DE3603085C1 - Immunological method for detecting antigen-specific antibodies and test kit for carrying out the method - Google Patents

Immunological method for detecting antigen-specific antibodies and test kit for carrying out the method

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Description

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Verfahren zum Nachweis antigenspezifischer Antikörper in Humanserum unter Verwendung markierter Antigene und einer mit Rheumafaktor beschichteten Trägerplatte.
Es sind zahlreiche immunologische Verfahren zum Nachweis von Antigen-spezifischen Antikörpern in Humanserum bekannt. Derartigen Nachweisverfahren liegt das gemeinsame Prinzip zugrunde, daß die Serumprobe mit dem jeweiligen Antigen in Kontakt gebracht und der gebildete Immunkomplex entweder anhand markierter Anti-Ig-Antikörper oder durch Markierung der Antigene nachgewiesen wird, wobei die Anti-Ig-Antikörper oder die Antigene auf Trägern fixiert sein können.
Die bekannten Verfahren sind jedoch mit einer Reihe von Nachteilen verbunden.
Diejenigen Verfahren, die, wie beispielsweise das Immunblotting- oder das indirekte Immunfluoreszenzverfahren, zu zuverlässigen Ergebnissen führen, sind verhältnismäßig kompliziert und demgemäß für Reihenuntersuchungen ungeeignet. Demgegenüber sind die bekannten Enzym-Immuntests wie der "Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay" (ELISA) einfacher und schneller durchzuführen, die erhaltenen Ergebnisse sind jedoch weniger zuverlässig. Insbesondere bei niedrigen Serumkonzentrationen führt eine unspezifische Bindung von Antikörpern an die immobilisierten Antigene oder die Bindung von Antikörpern an Verunreinigungen der Antigene zu falschen Positivwerten (vgl. Schmitz, H., Dörr, H. W., Kamper, D. und Voigt, A. J. Clin. Microbiol. 5, 629, (1977)). Ferner wirkt sich die Anwesenheit von Rheumafaktor im Serum vielfach störend aus (vgl. Fraser, K. B., Shirodaria, P. V. and Stanford, F. Br. Ned. J. 3, 707, (1971)).
In der EP-PS 00 23 989 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem zur Vermeidung der oben genannten Nachteile direkt mit Enzym markierte Antigene in Verbindung mit fixierten Antikörpern verwendet werden, die spezifisch gegen IgM-, IgA-, IgG- oder IgE- gerichtet sind. Dieses Verfahren hat sich zwar insbesondere zum Nachweis von Antikörpern der Gruppen IgM oder IgA bewährt; zum Nachweis von IgG-Antikörpern ist es jedoch weniger geeignet, da hier das Verhältnis von spezifischem zu Gesamt-IgG häufig sehr niedrig ist und daher nur wenige der spezifischen IgG-Antikörper an die fixierten Anti-IgG-Antikörper gebunden werden (vgl. Schmitz, H., von Deimling, U. und Flehmig, B., Gen. Virol. 50, 59 (1980)). Im übrigen ist auch dieses Verfahren für Reihenuntersuchungen ungeeignet, da es mehrere Inkubationsschritte erfordert.
Schließlich ist von M. Sacher, P. Emmerich, H. Mohr und H. Schmitz in Journal of Virological Methods 10, 99-110 (1985) ein Verfahren beschrieben worden, bei dem direkt mit Enzym markierte Antigene in Gegenwart von trägerfixiertem Rheumafaktor (RF) in einem Inkubationsschritt mit dem Testserum in Kontakt gebracht werden. Da Rheumafaktor bevorzugt Antigen-Antikörper-Komplexe durch spezifische Erkennung des geänderten Fc-Teils der Antikörper bindet (vgl. Normansell, D. E., Immunochemistry 8, 593 (1971)) werden im wesentlichen die markierten Immunkomplexe an den Träger gebunden. Auch dieses Verfahren setzt jedoch hochgereinigte Antigene voraus, wenn falsche positive Ergebnisse vermieden werden sollen.
Die Verwendung einer mit Rheumafaktor beschichteten Festphase zum Nachweis von Immunkomplexen ist ferner aus der DE-PS 25 22 086 bekannt. Nach der Lehre dieser Veröffentlichung kann die Festphase sowohl zum Nachweis zirkulierender Immunkomplexe als auch in Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern verwendet werden. Es wird jedoch keinerlei Hinweis darauf gegeben, wie unspezifische Bindungsreaktionen vermieden werden können.
Aufgabe der Erfindung ist es demgemäß, ein für Reihenuntersuchungen geeignetes immunologisches Nachweisverfahren zu schaffen, das auch bei Verwendung weitgehend ungereinigter Antigenaufarbeitungen zuverlässige Ergebnisse liefert.
Zur Lösung der Aufgabe wird das Verfahren gemäß Anspruch 1 vorgeschlagen, bei dem man
  • a) die Antigene an Tracer koppelt, die aus markierten F(ab)₂-Fragmenten oder markierten monoklonalen Antikörpern bestehen,
  • b) die Tracer-gekoppelten Antigene gleichzeitig mit einer Probe des zu untersuchenden Serums und einer mit Rheumafaktor beschichteten Trägerplatte in Kontakt bringt,
  • c) die nicht an die Trägerplatte gebundenen Bestandteile der Mischung entfernt und
  • d) die Markierung auf der Trägerplatte mit geeigneten Verfahren nachweist.
Die erfindungsgemäße Verwendung von Rheumafaktor in Kombination mit Tracer-gekoppelten Antigenen ermöglicht es, gleichzeitig die Bindung nicht-spezifischer Komponenten auszuschließen und die Bildung des spezifischen Immunkomplexes sowie dessen selektive Bindung an einen festen Träger in nur einem einzigen Inkubationsschritt herbeizuführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist demgemäß insbesondere zur Durchführung von Reihenuntersuchungen geeignet, und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist vergleichbar mit denjenigen des sehr viel komplizierteren indirekten Immunofluoreszenztests (vgl. Tabelle 2).
Die erfindungsgemäß verwendeten Tracer sind nach bekannten Verfahren durch Pepsinspaltung hergestellte F(ab)₂-Fragmente Antigen-spezifischer Antikörper oder monoklonale, gegen eine Determinante des verwendeten Antigens gerichtete Antikörper, die nach bekannten Verfahren mit Markern wie radioaktiven Isotopen, fluoreszierenden Substanzen oder Enzymen versehen sind, wobei Enzym-markierte Tracer für Reihenuntersuchungen besonders geeignet sind. Die Markierung mit Enzymen wird vorzugsweise nach Wilson und Nakane ("Immunofluorescence and related Techniques", Seiten 215-224, W. Knapp, Amsterdam, Elsevier) vorgenommen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere dann von Vorteil, wenn Antigene verwendet werden, die sich nur schwer oder gar nicht von Verunreinigungen wie Zellmaterial trennen lassen. So können beispielsweise ganze Viren oder unlösliche und lösliche Fragmente oder Mischungen derselben, beispielsweise als Rohextrakt verwendet und Antigenverluste durch besondere Reinigungsschritte demgemäß vermieden werden.
Es hat sich jedoch erfindungsgemäß gezeigt, daß die Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlich von dem Mengenverhältnis von Tracer zu Antigen während der Kopplung abhängt. Es variiert abhängig von der Art der gewählten Reaktionspartner. Das jeweils optimale Mengenverhältnis kann durch Schachbrett-Titration unter Verwendung eines positiven und eines negativen Kontrollserums ermittelt werden, indem man das Verhältnis von positiver zu negativer Reaktion beim Nachweis der Markierung auf der Trägerplatte bestimmt.
Der erfindungsgemäß zur Bindung der Immunkomplexe verwendete Rheumafaktor kann beispielsweise humaner Rheumafaktor sein, der nach bekannten Verfahren (vgl. M. Sacher, P. Emmerich, H. Mohr und H. Schmitz, J. Virol. Meth. 10, 99-110 (1985)) aus dem Serum von Patienten mit rheumatoider Arthritis gewonnen und auf Trägerplatten aufgebracht wird.
Für den erfindungsgemäßen Immuntest hat es sich als besonders geeignet erwiesen, den Rheumafaktor auf Mikrotiterplatten aufzubringen und die beschichteten Platten anschließend zu gefriertrocknen. Die gefriergetrockneten Platten können dann vakuumversiegelt in aluminiumbeschichteten Plastikbehältern bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
Zur Durchführung des Verfahrens werden die Platten entnommen und mit einer Pufferlösung gewaschen, deren pH-Wert etwa 7 bis 8 beträgt. Die Testseren werden in verschiedenen Verdünnungsstufen jeweils in die Löcher der Mikrotiterplatte eingebracht und nach Hinzufügen der Antigenkomponente inkubiert. Nach Anlauf der Inkubationszeit werden die Platten mehrmals gewaschen und die an den Rheumafaktor gebundene Markierung in den jeweiligen Löchern mit geeigneten Mitteln nachgewiesen. Wurde Enzym-markierter Tracer verwendet, so wird nach Abschluß der Inkubation und Waschen Substrat in die Löcher gegeben und die Enzymreaktion vorzugsweise spektrophotometrisch gemessen.
Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert demgemäß nur einen Inkubationsschritt und kann mit leicht zugänglichen Materialien schnell und sicher durchgeführt werden. Es ist besonders zur Durchführung von Reihenuntersuchungen beispielsweise zum Nachweis von AIDS geeignet. Demzufolge wird die Erfindung nachfolgend im einzelnen anhand einer Ausführungsform beschrieben, bei der Viren des Typs HTLV-III oder Fragmente derselben als Antigene verwendet und mit Enzym-markierten markierten F(ab)₂-Fragmenten gekoppelt werden, um HTLV-III- spezifische Antikörper in Humanserum nachzuweisen.
Die Virusextrakte können aus HTLV-III produzierenden Zellinien wie Molt 3- oder H9-Zellkulturen (vgl. Popovic, M., Sarngadharan, M. G., Read, E. and R. C. Gallo, Science 224, 497 (1984) und Popovic, M., Read-Connole, E. and R. C. Gallo, Lancet ii, 1472 (1984)) gewonnen werden.
Eine besondere Reinigung der Virusextrakte ist nicht erforderlich. Es zeigte sich vielmehr, daß der Überstand HTLV-III-infizierter Molt 3- oder H9-Zellen nach einer Kultivierungsdauer von 8 Tagen als Antigenquelle verwendet werden kann. Selbst das nach 3stündiger Zentrifugation bei 200 000 g im Überstand verbliebene lösliche Antigen ist erfindungsgemäß geeignet.
Für die Kopplung werden HTLV-III-Antigene und der Enzym-markierte F(ab)₂-Tracer vorzugsweise in Gegenwart eines Tensids inkubiert, wobei die Verwendung nichtionogener Tenside bevorzugt ist. Es zeigte sich ferner, daß eine Hitzeinaktivierung der Viren bei 56°C über einen Zeitraum von 2 Stunden ohne Beeinträchtigung des Verfahrens möglich ist.
Hinsichtlich der Zuverlässigkeit der Testergebnisse erwies sich das erfindungsgemäße einstufige immunologische Nachweisverfahren als gleichwertig mit dem Immunofluoreszenztest (siehe Vergleichsbeispiel und Tabelle 2) und einem handelsüblichen ELISA (Organon, Technika, Boxtel, Niederlande) überlegen (siehe Vergleichsbeispiel).
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.
Beispiel 1 Herstellung von Peroxydase-markierten F(ab)₂-Fragmenten
Die γ-Globulinfraktion menschlicher Seren wurde durch (NH₄)₂SO₄-Fällung (Sättigungsgrad 50% und 40%) gewonnen. Nach Dialyse gegen PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) wurde die Proteinkonzentration des γ-Globulins auf 8 mg/ml eingestellt. Zu 0,5 ml γ-Globulin wurden 5 µl Pepsin aus Schweinemagenmucosa (Sigma, USA), Konzentration 1 mg/ml in 1 M Acetatpuffer, pH 4 gegeben und die Mischung 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach Neutralisieren mit 2M Tris wurden die F(ab)₂-Antikörperfragmente mit (NH₄)₂SO₄ gefällt (Sättigungsgrad 50%). Das Sediment wurde in 0,5 ml PBS gelöst und 1 mg Protein A Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden), vorgequollen in PBS, hinzugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 40°C inkubiert, über Nacht gegen PBS dialysiert und die Protein-A-Sepharose anschließend abzentrifugiert. Der die F(ab)₂-Fragmente enthaltende Überstand wurde nach dem Verfahren von Wilson und Nakane (siehe oben) mit Peroxydase markiert. Das markierte Material wurde in PBS plus 1% BSA ("bovine serum albumin" = Rinderserumalbumin) bei -20°C tiefgefroren aufbewahrt.
Beispiel 2 Herstellung Tracer-markierter Antigene A) Gewinnung von HTLV-III-Antigenen
HTLV-III-infizierte Molt 3-Zellen (s. o.), die zu etwa 60% Antigensynthese zeigten (nachgewiesen mit dem indirekten Immunofluoreszenzverfahren), wurden in frischem RPMI 1640 Medium (Flow Laboratories, Meckenheim) unter Zusatz von 20% FCS (fötales Kälberserum) bei einer Ausgangskonzentration von 3 × 10⁵ Zellen/ml 8 Tage lang kultiviert. Die Hälfte des Mediums wurde am 3. Tag ersetzt. Der Überstand dieser Zellen wurde als Antigenquelle verwendet.
B) Ermittlung der optimalen Kopplungsbedingungen
Der Überstand gemäß A) wurde 10 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert und der Überstand als Antigenlösung verwendet.
Der Peroxydase-markierte F(ab)₂-Tracer gemäß Beispiel 1 wurde jeweils im Verhältnis 1 : 200, 1 : 400, 1 : 800 und 1 : 1600 verdünnt. Zu 1 ml Antigenlösung wurden 1 ml Tracer der jeweiligen Verdünnungsstufe und 0,05% NP40 (Tensid der Fa. Shell, Hamburg) gegeben. Die Mischungen wurden etwa 5 Tage lang bei 4°C inkubiert und anschließend erfindungsgemäß als Tracer-gekoppelte Antigene eingesetzt.
Es wurde ein positives Testserum (Verdünnung 1 : 1000) und ein negatives Kontrollserum (unverdünnt) verwendet und nach Ablauf der Enzymreaktion (vgl. Beispiel 4) jeweils die Absorption bei 495 nm bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Sie zeigen, daß die zuverlässigsten Ergebnisse mit einer Tracer-Verdünnung von 1 : 800 erhalten wurden.
Tabelle 1
Beispiel 3 Herstellung RF-beschichteter Trägerplatten A) Gewinnung von Rheumafaktor (RF)
Seren von Patienten mit rheumatoider Arthritis wurden unter Verwendung eines Latextests (Rapitex der Behringwerke, Marburg), auf Rheumafaktor untersucht. Es wurden nur Seren mit einem Titer höher als 512 verwendet. Die Abwesenheit spezifischer Antikörper gegen HTLV-III in den RF-Seren wurde mit dem Immunfluoreszenzverfahren bestätigt. Die IgM-Fraktion wurde gelchromatographisch mit Sephacryl 300 (Pharmacia Uppsala, Schweden) isoliert. Die Proteinkonzentration der isolierten IgM-Fraktionen wurde durch Messung der OD (optischen Dichte) bei 280 nm bestimmt.
B) Beschichtung von Trägerplatten
Als Träger dienten Polystyrol-Mikrotiterplatten mit Rundbodenlöchern. Diese wurden zuvor mit γ-Strahlung (2 mrad) behandelt, um die Proteinbindungs-Kapazität zu erhöhen. Die Platten wurden beschichtet, indem man jedes Loch mit 100 µl der RF-Fraktion gemäß A), mit PBS verdünnt auf eine Proteinkonzentration von 5 µg/ml, versetzte. Die Platten wurden bei 4°C in einer Feuchtkammer gelagert und waren nach einer Adsorptionszeit von 2 Tagen erfindungsgemäß verwendbar. Sie konnten nach Tiefgefrieren (-20°C) gefriergetrocknet und versiegelt in aluminiumbeschichteten Plastikbehältern bei Raumtemperatur gelagert werden.
Beispiel 4 Durchführung des erfindungsgemäßen immunologischen Nachweisverfahrens in der Ausführungsform RF-ELIC (RF-Enzyme-Labelled-Immuno-Complex = RF-Enzym-markierter-Immun-Komplex)
Die Mikrotiterplatten wurden nach Entnehmen aus der Umhüllung mit Waschpuffer (0,1 M Tris-HCL, 0,15 M NaCl, pH 7,6, 0,05% Tween 20 (Serva, Heidelberg), gewaschen. Die Serumproben wurden mit PBS in geometrischer Reihe von 1 : 2 bis 1 : 20 000 verdünnt; es wurden insgesamt 1000 Proben untersucht. Bei jeder Serumprobe ließ man zwei positive (Verdünnung 1 : 1000) und drei negative (Verdünnung 1 : 2) Serumproben und zwei PBS-Kontrollen mitlaufen. In jedes Loch der Mikrotiterplatte wurden 10 µl Serumverdünnung und 50 µl des Tracer-gekoppelten Antigens gegeben und die Platten 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer gewaschen und jedes Loch mit 50 µl Substrat (1 mg o-Phenylendiamin/ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6 mit einem Gehalt an 0,01% H₂O₂) versetzt. Die Reaktion wurde nach 5 Minuten mit 2 M H₂SO₄ zum Stehen gebracht. Der Test wurde mit einem Spektrophotometer bei 495 nm abgelesen. Absorptionswerte, die das arithmetische Mittel der Negativkontrollen plus Standardabweichungen (x + 3 SD) überschritten, wurden als positiv gewertet. Als Antikörpertiter wurde die höchste Serumverdünnung definiert, deren optische Dichte den Grenzwert noch überschritt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Vergleichsbeispiel
Die in Beispiel 4 untersuchten Serumproben wurden zusätzlich mit dem Immunofluoreszenztest (IF) untersucht.
Zu diesem Zweck wurden Ausstriche von HTLV-III-infizierten Molt 3-Zellen auf Glasträgern angefertigt, indem man kleine Tropfen (5 × 10⁶ Zellen/ml) in die Vertiefungen teflonbeschichteter Objektträger setzte. Durch sofortiges Entfernen überschüssiger Flüssigkeit bildete sich ein dünner Zellfilm auf dem Glas. Nach kurzem Trocknen wurden die Zellen 10 Minuten lang in kaltem Aceton fixiert und konnten bei -70°C für längere Zeit aufbewahrt werden.
Die Seren wurden mit PBS beginnend mit einer Verdünnung von 1 : 20 verdünnt. Die Serumverdünnungen wurden 1 Stunde lang bei 37°C auf den Objektträgern inkubiert. Anschließend wurde gewaschen und FITC(Fluorescein)-markiertes Antihuman-Ig-Globulin (Welcome Laboratories, Beckenham, Kent, U. K.) 30 Minuten lang bei 37°C aufgebracht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 in Korrelation zu den mit dem erfindungsgemäßen RF-ELIC-Verfahren erhaltenen Ergebnissen wiedergegeben. Wie die Tabelle zeigt, stimmen die Ergebnisse beider Tests weitgehend überein. Nach beiden Verfahren sind 687 der 1000 untersuchten Seren negativ, wobei nur jeweils ein Serum mit dem RF-ELIC-Test positiv und dem IF-Test negativ und umgekehrt war. Beide Seren waren mit der Immunoblot-Analyse (vgl. Schmitz, H. and Mueller-Lantsch, Intervirology 13, 154 (1980b) und Towbin, H., Staehlin, T. and J. Gordon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979) positiv. Zur Durchführung der Immunreaktion wurden 2 mm Streifen 16 Stunden lang in 1 ml Serum inkubiert. Nach dem Waschen ließ man ein anti-Human-IgG- POD-Konjugat (DAKO, Kopenhagen), Verdünnung 1 : 1000, 2 Stunden lang einwirken. Nach erneutem Waschen wurden die Streifen mit Chlornaphthol angefärbt.
Zusätzlich wurden sämtliche Seren mit einem handelsüblichen indirekten ELISA (Organon) untersucht. Hierbei wurde mit einem der positiven Seren ein falsches negatives Ergebnis und mit 6 der 686 negativen Seren positive Ergebnisse erhalten. Die mit dem ELISA erhaltenen Ergebnisse ließen sich mit der Immunoblot-Analyse nicht bestätigen.
Tabelle 2
Titer RF-ELIC

Claims (6)

1. Immunologisches Verfahren zum Nachweis Antigen-spezifischer Antikörper in Humanserum unter Verwendung markierter Antigene und einer mit Rheumafaktor beschichteten Trägerplatte, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) die Antigene an Tracer koppelt, die aus markierten F(ab)₂-Fragmenten oder markierten monoklonalen Antikörpern bestehen,
  • b) die Tracer-gekoppelten Antigene gleichzeitig mit einer Probe des zu untersuchenden Serums und einer mit Rheumafaktor beschichteten Trägerplatte in Kontakt bringt,
  • c) die nicht an die Trägerplatte gebundenen Bestandteile der Mischung entfernt und
  • d) die Markierung auf der Trägerplatte mit geeigneten Verfahren nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Tracer in Stufe a) Enzym-markierte F(ab)₂-Fragmente oder Enzym-markierte monoklonale Antikörper verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antigene Viren vom Typ HTLV III und/oder Fragmente derselben verwendet.
4. Verwendung eines Testkits enthaltend
  • a) Tracer-gekoppelte Antigene, wobei der Tracer aus markierten F(ab)₂-Fragmenten oder markierten monoklonalen Antikörpern besteht,
  • b) Trägerplatten beschichtet mit Rheumafaktor und
  • c) geeignete Mittel zum Nachweis der Markierung
zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 3.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Tracer aus Enzym-markierten F(ab)₂-Fragmenten oder Enzym-markierten monoklonalen Antikörpern besteht und daß das Mittel zum Nachweis der Markierung ein geeignetes Substrat für die Enzymreaktion ist.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3807440A1 (de) * 1988-03-07 1989-09-21 Progen Biotechnik Gmbh Verfahren zum immunologischen nachweis von substanzen sowie eine derartige zusammensetzung und ein testkit
EP0345462A3 (de) * 1988-06-10 1991-07-31 Abbott Laboratories Immuntest für HIV-1-Antigene unter Benutzung von F(AB')2-Fragmenten als Sonde

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3303793C2 (de) * 1982-02-08 1985-04-11 Abbott Laboratories, North Chicago, Ill. Immunoassay für klassenspezifische Immunoglobulinantikörper
DE2522086C2 (de) * 1974-05-20 1985-04-18 Technicon Instruments Corp., Tarrytown, N.Y. Reagenz zum Abtrennen und Bestimmen von in biologischen Fluiden vorhandenen AK:Ag-Komplexen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2522086C2 (de) * 1974-05-20 1985-04-18 Technicon Instruments Corp., Tarrytown, N.Y. Reagenz zum Abtrennen und Bestimmen von in biologischen Fluiden vorhandenen AK:Ag-Komplexen
DE3303793C2 (de) * 1982-02-08 1985-04-11 Abbott Laboratories, North Chicago, Ill. Immunoassay für klassenspezifische Immunoglobulinantikörper

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Immunology Vol. 116 Nr. 6, Juni(1976) S. 1554-1560 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3807440A1 (de) * 1988-03-07 1989-09-21 Progen Biotechnik Gmbh Verfahren zum immunologischen nachweis von substanzen sowie eine derartige zusammensetzung und ein testkit
EP0345462A3 (de) * 1988-06-10 1991-07-31 Abbott Laboratories Immuntest für HIV-1-Antigene unter Benutzung von F(AB')2-Fragmenten als Sonde

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