DE3524427C1

DE3524427C1 - Einstufiges Verfahren zur Isolierung und Auftrennung der Isolectine aus der Gartenbohne (Phaseolus vulgaris)

Info

Publication number: DE3524427C1
Application number: DE19853524427
Authority: DE
Inventors: Günter Fleischmann; Ingrid Mauder; Harold Prof. Dr. 8700 Würzburg Rüdiger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-07-09
Filing date: 1985-07-09
Publication date: 1986-12-18

Description

Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein einstufiges Verfahren zur Isolierung und Auftrennung der Isolectine aus der Gartenbohne (Phaseolus vulgaris) mit den Merkmalen der im Oberbegriff des im Patentanspruchs 1 beschriebenen Gattung.
Allgemeines Die Lectine der Gartenbohne haben eine besondere Bedeutung erlangt, seit P. C. Nowell (Cancer Res. 20, 462-466 [1960D entdeckte, daß sie die Mitose von Lymphozyten stimulieren. Später stellten R# D. Leavitt, R. L Felsted und N. R Bachur (J. Biol. Chem. 252, 2961-2966 [1977D fest, daß es sich bei diesem vermeintlich einheitlichen Lectin um eine Serie von 5 Isolectinen handelt, die aus zwei Typen von Untereinheiten, E und L genannt, in Form der Tetrameren 4 E1L3, E2L2, E3L1 und E4 aufgebaut sind, und daß von diesen Isolectinen nur die an L-Untereinheiten reichen, d. h. also vor allem 4 zur Bindung an Lyphozyten und zu deren Proliferation in der Lage sind. Seither werden in vielen Laboratorien die Lectine aus Phaseolus vulgaris zur Stimulation der Lymphozyten-Mitose eingesetzt, wobei zwar auch das Isolectin-Gemisch, bevorzugt aber das reine Isolectin L4 verwendet wird. Sowohl das Isolectin-Gemisch als auch die erheblich teureren reinen Isolectine werden von zahlreichen Formen des Biochemikalien-Handels angeboten.
Stand der Technik Verfahren zur Isolierung von Isolectinen sind an und für sich bekannt. Alle bisherigen Verfahren bestehen jedoch aus mehreren, mindestens aber aus zwei Schritten, nämlich der Isolierung und danach der Auftrennung des Isolectingemisches: a Affinitätschromatographische Isolierung des Isolectingemisches an immobilisierten Glycoproteinen Dazu diente bisher an Sepharose 4B immobilisiertes Thyroglobulin (R. L Felsted, R. D. Leavitt und N. R Bachur, Biochim. Biophys. Acta 405, 72-81 [1975]) oder Fetuin (B.-A. Sela, J. L. Wang und G.
M. Edelman, J. Biol. Chem. 250, 7535-7538 [1975X.
Als Immobilisierungsmethode diente dabei die von J. Porath (Methods Enzymol. 34B, 13-30 [1974 eingeführte Bromcyan-Kupplung, bei der große Mengen dieses aggressiven und giftigen Reagens verwendet werden müssen, da ein großer, nicht steuerbarer Anteil in nutzlosen "Leer-Reaktionen" verbraucht wird. Ochoa und Kristiansen (FELS Letters 90, 145-148 [1978) benutzten mit Glutardialdehyd vernetzte Erythrozyten-Membranen (Stroma). Diese Medien sind entweder sehr teuer (je nach Reinheitsgrad kostet 1 g Thyroglobulin zwischen 250 bis 350 DM, 1 g Fetuin zwischen 13Q und 650 DM) oder nur unter beträchtlichem Aufwand zu gewinnen (Erythrozyten-Stroma). Soweit Kapazitäten der Adsorbentien angegeben wurden (Ochoa und Kristiansen), sind sie nur sehr niedrig (0,06 mg Lectin pro ml Gel).
b. Auftrennung des Isolectingemisches Im meist verwendeten Verfahren nach R. D. Leavitt, R# L. Felsted und N. R. Bachur (J. Biol. Chem.
252, 2961-2966 [1977) wird das Isolectingemisch an dem Kationen-Austauscher Sulfopropyl-Sephadex adsorbiert. Die Isolectine werden dann mit Hilfe eines NaCl-Gradienten nacheinander desorbiert.
Dieser Schritt erfordert umfangreiche Vorbereitungen. So muß das zu trennende Proteingemisch auf das Puffermilieu der Ionenaustausch-Chromatographie eingestellt werden, was durch Lyophilisation, Ultrafiltration oder Dialyse geschieht, alles Verfahren, die einen zeitlichen Aufwand mit sich bringen und nicht verlustfrei arbeiten. Nach der Chromatographie muß die Säule durch längeres Waschen mit Ausgangspuffer wieder für die nächste Chromatographie vorbereitet werden.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, billiges und einstufiges Verfahren zur Isolierung und Auftrennung der Isolectine der Gartenbohne bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die in dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen 2-5 gekennzeichnet.
Eigene Neuentwicklung Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch Te- traborat-Puffer-Lösung ansteigender Konzentrationen die Isolectine nacheinander in einem einzigen Arbeitsgang desorbiert und aufgetrennt werden können. Zur Herstellung des Affinitätsgels wird hierbei wie folgt verfahren: Ovomucoid wird nach H. Lineweaver und C. W. Murray (J. Biol. Chem. 171,565-581 [1947ß durch eine einfache Fällung mit Trichloressigsäure und Aceton aus dem Eiklar von Hühnereiern gewonnen. Man kann auch käufliches Ovomucoid verwenden; 1 g kostet 48 DM, ist also erheblich billiger als die oben angeführten Glycoproteine. Das selbst hergestellte Produkt (ca. 50 mg aus einem Ei) hat allerdings im Vergleich zum käuflichen nach der Immobilisierung eine wesentlich höhere Bindungskapazität für Lectine. Sepharose 4B (Deutsche Pharmacia, Freiburg) wird nach J. Kohn und M. Wilchek (Biochem.
Biophys. Res. Commun. 107, 878-884 [1982]) aktiviert.
Bei diesem neuen Verfahren, das bisher für die Reinigung von Lectinen noch nicht verwendet worden ist, braucht man im Gegensatz zu den bisherigen Verfahren nur sehr wenig des giftigen Bromcyan (8-20 mg Bromcyan pro ml Gel). "Leer-Reaktionen" sind unter den Bedingungen dieser neuartigen Modifikation stark zurückgedrängt; daher ist die Aktivierung gut steuerbar. Wir erhalten mit dieser Methode Beladungsdichten von 7 bis 8 mg Ovomucoid pro ml Gel.
Zur Isolierung und Auftrennung der Isolectine aus der Gartenbohne werden die Bohnen über Nacht in 0,05 M Tris/Acetat-Puffer-Lösung pH 8,0, je 1 mM an Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, gequollen, danach in der zehnfachen Menge dieses Puffers mit einem Dispergierstab (Ultraturrax, IKA-Werk, Staufen) homogenisiert und zentrifugiert. Dieser Extrakt wird unmittelbar mit dem immobilisierten Ovomucoid, das mit demselben Puffer äquilibriert worden ist, zusammengebracht. Das Gel bindet pro ml maximal 7 mg der Lectine. Es ist aber zweckmäßig, einen 1,5 bis 2fachen Überschuß an Gel zu verwenden, um nicht einen Teil des schwächer bindenden Isolectins L4 zu verlieren. Der Kontakt zwischen Extrakt und Gel kann auf einer Säule erfolgen; wenn größere Mengen zu verarbeiten sind, ist das ~batch"-Verfahren von Vorteil. Hierbei wird das Gel zunächst zusammen mit dem Samenextrakt gemischt und verrührt. Sowohl bei dem Säulen- als auch bei dem "batch"-Verfahren wird das Gel mit dem Startpuffer von Fremdprotein freigewaschen, das im "batch" verarbeitete mit Lectin beladene Gel wird danach in eine Säule gegossen und in der angegebenen Weise mit Tetraborat/HCl-Pufferlösungen ansteigender Konzentration eluiert.
Nachstehendes Beispiel erläutert die Erfindung. Die Auftrennung der Isolectine L4, E1L3, E2L2, E3L1 und E4 erfolgt durch sequentielle Elution mit Tetraborat/HCl-Pufferlösungen von pH 8,0 ansteigender Konzentrationen, und zwar: L4: mit 15 mM, Etc3: mit 40 mM, E2L2: mit 65 mM, E3L1:mit 110 mM, E4: mit 250 mM Tetraborat oder mit 100 mM Formiat/NaOH pH 3.0.
Ausbeuten in bezug auf die Agglutinationsaktivität sind fast vollständig. In Tabelle 1 werden die biologischen Effekte der Isolectine aufgeführt.
Interessieren nur die reinen Isolectine L4 und E4, was normalerweise der Fall sein dürfte, so vereinfacht sich das Elutionsschema: L4: 15 mM Tetraborat/HCI pH 8,0, intermediäre Formen: 110 Tetraborat/HCI pH 8,0, diese Fraktion wird verworfen, Eq: 100 mM Formiat/NaOH pH 3,0.
Nach der Behandlung mit Formiat-Puffer pH 3,0 wird sofort neutralisiert und durch Einstellen auf je 1 mM Calciumchlorid und Magnesiumchlorid sichergestellt, daß das Lectin diese essentiellen Kationen, die bei der Säurebehandlung teilweise verlorengehen, zurückerhält. Wir ziehen die Elution mit Formiat-Puffer pH 3,0 der mit 250 mM Borat/HCl pH 8,0 vor, da sich im letzteren Fall, vor allem beim Arbeiten bei Kühlraumtemperatur, Löslichkeitsprobleme ergeben. Das Affinitätsgel wird durch Waschen mit Tris/Acetat-Puffer pH 8,0 rasch regeneriert Tabelle 1 Agglutinierende und mitogene Eigenschaften der Isolectine Titer x ml/mg Mitogenität Protein Konzentr.- Stimul.-spez. Aggl.- Optimum index Aktivität (ug/ml) Mischung 115 8 24 L4 0 1,1 29 E1L4 31 ~ ~ E2L2 118 ~ ~ E3L1 128 ~ ~ E4 235 37 20 - Leerseite -

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Isolierung und Auftrennung der Isolectine aus der Gartenbohne (Phaseolus vulgaris) mittels der Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ovomucoid-Sepharose als Affinitätsgel, dadurch gekennzeichnet, daß durch Tetraborat-Puffer-Lösungen aufsteigender Konzentrationen die Isolectine nacheinander in einzelnen Stufen in reiner Form desorbiert und gewonnen werden können.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß in einer Stufe das Isolectin L4 mit einer Tetraborat/HCI-Pufferlösung pH 8.0 (12~18 mM, bezogen auf Tetraborat) eluiert wird, daß in einer 2. Stufe das Isolectin E1L3 mit einer Tetraborat/HC1-Pufferlösung (35-45 mM) eluiert wird, daß in einer 3. Stufe das Isolectin E2L2 mit einer Tetraborat/HC1-Pufferlösung (60-70 mM) eluiert wird, daß in einer 4. Stufe das Isolectin E3L1 mit einer Tetraborat/HCl-Pufferlösung (100-120 mM) eluiert wird, und daß in einer 5. Stufe das Isolectin E4 mit einer gesättigten Tetraborat/HCl-Pufferlösung (250 mM) eluiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung der Isolectine L4 und E4 ein zweistufiges Verfahren angewendet wird, wobei das Isolectin L4 durch Elution mit einer Tetraborat/HCl-Pufferlösung pH 8.0 (12-18 mM) eluiert wird und das Isolectin E4 durch Elution mit einer Tetraborat-Pufferlösung pH 8.0 (250mM) eluiert wird und zwischen der Stufe 1 und 2 mit 100-120 mM Tetraborat/HCl-Pufferlösung pH 8.0 eluiert wird und die erhaltenen Fraktion verworfen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung des Isolectins E4 die Elution anstatt mit einem Tetraborat-Puffer mit einer Formiatpuffer-Lösung durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Elution mit Formiat-Pufferlösung sofort neutralisiert und auf je 1 mM Calciumchlorid und Magnesiumchlorid eingestellt wird.