DE3490001T1 - Verfahren und Analysesatz zur Diagnostizierung von Krebs bei Menschen - Google Patents

Description

Verfahren und Analysesatz zur Diagnostizierung von Krebs

bei Menschen

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Krebsdiagnose und -überwachung, insbesondere bezieht sich sich auf ein Verfahren zur Diagnostizierung von Krebs bzw. zur Überwachung des Krebszustands bei Patienten, die bereits als krebskrank diagnostiziert wurden, unter Bestimmung der Menge bestimmter modifizierter Nukleoside im Urin durch Immunoassay.

Ribonukleinsäuren (RNS), insbesondere Transfer-RNS, enthalten eine Vielzahl modifizierter Nukleoside, die nach der Transkription des Makromoleküls gebildet werden. S. Nishimura, Transfer RNA: Structure, Properties, and Recognition, Herausgeber P.R. Shimmel et al, Cold Spring Harbor Laboratory (1979), berichtet, daß mehr als 50 dieser modifizierten Nukleoside isoliert und charakterisiert wurden. Wenn diese RNS abgebaut werden, wird anscheinend die Mehrzahl der modifizierten Nukleoside in Tieren oder Menschen kaum katabolisiert und in erheblichen Mengen im Urin ausgeschieden. Da Transfer-RNS zur höchstmodifizierten Klasse von RNS gehören, wurde angenommen, daß der Umsatz an Transfer-RNS der Grund für die ausgeschiedenen modifizierten Nukleoside ist. Der Nachweis für eine höhere Umsatzgeschwindigkeit von Transfer-RNS in Tumorgewebe sowie der Nachweis für eine intrazellulare Ausspülung von Transfer-RNS mit struktureller Abnormalifät wurde inzwischen veröffentlicht, vgl. E. Borek et al, Cancer Res (1977) 37:3362-3366, und Y. Nomura, FEBS Lett (1974) 45:223-227.

Bis zur vorliegenden Erfindung war nur von sechs der mehr als 50 bekannten, natürlich vorkommenden modifizierten Nukleoside berichtet worden, daß sie in Krebspatienten verstärkt vorhanden

— Jif — ' ■■

sind. Diese sechs umfassen vier methylierte Nukleoside

2 2

(1-Methylinosin, N ,N -Dimethylguanosin, 2-Methylguanosin und

4
1-Methyladenosin), Pseudouridin und N -Acetylzytid in. C.W. Gehrke et al, Cancer Res (1979) 3J3^; 1150-1153, J. Speer et al, Cancer (1979) -44:2120-2123, und E. Borek, Cancer Markers (1980) Ed. S. Seil, Human Press, berichten über den Nachweis erhöhter Mengen dieser fünf Nukleoside im Urin von Krebspatienten mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie. Die Nukleoside werden vor dem Meßvorgang z. B. mittels Affinitätschromatograüie aus dem Urin herauskonzentriert. Über die Serumspiegel der durch Radioimmunoassay bestimmten Sl-Aminocapronatderivate

2 2
von N ,N -Dimethylguanosin und Pseudouridin in Krebspatienten wurde ebenfalls berichtet, vgl. Levine et al, J Natl Cancer Inst (1975) 54:341-343. Radioimmunoassays für verschiedene modifizierte Nukleoside einschließlich N- [9-(ß-D-ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl]-L-threonine (t A) wurden angewandt, um die Pegel solcher Nukleoside in bakteriellen Transfer-RNS auszuwerten; vgl. Milstone et al, Nucl Acids Res (1978), 5:3439-3455; B.Void, Nucl Acids Res (1979) 7:193-204; und B. Void et al, Nucl Acids Res (1979) 7:971-980.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines reproduzierbaren nichtinvasiven Verfahrens zum Nachweis der Anwesenheit oder des Zustands von Krebs im Menschen auf der Grundlage der Pegel modifizierter Nukleoside in physiologischen Fluiden. Bei der Erfindung werden nichtfraktionierter Urin als physiologisches Testfluid sowie ein Immunoassay zur Bestimmung . der Menge modifizierten Nukleosids im Urin eingesetzt. Weiterhin soll ein Verfahren zur Diagnostizierung von Krebs im Menschen angegeben werden, das auf dem Pegel von N-[9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl]-L-Threonin im Urin basiert. Ferner soll ein neuer monöklonaler Anti-t A-Antikörper zum Einsatz bei einer solchen Diagnose angegeben werden.

- Y-

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Bestimmung von Krebs in einem menschlichen Patienten umfaßt folgende Schritte: (a) Bestimmen der Menge an N-[9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl]-L-Threonin im Urin des Patienten, und

(b) Vergleichen dieser Menge mit der Standardmenge N-[9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoylJ-L-Threonin im Urin normaler Menschen zur Feststellung, ob diese Menge wesentlich größer als die Standardmenge ist.

Wenn dieses Verfahren zur Überwachung des Krebszustands bei einem Krebspatienten eingesetzt wird, werden die jeweiligen Mengen N-[9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoylj-L-Threonin in vom Patienten in vorbestimmten Zeitintervallen entnommenen Urinproben verglichen.

In dieser Hinsicht liegt die Erfindung in der Entdeckung, daß t A im Urin von Krebspatienten erhöht ist, und nicht unbedingt in einem bestimmten Verfahren zum Nachweis von t A. Infolgedessen kann hierbei jedes Nachweisverfahren einschließlich Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie und quantitatives Immunoassay zur Durchführung des Verfahrens angewandt werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung von Krebs in einem menschlichen Patienten folgende Schritte:

(a) Bestimmen der Menge eines nichtderivatisierten modifizierten Nukleosids in einer nichtfraktionierten Urinprobe des Patienten durch quantitatives Immunoassay der Probe, und

(b) Vergleichen dieser Menge mit der Standardmenge des nichtderivatisierten modifizierten Nukleosids, die im Urin normaler Menschen vorhanden ist.

Auch hier werden bei der Überwachung des Krebszustands die jeweiligen Mengen nichtderivatisierter modifizierter Nukleoside, die in Urinproben festgestellt werden, die dem Patienten in vorbestimmten Zeitintervallen entnommen wurden, verglichen.

V" ' 3430001

Weitere Aspekte der Erfindung sind Hybridom ATCC HB 8351, ein monoklonaler Antikörper aus Hybridom ATCC HB 8351, sowie funktioneile Äquivalente desselben, und ferner Immun-Analysesätze zur Bestimmung von t A, die den monoklonalen Antikörper oder funktionelle Äquivalente desselben enthalten.

Anhand der Zeichnung wird die Erfindung beispielsweise näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ist eine Grafik, die die Resultate der Radioimmunoassays von Beispiel 2 wiedergibt,

Fig. 2 eine Grafik, die die Resultate der beiden in

Beispiel 2 beschriebenen ELISA-Tests zeigt, und

Fig. 3 eine Grafik, die die Resultate des in Beispiel 2 beschriebenen kompetitiven ELISA-Tests zeigt.

Die Verfahren nach der Erfindung können zur Diagnostizierung oder Überwachung des Zustands jedes Typs von Zellneoplasma einschließlich Karzinomen, Myelomen und Lymphomen eingesetzt werden. Diese Verfahren sind somit bei der Diagnose wie etwa bei Reihenuntersuchungen zur Früherkennung der Krankheit, ferner bei der Therapie wie etwa bei der Auswertung des Zustands der Krankheit nach postoperativer Bestrahlung und/oder chemotherapeutischer Behandlung sowie bei der Prognose wie etwa der Erkennung eines möglichen erneuten Auftretens von Metastasen einsetzbar. Beispiele von Karzinomen, von denen festgestellt wurde, daß sie mit erhöhten modifizierten Nukleosidspiegeln einhergehen, sind Leukämie, Lungenkrebs, Burkittsches Lymphom, Melanom, Eierstockskrebs, metastatischer Brustkrebs, die Hodgkinsche Krankheit, Darm- und Blasenkrebs.

Die bei den Verfahren eingesetzten Urinproben können entweder willkürlich oder über eine bestimmte Periode, üblicherweise von 24 h, entnommen werden. Es wurde berichtet, daß keine signifikante Änderung der Pegel modifizierter Nukleoside relativ zu der Durchführung der Probenentnahme auftritt; vgl. A. Fischbein

— sy -

^ 3 4 9 0 0 0 Ί

et al, Cancer Res (1983) 4Ji: 2971-2974. Einer der wesentlichen Vorteile der Erfindung gegenüber dem bekannten Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie-Verfahren liegt darin, daß das Nukleosid vor der Analyse nicht von der Urinprobe getrennt werden muß. Bei dem Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie-Verfahren werden die Nukleoside durch Affinitätschromatografie von der Probe getrennt, bevor die Analyse durchgeführt wird. Die Nukleoside brauchen auch nicht derivatisiert zu werden, wie dies bei den bekannten Serumanalysen der Fall ist. Die bei den Verfahren eingesetzte Urinmenge liegt normalerweise zwischen ca. 1 und ca. 100 μΐ in Abhängigkeit von dem speziell betroffenen Nukkleosid und/oder Antikörper.

Die modifizierten Nukleoside, die die Basis für die Erkennung von Krebs bilden, treten im Urin von Patienten mit dem diagnostizierten Krebstyp in erheblich größeren Mengen auf. Die modifizierten Nukleoside, von denen berichtet wurde, daß sie in erhöhten Mengen von Krebspatienten ausgeschieden werden, sind

2 2

1-Methylinosin, N ,N -DiraethylguanosinjPseudouridin,

4
1-Methyladenosin, N -Acetylzytid in und 2-Methylguanosin. Es wurde nunmehr gefuinden, daß t A ebenfalls in erhöhten Mengen von Krebspatienten ausgeschieden wird, t A ist ein besonders interessierendes modifiziertes Nukleosid, da es nur in Transfer-RNS auftritt, t A ist außerdem in anderer Weise (Zusatz von Threonin) als alle anderen modifizierten Nukleoside modifiziert, von denen bekannt ist, daß sie in Krebspatienten in erhöhten Mengen auftreten.

Wenn das Assay zur Überwachung des Krebszustands eines Patienten, bei dem bereits Krebs diagnostiziert wurde, eingesetzt wird, dienen die modifizierten Nukleosidspiegel im eigenen Urin des Patienten als interner Kontrollwert. Verringerungen bedeuten eine Verminderung der Tumorbelastung, wie sie etwa auftreten kann, nachdem der Patient behandelt wurde. Steigerungen bedeuten eine erhöhte Tumorbelastung, die ein erneutes Auftreten oder Metastasen des Karzinoms anzeigt.

- 1-fK -

Die Mengen dieser modifizierten Nukleoside im Urin werden durch ein quantitatives Immunoassay bestimmt. Dabei können verschiedene Arten von quantitativen Immunoassays wie kompetitive Immunoassays, direkte und indirekte Immunoassays angewandt werden. Die drei am häufigsten angewandten quantitativen Immunoassays sind Radioimmunoassay bzw. RIA, quantitative Immunfluoreszenz (und zwar sowohl lösliche als auch feste Phase) sowie quantitative Enzymassays. Jede dieser Analysemethoden kann zur praktischen Durchführung der Erfindung angewandt werden. Diese Assays verlangen die Bildung von Immunkomplexen, die eine Markierung aufweisen, sowie die Bestimmung solcher Komplexe mittels der Markierung. Im vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck "Markierung" Anteile umfassen, die direkt erkannt werden können wie etwa Fluorochrome und Radiomarkierungen, sowie auch Anteile wie etwa Enzyme, die entweder umgesetzt oder derivatisiert werden müssen, damit sie bestimmt werden können. Bei kompetitiven Assays wird die Probe mit einem Antikörper gegen das modifizierte Nukleosid und einer bekannten Menge von markiertem modifiziertem Nukleosid inkubiert. Jedes modifizierte Nukleosid (unmarkiert) in der Probe tritt mit dem markierten Nukleosid in Konkurrenz für Antikörper. Die resultierenden Immunkomplexe werden abgetrennt, und die darin enthaltene Menge an markiertem Komplex wird bestimmt. Die Menge des modifizierten Nukleosids wird durch Vergleich mit dem Standardeffekt bestimmt. Bei direkten Immunoassays wird die Probe mit einem markierten Antikörper gegen das modifizierte Nukleosid inkubiert, und alle sich bildenden Immunkomplexe werden abgetrennt. Die darin enthaltene Markierungsmenge wird bestimmt, und die Menge an modifiziertem Nukleosid in der Probe wird durch Vergleich mit dem Standardeffekt bestimmt. Bei einem indirekten Immunoassay wie etwa ELISA wird der an ein Trägerprotein wie Albumin gebundene Antikörper an eine feste Phase (z. B. eine Rohr-, Steinchenoder Vertiefungsoberflache) gebunden (immobilisiert), der erste Antikörper wird zugefügt, und ein zweiter, enzym-markierter

Antikörper gegen den ersten Antikörper wird zugefügt. Immobilisierte Immunkomplexe werden über die Reaktion des Enzyms mit einem geeigneten Substrat bestimmt.

Die spezielle eingesetzte Markierung hängt von der Art des verwendeten quantitativen Immunoassays ab. Das Assay sollte derart sein, daß Empfindlichkeiten bis herunter zu wenigstens ca. 1-10 pmol modifiziertes Nukleosid erhalten werden.

Beispiele für Markierungen, die eingesetzt werden können, sind

32 125 3 14 Radiomarkierungen wie P, I, H und C, Fluoreszenzmarkierungen wie Fluoreszein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl sowie Umbell iferon, Chemilumineszenzstoffe wie Luciferine und 2,3-Dihydrophthalazindione, sowie Enzyme wie Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Lysozym sowie Glukose-6-phosphat-Dehydrase. Der Antikörper bzw. das Nukleosid kann mittels bekannter Verfahren mit solchen Markierungen versehen werden. Z. B. können Haftmittel wie Aldehyde, ^Carbodiimide, Dimaleimide, Imidate, Sukzinimide, bisdiazotiertes Benzadin u. dgl. zur Markierung der Antikörper mit fluoreszierenden, chemilumineszenten oder Enzymmarkierungen eingesetzt werden.

Die Antikörper gegen die modifizierten Nukleoside, die bei diesen Immunoassays eingesetzt werden, können entweder polyklonal (heterolog) oder monoklonal (homolog) sein. Polyklonale Antikörper können erhalten wurden durch Immunisierung von Tr'ägertieren wie Mäusen, Kaninchen und Schafen, wobei ein modifiziertes Nukleosid-Proteinträger-Konjugat als Immunogen eingesetzt wird. Die Immunisierung erfolgt typischerweis.e durch wiederholte Impfungen mit dem Immunogen, charakteristisch wenigstens zweimal in etwa wöchentlichen Abständen. Eine solche Impfung erhöht die Immunitätsreaktion gegen das Immunogen und veranlaßt das Immunsystem des geimpften Trägers zur Erzeugung von Antikörpern gegen das modifizierte Nukleosid. Serum des immunisierten Trägers wird üblicherweise etwa 3-10 Tage nach der letzten Impfung entnommen. Immunglobuline können aus dem

Serum abgetrennt werden durch Ammoniumsulfatausfällung, Gelelektrophorese, Dialyse, Chromatografie oder erwünschtenfalls andere konventionelle Abscheidungs- und Reinigungsverfahren.

Monoklonale Antikörper gegen die modifizierten Nukleoside
können hergestellt werden durch das somatische Zellenhybridisierungsverfahren nach Kohler und Milstein, Nature (1975)
265:495 unter Einsatz von Antikörper erzeugenden Zellen wie
Milzzellen oder lympheähnlichen Zellen des immunisierten
Trägertiers, bevorzugt einer Maus, als einem der Hybridisierungspartner. Die Antikörper erzeugenden Zellen werden mit
einer geeigneten Krebs(Myelom)zellenlinie hybridisiert (verschmolzen) unter Anwendung eines Verschmelzungsmittels wie
Polyethylenglykol mit einer relativen Molekülmasse von
1000-6000 Dalton. Eine Myelomzellenlinie, die für ein selektives Medium wie HAT-Medium (Littlefield, Science (1969),
145:709-710) empfindlich ist, verschmilzt mit gutem Wirkungsgrad und unterstützt eine beständige Hochpegel-Exkretion und -Sekretion von Antikörper durch den Hybridisierungspartner. Zwar können Myelomzellen von jeder Spezies, etwa den oben in bezug auf polyklonale Antikörper angegebenen, eingesetzt
werden, es sind jedoch derzeit Mäuse-und Ratten-Myelomlinien mit diesen Eigenschaften verfügbar und werden bevorzugt.
Beispiele für solche Linien sind die von den ursprünglichen
MOPC-21- und MPC-11-Mäusetumoren abgeleiteten, die vom SaIk
Institute Cell Distribution Center, San Diego, bezogen werden können. Ein Verhältnis von 1:10 bis 10:1 zwischen Myelomzelle und antikörpererzeugender Zelle wird normalerweise angewandt. Die einzelnen Zellenkonzentrationen liegen typischerweise im

6 8 7 7

Bereich von ca. 10 bis 10 , bevorzugt 1 χ 10 bis 5 χ 10

Zellen/ml Verschmelzungsmedium. Im Gleichgewicht befindliche Salzlösungen, die ca. 30-60 % (Gewichtsteile), bevorzugt
35-50 % (Gewichtsteile), Verschmelzungsmittel enthalten, können als Verschmelzungsmedium eingesetzt werden. Nach der
Verschmelzung werden die Zellen mit Verschmelzungsmittelfreiem Medium gewaschen, um das Verschmelzungsmittel zu entfernen. Sie werden dann dem selektiven Medium eingeimpft und dort kulti-

' 349000 T

viert, um nichthybridisierte Stammzellen zu eliminieren und nur solche Hybride zu belassen, die gegenüber dem selektiven Medium r.esistent sind und die Unsterblichkeit des Myelomstamms besitzen. Die Kultivierung dauert normalerweise ca. 3-5 Wochen.

Überlebende Hybridome können durch Immunoassay auf die Erzeugung von Antikörper gegen das modifizierte Nukleosid untersucht werden. Positive Hybridom-Klone können durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels bekannter Verfahren entweder in vitro oder in vivo gezüchtet werden. Der von den Subklonen sekretierte monoklonale Antikörper gegen das modifizierte Nukleosid kann, wenn er in vivo gezüchtet wird, vom Kulturmedium oder Aszitesflaid mittels bekannter Techniken getrennt werden, z. B. durch Ammoniumsulf at-Aussf'ällung, DEAE-Zellulosechromatografie oder Affinitätschromatografie. Eine weitere Reinigung der Antikörper kann erwünschtenfalls durch Ultrazentrifugieren und Mikrofiltration erzielt werden.

Antikörper gegen den Isotyp des Antikörpers gegen das modifizierte Nukleosid können als markierter zweiter Antikörper in indirekten Assays wie ELISA eingesetzt werden. Wenn z. B. der Antikörper gegen das modifizierte Nukleosid ein Mäuse-IgG ist, kann Anti-Mäuse-IgG-Serum von einer anderen Säugetierspezies eingesetzt werden. Solche Anti-Isotyp-Antikörper können durch konventionelle Immunisierungsverfahren gezüchtet werden. -

Die Inkubation bei den Immunoassays erfolgt unter Bedingungen, die eine Reaktion zwischen dem Antikörper und dem modifizierten Nukleosid zulassen. Temperatur, pH und Dauer sind die wichtigsten Prozeßbedingungen bei der Inkubation. Typischerweise werden Temperaturen im Bereich von ca. 5-40 C, bevorzugt ca. 37 ⁰C, verwendet. Der pH-Wert beträgt normalerweise 6-9, bevorzugt ca. 7, und die Bindungsreaktion erreicht üblicherweise innerhalb von 10 min bis 2 Tagen Gleichgewicht je nach den speziellen Antikörpern und Nukleosiden. Antikörper wird in den kompetitiven Assays in Grenzmengen eingesetzt. Immun-

komplexe können von dem Inkubationsgemisch durch Zentrifugieren oder andere konventionelle Verfahren getrennt werden. Bei Analyseverfahren wie EMIT ist eine Trennung eventuell nicht erforderlich. Für alle bei den Assays auftretenden Waschvorgänge können konventionelle Puffermedien eingesetzt werden.

Die bei dem Immunoassay verwendete Vorrichtung zur Erfassung der Markierung hängt von der speziellen Markierung ab. Z. B. können Radiomarkierungen mit Szintillationszählern, Fluoreszenzmarkierungen mit Fluoreszenzmikroskopen (Fluorometern) und Enzymmarkierungen mit Kolorimetern, die die Größe der Farbänderung erfassen, die durch die Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat bewirkt ist, oder Spektrofotometern (z. B. Mikrotiterplattenlesegeräten) bestimmt werden.

Die Grundbestandteile des Analysesatzes für die Durchführung des t A-Radioimmunoassays gemäß der Erfindung sind markiertes t A sowie monoklonaler Antikörper gegen t A. Diese Bestandteile befinden sich typischerweise in Lösung in einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel, das in geeigneten Abgabevorrichtungen enthalten ist. Festphasen-Analysesätze enthalten eine Festphase (Rohr oder Steinchen) und ggf. ein Kopplungsmittel wie ein Aldehyd oder Karbodiimid, um den Antikörper an die feste Phase zu binden. ELISA-Analysesätze enthalten t A-Trägerproteinkonjugat, monoklonalen Antikörper gegen t A, enzymmarkierten Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper sowie ein geeignetes Substrat. Die Analysesätze können ferner einen geeigneten Puffer zur Verdünnung und zum Waschen, Trägerprotein, nichtmarkiertes t A zur Zubereitung von Standardsubstanzen, ein Nachbeschichtungs-Präparat zur Verringerung nichtspezifischer Bindungen an der festen Phase, Behälter, in denen die Reagenzien verwendet werden können, sowie Anweisungen zur Durchführung der Analyse enthalten. Die Bestandteile des Analysesatzes können in konventioneller Weise verpackt sein.

Wie bereits erwähnt und in den folgenden Beispielen verdeutlicht, in denen Anti-t A-Kaninchenserum und von Mäusen stammender monoklonaler Antikörper gegen t A eingesetzt werden, ist die Spezies des Antikörpers nicht kritisch. Ebenso ist die Klasse (Unterklasse) des Antikörpers offenbar nicht kritisch, wie durch den Einsatz von Kaninchensera bei dem Verfahren nach der Erfindung (Beispiel 1) erwiesen ist. In den Beispielen ist zwar nur ein einziger monoklonaler Antikörper gegen t A beschrieben, die Erfindung umfaßt jedoch sämtliche monoklonalen Antikörper gegen t A ungeachtet ihrer Spezies oder Klasse, die funktionell zu dem beschriebenen monoklonalen Antikörper äquivalent sind. Funktionell äquivalente monoklonale Antikörper sind solche, die den beschriebenen monoklonalen Antikörper kreuzblockieren (mit der gleichen Determinante reagieren). In dieser Hinsicht unterscheiden sich die Unterklassen von IgG voneinander in ihrem Konstantbereich. Ein IgG gegen einen spezifischen Antikörper hat jedoch ungeachtet seiner Unterklasse einen funktionell äquivalenten variablen Bereich. Obwohl also der als Beispiel verwendete monoklonale Antikörper ein IgG einer bestimmten Unterklasse ist, sind dennoch funktionelle monoklonale Antikörper anderer IgG-Unterklassen oder anderer Klassen (IgM, IgA etc.) von der Erfindung mit umfaßt.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Beispiel 1

Urinproben

24-h-Urinproben wurden von Patienten mit verschiedenen fortgeschrittenen bösartigen Tumoren, die vorher nicht chemotherapeutisch behandelt worden waren, und normalen Freiwilligen am Krebszentrum der University of New Mexico erhalten. Die Urinproben wurden von jeder Person während 24 h in Kunststoffbehältern gesammelt und bis zum Ende des Sammelzeitraums gekühlt aufbewahrt. Dann wurde das Urinvolumen bestimmt, und ein

aliquoter Teil des Urins wurde bis zum Tag der Analyse tiefgekühlt aufbewahrt. Die Kreatininmenge jeder Probe wurde mit dem kolorimetrischen Verfahren gemäß Sigma Technical Bulletin Nr. 555 1-12, 1977, bestimmt.

Antikörper-Herstellung

Immunogen wurde hergestellt durch Konjugation von t A mit Rinderserumalbumin unter Anwendung des Verfahrens nach Erlanger und Beiser, PNAS (1964) 52^:68-74. Antikörper wurden in Kaninchen gebildet, insgesamt 5 mg Immunogen (vermischt mit komplettem Freundschem Adjuvans) je Kaninchen wurde in drei Injektionen an den Tagen 0, 14 und 21 in die Hinterbeine injiziert. Den immunisierten Kaninchen wurde am Tag 28 Blut entnommen. Serum wurde zweimal bei 0 °C mit 50 % gesättigtem Ammoniumsulfat (SAS) mit einem pH von 7,0 abgeschieden und dann gegen 0,14 mol NaCl, 10 mmol Natriumphosphat, pH-Wert 7,0 (phosphatgepufferte Salzlösung) dialysiert.

Mit Tritium behandeltes Antigen

Mit Tritium behandeltes t A wurde durch katalytischen Austausch mit mit Tritium behandeltem Wasser hergestellt. [ Hjt A, 0,84 Ci/mmol, war 88 % rein gemäß der 2D-Dünnschichtchromatografie-Analyse unter Anwendung des Lösungsmittelsystems von Rogg et al, Nulceic Acids Res (1976) 3:285-295, und 6,9 pmol wurde je Assay eingesetzt.

Radioimmunoassay

Tas Radioimmunoassay (RIA) mit gesättigtem Ammoniumsulfat für

t⁶A_r das von B.S. Void in Nucleic Acids Res (1979) 7:193-204, angegeben ist, wurde angewandt. Assays wurden in 12 χ 75 mm-Polypropylenröhrchen mit einem Gesamtreaktionsvolumen von 300 μΐ mit 75 mmol NaCl, 0,1 mol Borsäure, 25 mmol Natriumtetraborat bei einem pH-Wert von 8,3 durchgeführt.

Normales Kaninchen-IgG wurde eingesetzt zur Einstellung der Gesamtproteinkonzentration jedes Assays auf 600 yug. Puffer, Antikörper, Trägerprotein, [³H]t A und unbehandelter Urin wurden gründlich vermischt, bei 37 ⁰C für 1 h inkubiert und

dann für 5 min auf Eis gekühlt. Die Urinmenge wurde so gewählt, daß Normalurin Hemmungswerte zwischen 10 % und 40 % ergeben würde. So wurden 2 μΐ Urin in jedem Assay eingesetzt. Ein gleiches Volumen eiskaltes gesättigtes Ammoniumsulfat wurde jedem Röhrchen zugefügt, gründlich vermischt und bei 0 C für 30 min inkubiert. Die Röhrchen wurden dann mit 9400 xg für 30 min bei 4 ⁰C zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mittels einer Kapillarpipette abgesaugt. Die Pellets wurden wieder ;Ln 200 ^uI 50 % gesättigtem Ammoniumsulfat in Borat-Salz-Pufferlösung suspendiert, vermischt, und wie vorher zentrifugiert und abgezogen. Die gewaschenen Pellets wurden dann in 200 jul 1X-Borat-Salz-Pufferlösung suspendiert, vermischt, und 75 μΐ wurden 5 ml Aquasol-Szintillationsfluid zugesetzt. Dann wurde mit einem Szintillationszähler die Radioaktivität bestimmt. Unter den für die kompetitive Hemmung angewandten Bedingungen betrugen die an den Filter gebundenen Zählungen pro Minute ohne Inhibitor und mit (oder ohne) Antiserum 1133 (66) bei t A. Nach Zugabe von Urin als Quelle kompetitiven Inhibitors und Wiederholung des gleichen Assays bei vier verschiedenen Gelegenheiten betrug die Standardabweichung +_3,7 %.

Die Hemmungskonzentration in jeder Urinprobe wurde aus einer Grafik prozentualer Spurenbindung für den Antikörper interpoliert, nachdem das verwandte modifizierte Nukleosid als kompetitiver Inhibitor eingesetzt worden war. Diese Konzentrationen wurden dann in ausgeschiedenen mg je 24-h-Periode ausgedrückt und auf den Kreatininpegel in jeder Probe, ausgedrückt als nmol Nukleosid/umol Kreatinin, normalisiert; Speer et al, Cancer (1979) 44:20-2123.

Urinproben von 8 normalen Patienten, 4 Patienten mit Hodgkinscher Krankheit, 4 nicht-Hodgkinschen Lymphompatienten, 5 Lungenkrebspatienten (kleinzellig, Adenokarzinom, schuppenförmige Zellen und großzellig) sowie 8 "anderen" Krebspatienten (Brust-, Kopf- und Nacken-, Darmkrebs) wurden untersucht. Keiner der Patienten war vorher chemotherapeutisch behandelt

worden. Die Assay-Resultate der Krebspatienten wurden gruppenweise mit den Assay-Resultaten der normalen Patienten verglichen. Die Signifikanz von Abweichungen der Pegel von t A in den Proben wurde bestimmt unter Anwendung eines P-Tests, wobei jede Krebsgruppe mit der normalen Gruppe verglichen wurde. Ein unter 0,05 liegender P-Wert wurde als erhebliche Abweichung angesehen. Die Vergleichsergebnisse waren wie folgt:

Signifikanz der Abweichung (P) Lymphome feste Tumore Hodgkins Nicht-Hodgkins Lunge andere

nicht signifikant P<0,05 P<0,001 P<0,02

Daß diese Daten erhöhte Pegel von t A im Urin anzeigen, ist ein deutliches Zeichen für sämtliche untersuchten Karzinome, wobei die Hodgkinsche Krankheit eventuell auszunehmen ist. Die Abwesenheit einer bedeutenden Signifikanz bei den Hodgkins-Patienten kann auf die geringe Anzahl betroffener Patienten zurückzuführen sein.

Beispiel 2 Bereitstellung des monoklonalen Antikörpers

Eine Balb/C-Maus wurde mit dem t A-Rinderserumalbumin-Konjugat von Beispiel 1 (100 /ag) in komplettem Freundschem Adjuvans intraperitoneal am Tag 0 immunisiert. Am Tag 7 erhielt die Maus intravenös weitere 100 μ% des Konjugats in phosphatgepufferter Salzlösung. Die Mäusemilz wurde am Tag 10 entnommen. Milzzellen wurden mit P3/63/Ag 8,653 Mäusemyelomzellen gemäß dem Verschmelzungsprotokoll von Kennet verschmolzen (Kennet et al (1979) Cell Fusion, in Methods in Enzymology, Academic Press,

New York, S. 345-357). Das Verschmelzungsmittel war Polyethylenglykol (1540 relative Molekülmasse) mit 38 % (Gewichtsteilen) .

Medien aus Vertiefungen, die überlebende Zellen enthielten, wurden auf Anti-t Α-Antikörper durch Radioimmunoassay untersucht. Zellen aus einer der positiven Vertiefungen (Nr. G8) wurden durch Grenzverdünnung subkloniert in Vertiefungen, die normale Mäusemilzzellen als Nährstoff enthielten. Subklone wurden auf die Erzeugung von Antikörper durch Radioimmunoassay untersucht, und ein Subklon, der als G8-3 identifiziert wurde, wurde als Quelle für monoklonalen Anti-t A-Antikörper ausgewählt.

Zellen des Klons G8-3 wurden tiefgekühlt, wieder in Kultur eingesetzt und ein zweitesmal in vitro nach der gleichen Prozedur wie bei der ersten Subklonierung subkloniert. Zwei Subklone aus der zweiten Subklonierungen wurden zurückbehalten (Nr. 9D4 und Nr. 5C4). Zellen der Linie Nr. 9D4 wurden als etablierte Zellenlinie ausgewählt.

Das Screening der Klone erfolgte unter Anwendung eines Festphasen-Assays. Ein Konjugat von t A:Humanserumalbumin wurde hergestellt und zur Beschichtung der Vertiefungenb einer Mikrotiterplatte verwendet. Kuturfluid wurde dann zugefügt,

ι 25 gefolgt von einem zweiten Antikörper, der mit I markiert war und der Mäuse-IgG erkennt. Eine Probe der Linie 9D4 wurde in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 23. August 1983 hinterlegt. Diese Probe erhielt die ATCC-Nummer HB 8351.

Protein aus dem Kulturfluid von 9D4 wurde durch Affinitäts-Säulenchromatografie unter Anwendung von Protein A-Sepharose CL-4B isoliert. Die gebundene Fraktion aus dieser Säule wurde in verschiedenen quantitativen Immunoassays auf t A untersucht, wie nachstehend beschrieben wird.

Radioimmunoassay

Das in Beispiel 1 genannte Radioimmunoassay mit gesättigtem Ammoniumsulfat wurde angewandt. Das Reaktionsvolumen war 300 jul, und der Gesamtproteingehalt wurde normalisiert unter Anwendung von Immunglobulinen von normalem Trägerkaninchen -typischerweise 300 /ig Gesamtprotein/Assay. Reaktionen,die 8 0 jjg der vorgenannten Fraktion, 15 pmol [ HJt A, unterschiedliche Konzentrationen von unmarkiertem t A und Trägerprotein enthielten, wurden für 1 h bei 37 ⁰C in Borat-Salz-Pufferlösung: 74 mmol NaCl, 0,1 mol Borsäure, 25 mmol Natriumtetraborat, pH 8,3 inkubiert. Nachdem die Reaktionen auf Eis gekühlt waren, wurde ein gleiches Volumen kaltes gesättigtes Ammoniumsulfat zugesetzt. Die Lösung wurde gründlich vermischt, und die Inkubation wurde für 30 min bei 0 ⁰C fortgesetzt. Am Ende der 30-min-Inkubation wurden die Suspensionen für 15 min bei 4 ⁰C mit 9400 χ g zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde durch Absaugen entfernt. Das Pellet wurde erneut in 500 jul eiskaltem 50 % gesättigtem Ammoniumsulfat in Borat-Salz-Pufferlösung suspendiert, erneut zentrifugiert und wie vorher abgezogen. Die gewaschenen Pellets wurden dann erneut in 500 μΐ Borat-Salz-Pufferlösung suspendiert und in 5 ml Aquasol-Szintillationsflüssigkeit überführt. Die Radioaktivität wurde in einem Szintillations-Spektrofotometer bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.

Zwei ELISA-Verfahren wurden getestet: Das eine verwendet alkalische Phosphatase, das andere Meerrettichperoxidase. Bei jedem Verfahren wurden Mikrotiterplatten einmal mit Leitungswasser und einmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurde jede Vertiefung mit 50 jul von 10 ^ig/ml t A-konjugiertem Humanserumalbumin (HSA-t A) in 1 mol NaCl und 0,02 mol Natriumphosphat (pH 7,0) gefüllt und über Nacht bei 4 ⁰C stehen

gelassen. Jede Vertiefung wurde geleert und gewaschen (3 χ 100 jul) mit 1 % HSA in phosphatgepufferter Salzlösung. Dann wurden Vertiefungen mit einer Lösung ohne Antikörper oder mit verschiedenen Verdünnungen von Hybridomkulturfluid in phosphatgepufferter Salzlösung gefüllt. Nach Inkubation bei Raumtemperatur während 2-3 h wurden die Vertiefungen geleert und gewaschen (3 χ 100 Ail) mit 1 % HSA in phosphatgepufferter Salzlösung. Dann wurde jede Vertiefung mit 50 jul einer Verdünnung von Enzym-Antimaus-IgG-Konjugat inkubiert. Jeder Reaktionstyp wurde dann, wie nachstehend beschrieben, in anderer Weise behandelt.

Alkalische Phosphatase

Jeder Vertiefung wurde 50 μΐ einer 1/500-Verdünnung von Ziegen-.

Antimaus-IgG, das auf alkalische Phosphatase konjugiert war, zugesetzt. Nach Stehenlassen während 2-3 h bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen geleert, mit 10 % Diethanolamin (pH 9,8) gewaschen (3 χ 100 μΐ) und mit 100 jul 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 10 % Diethanolamin (pH 9,8) gefüllt. Die Enzym-Substrat-Reaktion wurde für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und mit 100 ul 3N NaOH gestoppt. Die Extinktion bei 405 nm wurde in einem automatischen Mikrotiterplatten-Lesegerät bestimmt (Micro ELISA Autoreader MR 580, Dynatech).

Meerrettichperoxidase

Jeder Vertiefung wurde 50 /al einer 1/500-Verdünnung von Ziegen-Antimaus-IgG, konjugiert auf Meerrettichperoxidase, zugesetzt. Nach Stehenlassen für 2-3 h bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen geleert und einmal mit Wasser sowie zweimal mit 0,05 % Triton-X-100-Tensid in phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Jeder Vertiefung wurde 100 μΐ der folgenden Lösung zugesetzt: 0,1 ml 15 mg 2,2'-Azino-Dl-(3-ethylbenzthiazolin-Sulfonsäure) (ABTS) je ml H₃O, 0,33 ml 0,3 % H₃O₂ sowie 10 ml Zitratpuffer (0,105 g Zitronensäure in 10 ml H„O, unter

Verwendung von 5 mol NaOH auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt). Nach 30 min wurde die Extinktion bei 405 nm in einem automatischen Mikroititerplatten-Lesegerät bestimmt.

Fig. 2 zeigt die Resultate dieser ELISA-Analysen.

Aus diesen ELISA-Verfahren kann eine Standardkurve unter Verwendung eines t A~Standards erstellt werden unter Anwendung eines kompetitiven Hemmungsvorgangs, bei dem freies t A den Vertiefungen zugesetzt wird, in denen das t A-HSA absorbiert wurde. Eine Standardkurve für das ELISA mit alkalischer Phosphatase ist in Fig. 3 dargestellt. Fig. 3 zeigt, daß bei einer Konzentration von t A von 8,4 χ 10 mol eine 50 % Hemmung des ELISA erzielt wurde. Bei Anwendung des RIA mit dem monoklonalen Antikörper wurde eine 50 % Hemmung bei 3,2 χ 10 mol erhalten. Die Konzentration von t A in

9 menschlichem Urin beträgt ungefähr 15 χ 10 mol.

Claims (14)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Bestimmung von Krebs in einem menschlichen Patienten,

gekennzeichnet durch

(a) Bestimmen der Menge von N-[9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl"] -L-Threonin im Urin des Patienten; und

(b) Vergleichen dieser Menge mit der Standardmenge N-[9-(ß-D-Ribof uranosyl )purin-6-ylcarbamoyl] -L-Threonin im Urin normaler Menschen zur Feststellung ,ob diese Menge erheblich größer als die Standardmenge ist.

2. Verfahren zur Überwachung des Krebszustands in einem menschlichen Krebspatienten,
gekennzeichnet durch

(a) Sammeln von Urinproben des Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten;

(b) Bestimmen der Mengen von N-[9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl]-L-Threonin in den Proben; und

(c) Vergleichen der Mengen.

3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,

daß der Krebs ein nicht-Hodgkinsches Lymphom oder ein fester Tumor ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,

daß die Bestimmungen nach Schritt (b) durch quantitatives Immunoassay erfolgen, wobei eine Urinprobe des Patienten mit einem Antikörper gegen N- [?-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyI^-L-Threonin inkubiert wird.

34900°-!

5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,

daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper von Hybridom ATCC HB 8351 oder ein diesem funktionell äquivalenter monoklonaler Antikörper ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,

daß die Bestimmungen durch ELISA erfolgen, wobei ein an eine feste Phase gebundenes t A-Proteinträgerkonjugat mit dem Antikörper inkubiert wird, gefogt von Inkubation mit einem enzymmarkierten Antikörper gegen den Antikörper.

7. Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,

daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper von Hybridom ATCC HB 8351 oder ein diesem funktionell äquivalenter monoklonaler Antikörper ist.

8. Verfahren zur Feststellung von Krebs in einem menschlichen Patienten,

gekennzeichnet durch

(a) Bestimmen der Menge eines nichtderivatisierten modifizierten Nukleosids, das normalerweise von Krebskranken in erhöhten Mengen ausgeschieden wird, in einer Probe nichtfraktinierten Urins des Patienten mittels quantitativen Immunoassays der Probe, und

(b) Vergleichen der in Schritt (a) festgestellten Menge mit der Standardmenge des im Urin normaler Menschen vorhandenen nichtderivatisierten modifizierten Nukleosids.

9. Verfahren zur Überwachung des Krebszustands in einem menschlichen Krebspatienten,
gekennzeichnet durch

-χ- 3490Ό01

(a) Sammeln nichtfraktionierter Urinproben des Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten;

(b) Bestimmen der Mengen eines nichtderivatisierten modifizierten Nukleosids, das normalerweise von krebskranken menschlichen Patienten in erhöhten Mengen ausgeschieden wird, in den Proben mittels quantitativen Immunoassays.

10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,

daß das Assay ein Radioimmunoassay oder ein Enzymimmunoassay ist.

11. Radioimmunoassay-Analysesatz zur Bestimmung der Menge an N-[9-(ß-D-RibofuranosylJpurin-ö-ylcarbamoylJ-L-Threonin in einer Probe, bestehend in Kombination aus radiomarkiertem N-[9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl|-L-Threonin und einem Anti-N-[9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl]-L-Threonin-Antikörper, dadurch gekennzeichnet,

daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper von Hybridom ATCC HB 8351 oder ein funktionelles Äquivalent desselben ist.

12. Immunoassay-Analysesatz zur Bestimmung der Menge an

N-£9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl]-L-Threonin in einer Probe,

dadurch gekennzeichnet, daß der Analysesatz in Kombination umfaßt:

(a) N- [.9- (ß-D-Ribof uranosyl )purin-6-ylcarbamoyl| -L-Threonin, an ein Trägerprotein konjugiert;

(b) monoklonalen Antikörper aus Hybridom ATCC HB 83 51 oder ein funktionelles Äquivalent desselben; und

(c) einen enzymmarkierten Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper oder dessen funktionelles Äquivalent.

3A9DQ⁰¹

5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,

daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper von Hybridom ATCC HB 8351 oder ein diesem funktionell äquivalenter monoklonaler Antikörper ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,

daß die Bestimmungen durch ELISA erfolgen, wobei ein an eine

feste Phase gebundenes t A-Proteinträgerkonjugat mit dem

Antikörper inkubiert wird, gefogt von Inkubation mit einem enzymmarkierten Antikörper gegen den Antikörper.

7. Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,

daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper von Hybridom ATCC HB 8351 oder ein diesem funktionell äquivalenter monoklonaler Antikörper ist.

8. Verfahren zur Feststellung von Krebs in einem menschlichen Patienten,

gekennzeichnet durch

(a) Bestimmen der Menge eines nichtderivatisierten modifizierten Nukleosids, das normalerweise von Krebskranken in erhöhten Mengen ausgeschieden wird, in einer Probe nichtfraktinierten Urins des Patienten mittels quantitativen Immunoassays der Probe, und

(b) Vergleichen der in Sehritt (a) festgestellten Menge mit der Standardmenge des im Urin normaler Menschen vorhandenen nichtderivatisierten modifizierten Nukleosids.

9. Verfahren zur Überwachung des Krebszustands in einem menschlichen Krebspatienten,
gekennzeichnet durch

(a) Sammeln nichtfraktionierter Urinproben des Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten;

(b) Bestimmen der Mengen eines nichtderivatisierten modifizierten Nukleosids, das normalerweise von krebskranken menschlichen Patienten in erhöhten Mengen ausgeschieden wird, in den Proben mittels quantitativen Immunoassays.

10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,

daß das Assay ein Radioimmunoassay oder ein Enzymimmunoassay ist.

11. Radioimmunoassay-Analysesatz zur Bestimmung der Menge an N-[9-(ß-D-Ribofur.anosyl)purin-6-ylcarbamoyl"]-L-Threonin in einer Probe, bestehend in Kombination aus radiomarkiertem N- [?-{ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl|-L-Threonin und einem Anti-N-[9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoylJ-L-Threonin-Antikörper, dadurch gekennzeichnet,

daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper von Hybridom ATCC HB 8351 oder ein funktionelles Äquivalent desselben ist,

12. Immunoassay-Analysesatz zur Bestimmung der Menge an

N-JJ)-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-6-ylcarbamoyl]-L-Threonin in einer Probe,

dadurch gekennzeichnet, daß der Analysesatz in Kombination umfaßt:

(a) N- [.9-(ß-D-Ribof uranosyl)purin-6-ylcarbamoyl] -L-Threonin, an ein Trägerprotein konjugiert;

(b) monoklonalen Antikörper aus Hybridom ATCC HB 8351 oder ein funktionelles Äquivalent desselben; und

(c) einen enzymmarkierten Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper oder dessen funktionelles Äquivalent.

13. Monoklonaler Antikörper aus Hybridom ATCC HB 8351 und dessen funktionellen Äquivalenten.

14. Hybridom ATCC HB 8351.