 bis 15 Punkten in der gleichen Weise wie bei der ersten Immunisierung injiziert.

Dritte Immunisierung: Weitere zwei Wochen danach wird eine Emulsion durch Einsetzen einer Lösung eines Anti körpers (200 µg/ml) in PBS in der gleichen Weise, wie sie bei der ersten Immunisierung beschrieben wurde, hergestellt, und die Emulsion (1 ml) wird in gleicher Weise an 10 Punkten injiziert.

Am Tag vor der dritten Immunisierung wird dem Tier eine kleine Menge Blut abgenommen, und die Anti-EPO-Aktivität des Blut-Serums wird getestet. Eine Woche nach der dritten Immunisierung (der abschließenden Immunisierung) wird die Blutentnahme vervollständigt, und das gesammel te Blut wird der Serum-Abtrennung unterzogen, wodurch ein Anti-EPO-Serum erhalten wird. Ein Anti-EPO-IgG wird aus dem Anti-EPO-Serum mittels einer bekannten Methode präpariert, d. h. durch Fällung mit 50-proz. Ammonium sulfat und Fraktionierung mittels DEAE-Cellulose-Chroma tographie, wobei nicht auf der DEAE-Cellulose absorbier te Stoffe herausgenommen werden.

Dann wird zu Polystyrol-Perlen (Durchmesser: 6,4 mm; 100 Perlen) eine Lösung des ersten Antikörpers (20 ml) in 0,1 M NaHCO₃ hinzugefügt, und die Mischung wird bei 4°C 16 h stehengelassen und mit physiologischer Kochsalz- Lösung gewaschen, wodurch antikörpergebundene Poly styrol-Perlen erhalten werden.

(b) Herstellung von peroxidase-markiertem Anti-Mäuse- IgG:

Zu Peroxidase (hergestellt von Toyo Boseki K.K.; 5 mg) wird 0,06 M NaIO₄ (0,2 ml) hinzugegeben, und die Mischung wird 20 min bei Raumtemperatur umgesetzt und dann über Nacht gegen Natriumacetat-Puffer (pH 4) dialy siert. Nach der Dialyse wird die Mischung auf pH 9,5 einreguliert, und dazu wird Anti-Mäuse-IgG (gegen Kanin chen immunisiert; hergestellt von DAKO Co., 5 mg) ge geben, und die Mischung wird 2 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird mit Natriumbor hydrid reduziert. Die gesamte Reaktionsmischung wird der Gelfiltration mit Sephadex G-200 unterworfen, und die aktiven Fraktionen werden gesammelt, wodurch das ge wünschte peroxidase-markierte Anti-Mäuse-IgG erhalten wird.

(c) Quantitative EPO-Bestimmung:

Der verwendete zweite Antikörper ist ein monoklonaler Anti-EPO-Antikörper (immunisiert gegen Mäuse, wie in der JP-Patentveröffentlichung 1 55 395/1984 offenbart ist).

Die wie im vorstehenden unter (a) hergestellten anti körpergebundenen Polystyrol-Perlen (eine Perle), eine EPO enthaltende Testprobe (50 µl) und 0,01 M Phosphat- Puffer (200 µl) werden in ein Polystyrol-Röhrchen (12 mm × 75 mm) gegeben, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Dazu wird der monoklonale Anti-EPO-Antikörper (1000fache Verdünnung, 250 µl) hinzugefügt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen.

Getrennt davon wird das wie im vorstehenden unter (b) hergestellte Anti-Mäuse-IgG 700fach mit einen 0,5-proz. Rinderserumalbumin-Perphosphat-Puffer verdünnt. Der auf diese Weise erhaltene verdünnte markierte Antikörper (250 µl) wird dem oben erwähnten Polystyrol-Röhrchen zugesetzt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Danach wird Citrat-Puffer (500 µl), der o-Phenylendiamin (3 mg/ml) und H₂O₂ (0,02%) enthält, hinzugefügt, und die Mischung wird 1 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktion wird durch Zusatz von 1 N H₂SO₄ (2 ml) abge brochen. Die Extinktion der Reaktionsmischung wird bei 492 nm gemessen.

Die erhaltene Standard-Eichkurve für EPO ist in der Fig. 1 dargestellt. Aus Fig. 1 berechnet sich die Nachweisempfindlichkeit für EPO zu 10 mU/ml.

Beispiel 2 (a) Herstellung des antikörpergebundenen Trägers:

Zu Polystyrol-Perlen (Durchmesser: 6,4 mm; 100 Perlen) wird eine Lösung (20 ml) eines monoklonalen Anti-EPO- Antikörpers (immunisiert gegen Mäuse, wie in der JP- Patentveröffentlichung 1 55 395/1984 offenbart ist) in 0,1 M NaHCO₃ hinzugefügt, und die Mischung wird bei 4°C 16 h stehengelassen und dann mit physiologischer Koch salz-Lösung gewaschen, wodurch die gewünschten antikör pergebundene Polystyrol-Perlen erhalten werden.

(b) Herstellung von peroxidase-markiertem Anti-Kanin chen-IgG:

Beispiel 1-(B) wird wiederholt mit der Abweichung, daß Anti-Kaninchen-IgG (gegen Schafe immunisiert, herge stellt von Cappel Co.) an Stelle des Anti-Mäuse-IgG (hergestellt von DAKO Co.) zur Herstellung des gewünsch ten peroxidase-markierten Anti-Kaninchen-IgG verwendet wird.

(c) Quantitative EPO-Bestimmung:

Der verwendete zweite Antikörper ist ein wie in Beispiel 1-(a) hergestellter von Kaninchen stammender Antikörper.

Die wie im vorstehenden unter (a) hergestellten anti körpergebundenen Polystyrol-Perlen (eine Perle), eine EPO enthaltende Testprobe (50 µl) und 0,01 M Phosphat- Puffer (200 µl) werden in ein Polystyrol-Röhrchen (12 mm × 75 mm) gegeben, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Dazu wird der zweite Antikörper (500fach verdünnt mit einem 0,01 M Phosphat-Puffer, 250 µl) hin zugefügt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Das wie im vorstehenden unter (b) hergestellte peroxida se-markierte Anti-Kaninchen-IgG wird 500fach mit einem 0,5-proz. Rinderserumalbumin-Perphosphat-Puffer ver dünnt. Der auf diese Weise erhaltene verdünnte markierte Antikörper (250 µl) wird dem oben erwähnten Polystyrol- Röhrchen zugesetzt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Danach wird Citrat-Puffer (500 µl), der o-Phenylendiamin (3 mg/ml) und H₂O₂ (0,02%) enthält, hinzugefügt, und die Mischung wird 1 h bei Raumtempera tur umgesetzt. Die Reaktion wird durch Zusatz von 1 N H₂SO₄ (2 ml) abgebrochen. Die Extinktion der Reaktions mischung wird bei 492 nm gemessen. Mittels dieses Ver fahrens kann EPO auf einem Niveau von 25 mU/ml nachge wiesen werden.

Beispiel 3 (a) Herstellung von glucoseoxidase-markiertem Anti- Mäuse-IgG:

Zu Glucoseoxidase (hergestellt von Toyo Boseki K.K.; 10 mg) wird in Portionen N-(4-Carboxycyclohexylmethyl)- maleinimid-N-hydroxysuccinimidylester (2 mg) in einem Intervall von 5 min hinzugefügt, und die Reaktions mischung wird der Gel-Filtration unter Verwendung von Sephadex G-25 unterworfen, und die Enzym-Fraktionen werden gesammelt und dann konzentriert. Dazu wird eine IgG-Fraktion (10 mg) hinzugefügt, die durch Reduzieren von Anti-Mäuse-IgG (gegen Kaninchen immunisiert; herge stellt von DAKO Co.) erhalten wurde, und die Mischung wird über Nacht bei 4°C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird der Gelfiltration mit Sephadex G-200 unterworfen, und die aktiven Fraktionen werden gesammelt, wodurch das gewünschte glucoseoxidase-markierte Anti-Mäuse-IgG er halten wird.

(b) Quantitative EPO-Bestimmung:

Die wie in Beispiel 1-(a) hergestellten antikörper gebundenen Polystyrol-Perlen (eine Perle), eine EPO enthaltende Testprobe (50 µl) und 0,01 M Phosphat-Puffer (200 µl) werden in ein Polystyrol-Röhrchen (12 mm × 75 mm) gegeben, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umge setzt und mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Dazu wird als zweiter Antikörper ein monoklonaler Anti- EPO-Antikörper (wie er in der JP-Patentveröffentlichung 1 55 395/1984 offenbart ist) (1000fach verdünnt mit 0,01 M Phosphat-Puffer, 250 µl) hinzugefügt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Getrennt wird das wie im vorstehenden unter (a) hergestellte glucose oxidase-markierte Anti-Mäuse-IgG 400fach mit einem 0,5-proz. Rinderserumalbumin-Perphosphat-Puffer ver dünnt. Der auf diese Weise erhaltene verdünnte markierte Antikörper (250 µl) wird dem oben erwähnten Polystyrol- Röhrchen zugesetzt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Getrennt wird ein Substrat (250 µl), das 0,1% p-Hydroxyphenylessigsäure, 0,002% Peroxidase und 2% Glucose enthält, dazugegeben, und die Mischung wird 1 h bei 30°C umgesetzt. Die Reaktion wird durch Zusatz von Glycin-NaOH-Puffer abgebrochen. Die Fluoreszenz der Reaktionsmischung wird bei einer Erreger-Wellenlänge von 320 nm und einer Fluoreszenz-Wellenlänge von 450 nm gemessen. Mittels dieses Verfahrens kann EPO bei 120 mU/ml nachgewiesen werden.

Beispiel 4 (a) Herstellung von mit Glucose-6-phosphorsäure- Dehydrogenase (G6PDH) markiertem Anti-Mäuse-IgG:

Zu G6PDH (hergestellt von Toyo Boseki K.K.; 5 mg) wird N-(4-Carboxycyclohexylmethyl)-maleinimid-N-hydroxy succinimidylester (2 mg) hinzugefügt, und die Reaktions mischung wird 1 h bei 30°C umgesetzt. Die Reaktions mischung wird der Gel-Filtration unter Verwendung von Sephadex G-25 unterworfen, und die Enzym-Fraktionen werden gesammelt und dann konzentriert. Dazu wird ein IgG hinzugefügt, das durch Reduzieren von Anti-Mäuse-IgG (gegen Kaninchen immunisiert; hergestellt von DAKO Co., 5 mg) erhalten wurde, und die Mischung wird über Nacht bei 4°C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird der Gel filtration mit Ultrogel AcA44 (hergestellt von LKB, Stockholm, Schweden) unterworfen, und die aktiven Frak tionen werden gesammelt, wodurch das gewünschte G6PDH- markierte Anti-Mäuse-IgG erhalten wird.

(b) Quantitative EPO-Bestimmung:

Der in Beispiel 1-(a) hergestellte erste Antikörper (50 µl) wird in die Vertiefungen einer Polystyrol-Mikro platte (hergestellt von Coaster Corp.) gegeben, und die Mischung wird über Nacht bei 4°C umgesetzt und mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. In jede Vertiefung wird eine EPO enthaltende Testprobe (50 µl) hinzugefügt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umge setzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung ge waschen. Als zweiter Antikörper wird ein monoklonaler Anti- EPO-Antikörper (immunisiert gegen Mäuse, wie er in der JP-Patentveröffentlichung 1 55 395/1984 offenbart ist) verwendet und 1000fach verdünnt mit 0,01 M Phosphat- Puffer. Der verdünnte Antikörper (50 µl) wird dem Inhalt der obigen Vertiefungen hinzugefügt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Getrennt wird das wie im vorstehenden unter (a) hergestellte G6PDH-markierte Anti-Mäuse-IgG 750fach mit einem 0,5-proz. Rinderserum albumin-Phosphat-Puffer verdünnt. Der auf diese Weise erhaltene verdünnte markierte Antikörper (50 µl) wird den Vertiefungen zugesetzt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer Koch salz-Lösung gewaschen.

Anschließend wird ein Substrat (200 µl), das 30 mM Glucose-6-phosphorsäure und 2 mM Nicotinamid-adenin dinucleotid (NAD) enthält, jeder Vertiefung zugesetzt, und die Mischung wird 30 min bei 37°C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird zu einem Substrat für die Spek tralanalyse hinzugefügt, das Luciferase (hergestellt von Toyo Boseki K.K.), Reduktions-Typ-NAD-Flavinmononucleo tid (NADH-FMN)oxid-Reduktase (hergestellt von Toyo Boseki K.K.), Flavinmononucleotid (FMN) und Decanal enthielt, und das Reduktions-Typ-NAD (NADH) wird auf der Grundlage der erzeugten Emission mittels eines Lumineszenz-Meters TD-4000 (hergestellt von Laboneience Co.) gemessen. Als Ergebnis können 5 mU/ml EPO gemessen werden.

Claims

1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Erythro poietin, umfassend die Reaktion eines antikörpergebunde nen unlöslichen Trägers, worin ein spezifisch zur Reak tion mit Erythropoietin befähigter erster Antikörper an einen unlöslichen Träger gebunden ist, mit einer Erythropoietin enthaltenden Test-Probe und einem zweiten Antikörper, der spezifisch zur Reaktion mit Erythropoie tin befähigt ist und dadurch hergestellt worden ist, daß eine Tier-Species, die von dem für die Herstellung des ersten Antikörpers eingesetzten Tier verschieden ist, immunisiert wird, anschließend die Reaktion eines markierten dritten Antikörpers, der spezifisch zur Reak tion mit dem Immunglobulin der Tier-Species, die für die Herstellung des zweiten Antikörpers eingesetzt wurde, befähigt ist, mit dem vorhergehenden Reaktionssystem und danach die Messung der Menge des markierten Antikörpers, der an den antikörpergebundenen unlöslichen Träger ge bunden ist, oder der Menge des ungebundenen markierten Antikörpers.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der unlösliche Träger ein aus der aus Polystyrol- Schlauch, Polystyrol-Perlen, Silicon-Fragmente und Mikroplatten bestehenden Gruppe ausgewähltes Element ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper ein dritter Antikörper ist, der mit einem Markierungsstoff ausgewählt aus der aus Enzy men, Isotopen, Fluoreszenzmitteln und metallischen Stoffe bestehenden Gruppe markiert ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Markierungsstoff ein aus der aus Peroxidase, alkali scher Phosphatase, β-Galactosidase, Glucose-Oxidase, Glucose-6-phosphorsäure-Dehydrogenase und Glucose- Dehydrogenase bestehenden Gruppe ausgewähltes Element ist.