KR20230015938A

KR20230015938A - 패혈증 증상 예측

Info

Publication number: KR20230015938A
Application number: KR1020227043818A
Authority: KR
Inventors: 헤르만 마셔
Original assignee: 팜-아날리트 레이버 게엠베하
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2021-05-05
Publication date: 2023-01-31
Also published as: MX2022014920A; WO2021239413A1; AU2021280962A1; IL298110A; JP2023527087A; US20230236206A1; EP4158350A1

Abstract

대상체에서 패혈증 증상을 예측하는 방법으로서,
a. 상기 대상체의 샘플에서 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계로서, 상기 바이오마커는 하기 구조식 (I) 또는 이의 염인, 단계; 및
b. 상기 레벨을 바이오마커의 미리 결정된 기준 값과 비교하는 단계를 포함하고,
상승된 바이오마커 레벨은 패혈증 증상의 위험을 나타내는, 방법:

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Description

패혈증 증상 예측

본 발명은 바이오마커의 측정을 포함하는 대상체에서 패혈증 증상을 예측하는 방법에 관한 것이다.

패혈증은 감염에 대한 숙주의 반응 조절이상으로 인해 유발되는 생명을 위협하는 장기 기능장애로 정의된다. 가장 최근의 추정치에 따르면, 패혈증 사례는 전 세계적으로 약 4,900만 건으로 추산되고, 패혈증-관련 사망은 약 1,100만 건으로 추산된다. 패혈증의 최근 정의로는 패혈증은 다음 2 단계로 인식된다: 패혈증 및 패혈성 쇼크. 패혈증과 이의 진행을 예측하는 것은 어려운 일이며, 생명을 위협하는 장기 기능장애와 그에 따른 사망을 예방하기 위하여 각각의 치료를 위한 진단이 너무 늦게 이루어지는 경우가 빈번하다. 고위험 집단, 예를 들어, 입원 환자, 특히 ICU 환자에서, 환자의 패혈증 발달(development) 가능성을 조기에 정확하게 식별하는 것은 상당한 임상적 가치가 있다. 반대로, 패혈증 발달을 배제하는 것은 항생제 보류(2차 항생제-내성 감염의 발병을 피하기 위해), 그리고 추가적인 패혈증-관련 조사 수행의 측면에서 동등한 중요성이 있다.

최근의 진단 방법은 전신 염증 반응 증후군(SIRS)과 패혈증을 구별하는 것을 목적으로 한다. 프로칼시토닌(PCT)은 세균 감염을 진단하고 비-전염성 SIRS-유사 증상과 구별하는 데 사용되는 일반적인 바이오마커이다. 그러나, 질환의 중증도에 대한 정확한 척도는 아직 개발되지 못했고, APACHE, SAPS 및 SOFA와 같은 임상 점수에만 의존하고 있다. 박테리아 감염의 가능성을 나타내는 PCT의 컷오프 레벨은 임상에서의 적용과 관련하여 논란의 여지가 있고 모호하다. 현재 관행에 따르면, 임상 ICU는 다양한 PCT 컷오프를 이용하고 있으며; 혈장 중 0.25 ng/mL, 0.5 ng/mL 또는 1.0 ng/mL가 항생제 개입을 시작하고 감염을 제어(rule in)/배제(rule out)하기 위한 임계치(threshold)로 이용된다. 다양한 컷오프가 민감도와 특이도 사이의 절충안이 되며; 예를 들어, 패혈증을 진단하기 위해 더 낮은 컷오프로 PCT를 이용하는 것은 위양성(PCT 상승에도 불구하고 세균 감염 없음)의 상당한 위험을 수반하며, 특히 다중 외상, 심한 화상, 대수술, 말라리아 환자 및 신생아(적어도 생후 4일까지)의 경우 그렇다.

WO84/04168A1에는 인간의 암을 진단하기 위한 방법 및 테스트 키트가 개시되어 있다. 예시적인 테스트 키트는 N-[9-(β-D-리보푸라노실)퓨린-6-일카바모일]-L-트레오닌을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 포함한다.

Ludwig 등(Molecular Biosystems 2017, 13(4): 648-664)은 패혈증의 바이오마커를 발견하기 위한 질량 분광계(spectrometry) 방법을 설명한다.

WO2004/044554A2에는 바이오마커 프로파일을 이용한 패혈증 또는 SIRS의 진단이 개시되어 있다.

패혈증의 조기 진단(특히 패혈증 발달 위험이 높은 환자에서)과 항생제 치료 지침(시작 및 중단 모두), 감염성 질환을 앓고 있고 하나 이상의 항미생물제로 치료를 받는 환자의 계층화 및/또는 모니터링을 위해 신뢰할 수 있는 진단 테스트를 제공하는 것이 중요할 수 있다.

발명의 요약

특히, 위험 집단의 환자, 예컨대 감염성 질환을 앓고 있고 기존 동반질환(comorbidities)이 있는 환자에서 패혈증 및/또는 패혈증 질환의 발증(onset)을 결정하기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이 목적이다.

상기 목적은 본 명세서에 추가로 기술된 것과 같이 본 청구범위의 발명객체에 의해 해결된다.

본 발명은, 대상체에서 패혈증 증상을 예측하는 방법으로서:

a. 상기 대상체의 샘플에서 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계로서, 상기 바이오마커는 본 명세서에 추가로 기재된 것과 같이 구조 (I)의 것 또는 이의 염인, 단계; 및

b. 상기 레벨을 바이오마커의 미리 결정된 참조 값과 비교하는 단계를 포함하며,

여기서 상승된 바이오마커 레벨은 패혈증 증상의 위험을 나타내는, 패혈증 증상을 예측하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 바이오마커는 샘플에서 내인성 또는 자연적으로 생성되는 소분자 화합물이다. 구조 (I)의 바이오마커 또는 이의 염은 샘플에서 결정되는, 광학 이성질체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 라세미체 중 임의의 각각(하나 이상, 예를 들어, 전부)일 수 있다.

구체적으로, 기준 레벨은 상기 위험에 처하지 않은 대상체 또는 대상체 그룹에서의 바이오마커의 레벨, 또는 패혈증 증상을 나타내는 임계치 레벨이다.

기준 레벨은 알려진 질환 또는 질환 위험이 있는 환자의 샘플에 대해 본 방법을 보정하여 얻은 값일 수 있다.

구체적으로, 본 명세서에 기재된 방법은 샘플 내 바이오마커 레벨이 기준 또는 임계치 레벨보다 높은지 여부를 결정하는 것과 같은 정량적 또는 반-정량적 방법일 수 있다.

임계치 레벨(컷-오프 레벨이라고도 함)은 건강한 대상체와 질환 발달 위험이 더 높은 대상체, 질환 발증 시점에 있거나 또는 이미 질환을 앓고 있는 대상체를 구분할 수 있다.

구체적으로, 본 명세서에 기재된 방법은 특히 항생제 치료에 있어서, 치료 지침, 계층화 및/또는 제어에 사용된다. 이를 위해, 본 명세서에 기재된 방법은 대상체가 상기 위험에 처해 있는지 여부에 기초하여, 요법을 특별히 적용, 유지, 감소, 상승 또는 적용하지 않는 것을 추가로 포함한다.

구체적으로, 패혈증 증상은 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 패혈성 쇼크 및 다발성 장기 기능장애 증후군(MODS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 패혈증 질환이다.

특정의 양태에 따르면, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 패혈증 증상을 앓지 않는 대상체에서 바이오마커를 결정하는 데 사용되며, 이러한 패혈증 증상의 발증은 샘플 내 바이오마커의 레벨에 기초하여 예측된다.

패혈증인 것으로 이해되는 특정 패혈증 증상은, 예를 들어, 패혈증(다른 출처 및 다른 기원으로부터 유래), 패혈성 쇼크 및 다발성 장기 기능장애 증후군(MODS; Singer 등(2016)의 새로운 패혈증(Sepsis)-3 정의 하의 잠재적 구성요소로서)로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 하나 이상의 패혈증 질환을 포함한다.

구체적으로, 대상체는 감염된 환자, 즉 감염 진단을 받았거나 감염 가능성이 있거나 감염이 확인된 환자이다.

특정의 실시형태에서, 패혈증 증상의 위험은 바이오마커 레벨이 이러한 감염을 앓지 않거나, 또는 이러한 패혈증 증상이 발달하지 않는 환자 집단에서 일반적으로 발견되는 미리 결정된 기준 레벨에 비해 더 높은 경우, 감염된 환자에서 나타난다.

특정 분석에서 정상 레벨에 비해 더 높은 미리 결정된 기준 레벨은, 예를 들어, 정상 레벨을 측정하는 표준 편차에 비해 적어도 2배, 3배, 4배, 또는 5배 더 높은 레벨일 수 있다.

예를 들어, 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플에서 미리 결정된 기준 레벨은 약 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40ng BM1/mL와 같은 약 15 내지 40ng BM1/mL의 임계치일 수 있다.

이러한 임계치보다 유의하게 높은(또는 적어도 표준 편차보다 높은) 값은 패혈증 증상의 위험을 나타낼 수 있다. 특정 BM1 테스트를 사용하고 패혈증을 앓고 있는 인간 환자 대 심부전을 앓고 있는 대조군을 비교하는 본 실시예는 혈장 또는 혈청의 약 32 ng BM1/mL의 임계치를 확립한다(실시예 4, 매트릭스: 민감도/특이성).

인간 신생아의 혈장 또는 혈청 샘플에서 미리 결정된 기준 레벨은 약 80 내지 120 ng BM1/mL일 수 있다. 패혈성 인간 신생아는 혈장 또는 혈청에서 최대 300 ng/mL의 상승된 수치를 나타낼 수 있다.

송아지, 라마, 알파카, 염소, 또는 소의 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플에서 미리 결정된 기준 레벨은 약 10 내지 30 ng/mL이며, 일부 패혈성 송아지(calves)는 BM1에 대해 약 40 내지 80 ng/mL의 농도 레벨을 나타냈다.

인간 활액의 미리 결정된 기준 레벨은 약 15 내지 40 ng BM1/mL일 수 있으며, 일부 패혈성 인간은 BM1에 대해 약 40 내지 160 ng/mL의 농도 레벨을 나타냈다.

인간 소변의 사전 결정된 기준 레벨은 약 2500 내지 4500 ng BM1/mg 크레아티닌의 임계치가 될 수 있다.

패혈성 인간 환자는 일반적으로 약 5000 내지 16000 ng BM1/mg 크레아티닌의 상승된 레벨을 나타낸다.

바이오마커 레벨이, 패혈증을 나타내는 기준 레벨에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 중 적어도 어느 하나인 경우 패혈성 쇼크의 사례가 특별히 표시된다.

본 발명은 패혈증 증상을 앓지 않는 대상체에서 패혈증 증상을 예측하는 방법으로서:

a. 상기 대상체의 샘플에서 소분자 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계,

여기서 상승된 바이오마커 레벨은 패혈증 증상 개시의 위험을 나타내는, 패혈증 증상을 모니터링하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은, 패혈증 증상을 앓지 않는 대상체에서 패혈증 증상을 모니터링하는 방법으로서:

a. 제1 시점에서 대상체의 샘플에서 소분자 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계,

b. 이후 제2 시점에서 동일한 대상체의 샘플에서 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 포함하며,

여기서 상기 제1 시점과 제2 시점 사이의 상기 바이오마커 레벨의 증가는 패혈증 증상 개시를 나타내는, 패혈증 증상을 모니터링하는 방법을 추가로 제공한다.

구체적으로, 바이오마커 레벨이 대상체에 대해 예상되는 것보다 높은 경우 패혈증 증상 개시의 위험이 표시된다. 특히, 대상체가 감염된 환자인 경우, 샘플의 바이오마커 레벨이 세균 감염을 앓지 않거나, 또는 그러한 패혈증 증상이 발달하지 않은 환자 집단에서 일반적으로 발견되는 미리 결정된 기준 레벨보다 높으면, 패혈증 증상의 개시가 표시되거나 예측된다. 이러한 미리 결정된 기준 레벨은 본 명세서에서 추가로 설명되는 것과 같이 이용될 수 있다.

일반적으로, 테스트 샘플의 바이오마커 레벨이 높을수록, 질환의 빠른 개시, 또는 질환 진행에 대한 가능성이 높아진다.

구체적으로, 바이오마커는 본 명세서에 추가로 기재된 것과 같이 바람직하게는 구조 (I)의 것 또는 이의 염의 대상체로부터 유래하는 샘플에 내인성인 소분자 바이오마커이다.

구체적으로, 본 명세서에 기재된 바이오마커는 구조 (I)의 것 또는 이의 염이고, 구조 (I)의 이성질체(입체이성질체) 중 임의의 하나 이상(또는 모두) 또는 이의 염, 또는 이러한 이성질체, 예를 들어, 광학 이성질체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 또는 라세미체 중 하나 이상의 혼합물일 수 있으며, 각각은 구조 (I) 또는 이의 염인 것을 특징으로 한다. 특정 예에 따르면, 바이오마커의 모든 구조적 형태가 결정되고 각각의 바이오마커 레벨은 구조 (I)의 화합물 또는 이의 염의 총 농도를 나타낸다.

구체적으로, 바이오마커는 면역분석법, 크로마토그래피, 바람직하게는 HPLC 크로마토그래피, UPLC 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피(GC) 또는 박층 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 질량 분광계 분석 또는 NMR 분광법으로 이루어진 군으로부터 선택된 분석 방법을 적용하여 결정된다.

구체적으로, 분석 방법은 UV, 형광, MS 또는 MS/MS 검출, 또는 표지, 바람직하게는 효소 표지, 형광 표지, 또는 방사성동위원소 표지의 검출을 사용한다.

구체적으로, 질량 분광계 분석은 SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF 및 ESI-Q-TOF로 구성된 군으로부터 선택된다.

구체적으로, 면역분석법은 ELISA(예를 들어, 샌드위치 ELISA)와 같은 효소적 면역분석법, 측면 유동 면역크로마토그래피 분석법, 형광 면역분석법, 방사성 면역분석법, 및 자기 면역분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

구체적으로, 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 가래, 활액 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 체액과 같은, 생물학적 시료이다.

구체적으로, 샘플은, 예를 들어, 단백질 침전으로, 또는 희석으로, 세포 분리, 단백질 제거와 같은, 샘플을 정제하기 위해 또는 임의의 간섭 물질을 분리하기 위해 하나 이상의 적절한 기술에 의해 테스트 전에 준비된다.

소변 샘플은 테스트 전에 희석할 수 있으며, 예를 들어, 1:20 또는 1:50으로 희석된다.

혈청 또는 혈장 샘플은 테스트 전에 단백질을 침전시키기 위해 처리될 수 있다.

혈액 샘플은 테스트 전에 단백질을 침전시키기 위해 처리될 수 있다.

HPLC-MS/MS 측정을 위해, 혈청(또는 혈장 또는 혈액) 단백질은, 예를 들어, 아세토니트릴을 이용하여 침전에 의해 제거될 수 있다. 원심분리하여 투명한 상청액에서 침전물을 분리한 후, 상청액의 일부를 HPLC-MS/MS 결정에 이용할 수 있다.

샘플은 서로 다른 시점에서, 예를 들어, 병원 투여 시 또는 감염의 임상 증상(들)이 개시될 때 수집될 수 있고, 분석하기 전에, 예를 들어, 실온에서, 또는 냉동 상태로 신선하게 사용하거나 보관된다.

구체적으로, 샘플은, 적어도 적어도 하나 또는 두가지 패혈증 초기 증상, 감염된 환자에서 확인되는 적어도 하나 또는 두개의 qSOFA 포인트가 나타난 후 48시간 이내에, 바람직하게는 24시간 이내에, 보다 바람직하게는 6시간 이내에 상기 대상체로부터 분리된다.

구체적으로, 대상체는 인간 또는 비인간 동물 대상체, 특히 척추동물, 바람직하게는 개, 말, 낙타, 소, 고양이, 토끼, 돼지 또는 래트이다.

특정의 실시형태에 따르면, 대상체는 패혈증 또는 패혈성 쇼크가 발달할 위험이 높은 환자 그룹, 특히 입원 환자인 인간 환자이다. 구체적으로, 인간 환자는 성인, 아동, 유아 또는 신생아이다.

특정의 실시형태에 따르면, 대상체는 인간이 아닌 동물, 예를 들어, 동물 모델에서 사용되는 것과 같이, 질환 치료의 실험적 방법에 사용되는 동물이다.

본 바이오마커는 모니터링 또는 감시를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커는 의사가 질환의 진행을 예측하거나 모니터링하는 것을 지원하는 감시 목적을 위해 이용될 수 있다.

본 발명은, 대상체에서 패혈증 질환을 모니터링하는 방법으로서:

a. 제1 시점에서 대상체의 샘플에서 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계로서, 상기 바이오마커는 본 명세서에 추가로 기재된 것과 같은 구조 (I)의 것 또는 이의 염인, 단계; 및

b. 이후 제2 시점에서 동일한 대상체의 샘플에서 상기 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계룰 포함하며,

여기서 상기 제1 시점과 제2 시점 사이의 상기 바이오마커 레벨의 증가는 패혈증 질환 진행을 나타내거나, 임의의 후속 패혈증 발달 위험이 더 높다는 것을 나타내는, 패혈증 질환을 모니터링하는 방법을 추가로 제공한다.

구체적으로, 이러한 방법에서, 샘플은 통상적인 수단에 의해 저위험 환자로 식별된 감염성 질환 환자이고, 바이오마커의 레벨의 증가는 더 심각한 패혈증 증상, 또는 패혈증으로 발달할 위험을 나타내거나, 또는 예를 들어, 짧은 시간단위(timeframe), 예를 들어, 특히 환자가 그러한 질환 진행을 예방하기 위해 적절하게 치료받지 않는다면, 첫 번째 또는 두 번째 샘플채취 후 수시간 이내 또는 1, 2, 3 또는 4일 이내에 예상되는 후속 패혈증 사건에 대한 지표가 된다.

본 발명은, 패혈증 증상에 대해 대상체에게 적용되는 적어도 하나의 치료의 유효성을 모니터링하는 방법으로서:

b. 이후 제2 시점에서 동일한 대상체의 샘플에서 상기 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 포함하며,

여기서 상기 제1 시점과 제2 시점 사이의 상기 바이오마커 레벨의 감소는 치료 성공을 나타내거나, 또는 임의의 후속 패혈증 발달 위험이 낮다는 것을 나타내는, 방법을 추가로 제공한다.

구체적으로, 이러한 방법에서, 샘플은 통상적인 수단에 의해 고위험 환자 또는 패혈증 환자로 식별된 감염성 질환 환자이고, 바이오마커 레벨의 감소는 덜 심각한 패혈증 증상의 위험, 또는 패혈증 질환 또는 증상의 개선을 나타내거나, 또는 예를 들어, 짧은 시간단위, 예를 들어, 특히 치료가 지속되면, 첫번째 또는 두번째 샘플채취 후 수시간 이내 또는 1, 2, 3 또는 4일 이내에 예상되는 패혈증 질환 또는 증상의 후속 치유(cure)에 대한 지표가 된다.

구체적으로, 치료는, 예를 들어, 정맥 항생제, 경구 항생제 또는 국소 항생제에 의한, 항생제 치료와 같은 의학적 치료이다.

특히, 첫 번째와 두 번째 샘플은 동일한 유형, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 가래, 윤활액 및 타액 중 하나이다.

구체적으로, 두 번째 샘플은 첫 번째 샘플 후 수시간 이내 또는 1, 2, 3 또는 4일 이내와 같은 나중 시점에 대상체로부터 채취된다.

구체적으로, 본 명세서에 기재된 방법은 선택적으로 단백질 침전 또는 단백질 제거 전에 샘플에 첨가되는 내부 표준을 사용할 수 있다.

구체적으로, 샘플의 분취액(aliquot)에 내부 표준 화합물을 스파이킹하고, 바이오마커의 레벨을 내부 표준 화합물의 레벨과 비교하여 바이오마커의 양을 결정한다.

이러한 내부 표준은 동일한 샘플에서 바이오마커와 나란히 결정되는 것이 바람직하고, 바이오마커와 구별되어 상이한 검출 신호를 생성할 수 있다. 이러한 내부 표준은, 분석이 적절하게 수행되었는지 여부를 결정하기 위한 양성 대조군 역할을 할 수 있다. 내부 표준은 또한, 예를 들어, 미리 결정된 양의 내부 표준의 검출 신호와 샘플 내 바이오마커의 검출 신호를 비교함으로써, 샘플에서 바이오마커의 양을 추정하거나 결정하기 위한 참조 역할을 할 수 있다.

구체적으로, 내부 표준 화합물은 바이오마커, 또는 표지된 바이오마커의 특정 입체이성질체 또는 유도체이며, 본 방법은 샘플에 포함된 내인성 바이오마커와 이러한 내부 표준을 구별한다.

구체적으로, 내부 표준 화합물은, 예를 들어, HPLC-MS 또는 HPLC-MS/MS 분석에 적합한 동위원소 표지를 포함하는 바이오마커이다. 바람직하게는, 내부 표준 화합물은, 특히 구조 (I)에서 각각의 원자 중 하나 이상을 치환하는, C¹³, D, N¹⁵, O¹⁷ 또는 O¹⁸, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 무거운 안정한 동위원소를 포함한다. 예를 들어, C¹³은 C¹²를 대체할 수 있고, D는 H를 대체할 수 있으며, N¹⁵는 N¹⁴를 대체할 수 있고, O¹⁷ 또는 O¹⁸은 O¹⁶을 대체할 수 있다.

본 발명은 추가로, 패혈증 증상을 결정하는 방법에 있어서, 본 명세서에 추가로 기재된 것과 같은 구조 (I)의 바이오마커 또는 이의 염을 특이적으로 인식하는 면역물질(immunoagent)을 포함하는 진단 제제(preparation)의 용도를 제공하며, 여기서 진단 제제는 검출가능한 표지인 진단 시약 또는 면역물질 및/또는 바이오마커에 결합하는 면역물질의 반응 생성물과 특이적으로 반응하는 시약을 추가로 포함한다. 예를 들어, 표지는 효소 표지, 형광 표지 또는 방사성 동위원소 표지 또는 태그일 수 있으며, 이것은 면역물질와 분석물 사이의 면역 반응을 나타낸다.

구체적으로, 진단 제제는 조성물 또는 부품 키트로 제공되며, 선택적으로 면역물질 또는 진단 시약 중 적어도 하나를 고정시키기 위한 고체 지지체를 추가로 포함한다.

본 발명은 추가로 본 명세서에 추가로 기술되고 검출가능한 표지를 포함하는 구조 (I)의 것 또는 이의 염의 패혈증 증상을 결정하기 위한 바이오마커를 특이적으로 인식하는 면역물질의 용도를 제공한다.

구체적으로, 본 명세서에 기재된 바이오마커는 시험관내(in vitro) 방법에 의해, 예를 들어, 생체외(ex vivo) 환자의 생물학적 샘플에서, 간편하게 결정되는 패혈증 증상의 시험관내(in vitro) 마커로서 사용된다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에서, 본 명세서에 기재된 것과 같은 진단 제제, 면역물질, 또는 표지된 화합물의 시험관내(in vitro) 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 질환의 바이오마커로서, 본 명세서에 추가로 기재된 것과 같은, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염의 새로운 용도를 추가로 제공한다.

도 1: 건강한 인간의 혈장 샘플에서 측정된 BM1 피크를 보여주는 크로마토그램.
도 2: 패혈증 환자의 혈장 샘플에서 측정된 BM1 피크를 보여주는 크로마토그램
도 3은, 실시예 4의, ROC 곡선 아래 면적를 나타낸다.

다르게 나타내거나 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 용어는 당업계에서 통상적인 의미를 가지며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 구체적인 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다.

달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 "약(about)"이라는 용어는 같은 값이거나 주어진 값의 +/- 20%까지 차이가 나는 값을 의미한다.

보다 간결한 설명을 제공하기 위해, 본 명세서에 제공된 정량적 표현 중 일부는 "약"이라는 용어로 한정되지 않는다. 용어 "약"이 명시적으로 사용되었는지 여부에 관계없이, 본 명세서에 제공된 모든 양은 실제 주어진 값을 지칭하는 것을 의미하고, 또한 이러한 주어진 값에 대한 실험 및/또는 측정 조건으로 인한 근사치를 포함하여, 해당 분야의 통상적인 기술에 기초하여 합리적으로 추론될 수 있는 주어진 값에 대한 근사치를 지칭하는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "포함하다(comprise)", "함유하다(contain)", "가지다(have)" 및 "포함하다(include)"는 동의어로 사용될 수 있으며 추가 구성원(members) 또는 부분(parts) 또는 요소(elements)를 허용하는 개방형 정의로 이해되어야 한다. "이루어진(consiting)"은 구성 정의 특징의 추가 요소가 없는 최근접 정의로 간주된다. 따라서 "포함하는(comprising)"은 더 광범위하며 "이루어지는(consisting)" 정의를 포함한다.

본 발명은 고위험 환자와 같은, 대상체에서 패혈증 증상 또는 패혈증-관련 합병증의 후속 발달의 진단, 예후, 예측, 위험 평가 및/또는 위험 계층화를 위한 방법 및 수단을 제공한다. 구체적으로, 바이오마커 레벨은 패혈증 증상의 후속 발달 가능성과 상관관계가 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "위험에 처해 있는(at risk of)"은 다음과 같은 방식으로 이해된다.

패혈증 증상의 위험은, 특히 감염성 질환으로 진단받았지만 아직 패혈증 증상을 보이지 않는 환자를 포함하는 위험 집단 또는 그룹에 속하는 대상체, 및/또는 감염 위험이 더 높은 그러한 대상체, 특히 입원 환자 및 기존 동반질환이 있는 환자, 외상 환자 및 면역 체계가 오작동하는 환자에서, 본 명세서에서 기재된 방법을 이용하는 테스트 후 수시간 이내 또는 1, 2, 3 또는 4일 이내와 같은 짧은 시간단위 내에 패혈증 증상 또는 이러한 패혈증 증상의 발생 가능성이 상승된 것으로 이해된다.

구체적으로, 패혈증 증상의 발생 가능성은 샘플 내 바이오마커 레벨과 기준 레벨을 비교하여 평가할 수 있다.

"질환의 발증(onset of disease)"라는 용어는 본 명세서에서 대상체가 진단을 야기하는 질환 증상이 발달되는 시점으로 이해된다. 질환의 발증를 예측함으로써, 심지어 질환이 공식적으로 진단되기 전에도 대상체가 각각의 치료를 받을 수 있도록, 훈련된 사람에게 해당 질환에 걸릴 가능성이 높은 대상체를 식별할 수 있는 능력을 제공하는 위험 결정(risk determination)을 제공한다. 질환 발증는 구체적으로 패혈증 증상의 발달에 직접적으로 기인하는 징후 및/또는 증상의 첫 출현이다.

본 발명은 소분자 바이오마커를 이용하여 질환의 발증 또는 질환 진행을 예측할 수 있게 한다. 소분자 바이오마커는 특히 생물학적 과정에서 생성되는 세포 대사산물인 저분자량(< 900 달톤)의 유기 화합물로 이해된다. 특히, 구조 (I)의 바이오마커 또는 전술한 것들 중 어느 하나의 염.

특정한 경우에, 증상은 패혈증이고 대상체가 감염성 질환을 앓을 수 있지만, 대상체는 적어도 2가지의 패혈증 초기 증상을 나타내지 않거나, 패혈증을 앓고 있지 않다: 그러나, 이러한 대상체는 한 가지의 패혈증 초기 증상만 나타낼 수 있고/거나 패혈증 발달 위험이 있을 수 있다. 그러한 경우, 대상체가 명백한 패혈증 증상을 나타내기 전에 채취한 대상체 샘플의 바이오마커 레벨은 패혈증 또는 패혈성 쇼크 발달의 상승된 위험을 나타낼 수 있으며, 패혈증 발달을 예방하고/하거나 패혈증 진행을 중단시키기 위해 초기 치료가 권장될 수 있다.

· (38℃) 이상의 열 또는 36℃ 미만의 온도

· 분당 대략 90회보다 높은 안정시 심박수

· 분당 20회보다 높은 호흡률

· 창백한/얼룩덜룩한(mottled) 피부

· 오락가락하는(altered) 정신

이러한 각각의 증상은, 특히 고위험군 환자 그룹에서 발견되는 경우, 패혈증의 위험을 나타낼 수 있다. 고위험 환자는 일반적으로 특히 입원 환자에서 더 높은 감염 위험을 나타낸다. "위험 집단(risk population)"으로도 이해되는 고위험 환자 그룹에는, 예를 들어, 다음이 있다:

· 생검 및/또는 수술을 받은 사람;

· 외상/사고를 당한 사람;

· 기존 질환(예를 들어, 당뇨병, 심혈관 기능부전)이 있는 사람

· 어린이(< 1세) 및 노인(> 65세);

· HIV에 걸린 사람 또는 암에 대한 화학요법 치료를 받는 사람과 같이, 면역 체계가 약한 사람;

· 어떤 이유로든 중환자실(ICU)에서 치료를 받고 있는 사람;

· 정맥 카테터 또는 호흡관과 같은, 침습적 디바이스에 노출된 사람.

대상체에서 다음 징후 중 하나 이상이 발견되는 경우 진행된 패혈증 증상이 나타난다:

· 변색된 피부 패치

· 배뇨 감소

· 정신 능력의 변화

· 낮은 혈소판(혈액 응고 세포) 수

· 호흡 곤란

· 비정상적인 심장 기능

· 체온 저하로 인한 오한

· 무의식

· 극도의 쇠약

Quick SOFA 점수(quickSOFA 또는 qSOFA)는 의료 서비스 제공자가 패혈증으로 인한 이환율 및 사망율 위험을 추정하는 데 도움이 되며 감염으로 인해 좋지 않은 결과를 보일 위험이 높은 환자를 식별하는 데 일반적으로 허용되는 방법이다.

qSOFA 점수 평가

저혈압(SBP ≤ 100 mmHg) 1

높은 호흡수(≥ 22 호흡/분) 1

오락가락하는 정신(GCS ≤ 14) 1

점수 범위는 0 내지 3점이다. 감염 시작 부근에 2개 이상의 qSOFA 포인트(및 기존의 0이 아닌 SOFA 레벨에서 2포인트 만큼의 변화)가 있으면 현저히 높은 사망 위험과 연관되거나 집중 치료실 체류가 연장된다. 이는 합병증이 없는 감염 환자보다 패혈증일 수 있는 감염 환자에서 더 흔한 결과이다. 이러한 발견에 기초하여, 패혈증에 대한 제3차 국제 합의 정의(The Third International Consensus Definitions for Sepsis)는 중환자실 외부에서 패혈증일 가능성이 있는 감염 환자를 식별하기 위한 간단한 신속조치(prompt)로 qSOFA를 권장한다.

Singer 등(The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3); JAMA. 2016; 315(8):801-10)에 따르면, 패혈증-3 정의는 다음과 같다:

· 패혈증은 감염에 대한 숙주 반응의 조절장애로 인해 발생하는 생명을 위협하는 장기 기능장애로 정의된다.

· 장기 기능장애는 감염으로 인한 총 SOFA 점수 ≥2점의 급격한 변화로 식별될 수 있다.

· 기본 SOFA 점수는 기존 장기 기능장애가 없는 것으로 알려진 환자의 경우 0으로 가정할 수 있다.

· ASOFA 점수 ≥2는 감염이 의심되는 일반 입원(hospital) 인구에서 대략 10%의 전반적인 사망율 위험을 반영한다. 약간의 기능장애가 있는 환자도 더 악화될 수 있으며, 이 증상의 심각성과, 아직 시행되지 않은 경우, 신속하고 적절한 개입의 필요성이 강조된다.

· 간단히 말해, 패혈증은 감염에 대한 신체의 반응이 자신의 조직과 장기를 손상시킬 때 발생하는 생명을 위협하는 증상이다.

· 장기간 ICU에 입원하거나 병원에서 사망할 가능성이 있는 감염 의심 환자는 병상에서 qSOFA, 정신 상태 변화, 수축기 혈압 ≥100 mmHg, 또는 호흡수 ≥22회/분으로 신속하게 식별할 수 있다.

· 패혈성 쇼크는 근본적인 순환계 및 세포/대사 이상이 심각하여 사망률을 크게 증가시키는 패혈증의 서브세트이다.

· 패혈성 쇼크 환자는 MAP ≥65 mmHg를 유지하기 위해 승압제를 필요로 하고 적절한 용량 소생술(volume resuscitation)에도 불구하고 혈청 락테이트 수치가 >2 mmol/L(18 mg/dL)인 저혈압이 지속되는 패혈증의 임상 컨스트럭트로 식별될 수 있다. 이러한 기준에 따라, 병원 사망률은 40%를 초과한다.

약어: MAP, 평균 동맥압(mean arterial pressure); qSOFA, 빠른(quick) SOFA; SOFA: 순차적 [패혈증-관련] 장기 부전 평가(Sequential [Sepsis-related] Organ Failure Assessment).

본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오마커(biomarker)"는 정상적인 생물학적 과정, 병원성 과정, 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가되는 생물학적 마커인 관심 분자를 지칭할 것이다. 본 명세서에서 언급되는 바이오마커는 소분자 유기 바이오마커, 특히 하나 이상의 이성질체를 포함하는 것과 같은, 화학식 (I)의 특정 입체적 형태를 갖는 분자를 포함하는, 화학식 (I)로 나타낸 구조를 갖는 분자 또는 이의 염이다.

구체적으로, 본 명세서에 기재된 바이오마커는 아래 나타낸 구조식(I) 또는 이의 염이다:

.

바이오마커는 BM1라고도 지칭되며, 화학식 (I)의 구조식 또는 이의 염인 것으로 이해된다. 예를 들어, BM1은 산 또는 이의 염, 예컨대, 생리학적 염, 예를 들어, 나트륨 염로 결정될 수 있다.

명칭: N6-카바모일트레오닐-D-아데노신;

다른 명칭: N6-(N-트레오닐카르보닐)아데노신,

N6-트레오닐카바모일아데노신,

N-{[(9-β-D-리보푸라노실-9H-푸린-6-일)아미노]카보닐}-L-트레오닌.

분자식: C₁₅H₂₀N₆O_8.

CAS 번호: 24719-82-2.

Deutsch et al. (J. Biol. Chem. 2012, 287:13666-13673); Miyauchi K et al. Nat Chem Biol. 2013 Feb;9(2):105-11.

바이오마커는 임의의 각각의 광학 이성질체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 라세미체, 특히 내인성 또는 자연-생성 화합물(들)로서 샘플에 포함될 수 있는 구조 (I)의 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 바이오마커는 하나 이상의 표지, 구체적으로 하나 이상의 질량 태그 또는 질량 표지를 포함할 수 있다. 본 문맥에서 사용되는 용어 표지는 결정을 위해 분석물을 표지화하기에 적합한 모이어티(moiety)을 지칭하는 것으로 의도된다. 표지라는 용어는 태그라는 용어와 동의어이다. 구체적으로, 질량 표지라는 용어는 질량 분광계에 의해 검출될 모이어티를 지칭하는 것으로 의도된다.

구체적으로, 본 명세서에 기재된 바이오마커는 비방사성 안정 동위원소인 동위원소 표지를 포함한다. 구체적으로, 상기 동위원소 표지는 C¹³, D, N¹⁵, O¹⁷ 또는 O¹⁸, 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 무거운 안정 동위원소일 수 있다.

구체적으로, 동위원소 표지를 포함하는 바이오마커는 내부 표준 화합물로 사용될 수 있다. 바람직한 내부 표준 화합물이 샘플에 추가될 수 있고 샘플 내의 표적 바이오마커와 분석적으로 구별될 수 있다.

구체적으로, 내부 표준 화합물은 동위원소체(isotopologue)일 수 있거나, 특히 구조식(I)에서 각각의 원자 중 하나 이상을 치환하는, C¹³, D, N¹⁵, O¹⁷ 또는 O¹⁸, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 무거운 안정 동위원소를 포함하는 구조식(I)의 화합물 또는 이의 염일 수 있다. 예를 들어, C¹³은 C¹²를 대체할 수 있고, D는 H를 대체할 수 있으며, N¹⁵는 N¹⁴를 대체할 수 있고, O¹⁷ 또는 O¹⁸은 O¹⁶을 대체할 수 있다.

정확한 결과를 생성하기 위해 적절한 내부 표준을 선택할 수 있다. 특히, MS 분석의 경우, 동위원소체는 종종 바이오마커의 체류 시간과 매우 밀접하게 일치할 수 있고, 바이오마커 신호의 통합을 방해하지 않을 수 있는, MS 검출기의 다른 질량 채널 상에서 신호를 생성할 수 있기 때문에 최선의 선택이 될 수 있다. 대안적으로, 바이오마커 구조의 구조적 이성질체를 사용하여 유사한 결과를 생성하거나, 동일하거나 매우 유사한 화학 분류에서 밀접하게 관련된 구조를 활용할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원치 않으면서, 내부 표준이 바이오마커 구조와 구조적으로 유사하면 할수록, 결과는 더 정확해 질 수 있다.

BM1의 예시적인 내부 표준은 다음 구조식(II)을 포함한다:

(예를 들어, 캐나다 소재의 Toronto Research Chemicals에서 입수 가능; 제품 번호: T405562).

화학명: N6-(N-트레오닐카르보닐)아데노신-13C4,15N.

CAS 번호: 1195030-28-4

분자식: C₁₁ ¹³C₄H₂₀N₅ ¹⁵NO₈.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "진단(diagnosis)"은 패혈증 증상와 관련된 대상체의 임상 상태의 인식 및 (조기) 검출에 관한 것이다. 또한, 패혈증 증상의 중증도 평가는 "진단"이라는 용어에 포함될 수 있다. "예후(prognosis)"는 대상체에 대한 결과 또는 특정 위험의 예측과 관련이 있다. 이것은 또한 상기 대상체에 대한 회복 가능성 또는 질환 진행 가능성의 추정을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 모니터링, 요법 모니터링, 요법 안내 및/또는 요법 제어를 위해 사용될 수 있다. "모니터링"은, 예를 들어, 치유 과정의 진행 또는 특정 치료 또는 요법이 환자의 건강 상태에 미치는 영향을 분석하기 위해 감염된 환자 또는 패혈증 환자와 같은 대상체와, 잠재적으로 발생하는 질환 진행 또는 합병증에 대해 추적하는 것과 관련이 있다.

예를 들어, 질환 증상, 질환 상태의 위험, 질환 진행, 또는 치료 성공과 같은 사건을 나타내는 것과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "나타내다(indicate)"는 본 명세서에서 위험 및/또는 가능성의 척도로서 이해된다. 바람직하게는, 사건의 존재 또는 부재의 "표시(indication)"는 위험 평가로서 의도되며, 일반적으로 상기 사건의 절대적 존재 또는 부재를 결정적으로 가리키는 것으로 제한하는 방식으로 해석되지 않아야 한다.

높은 또는 낮은 바이오마커 레벨의 결정은 본 명세서에 기재된 참조 값을 사용할 때 패혈증 또는 패혈증 증상의 위험의 존재 또는 부재를 결정하는 것과 관련하여 매우 신뢰할 수 있는 것으로 판명되었으며, 그래서 위험의 추정은 의료 전문가에 의한 적절한 조치를 가능하게 한다.

바이오마커의 레벨이 고위험 집단, 예를 들어, ICU 환자에서 패혈증 증상의 후속 발달의 존재 또는 부재의 가능성과 상관될 수 있다는 것은 완전히 예기치 못한 것이었다. 높은 레벨의 바이오마커는 높은 심각도 레벨을 나타내고 낮은 레벨은 낮은 심각도 레벨을 나타낸다. 각 심각도 레벨을 지정하는 데 사용할 수 있는 참조 값을 결정하는 각 농도는, 세균 감염 후 샘플 분리 시점, 패혈증 초기 증상의 유병률(prevalence), 및 상기 샘플에서 바이오마커 레벨을 결정하기 위해 사용된 방법과 같은 여러 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 샘플 분리 상황 및 해당 시점에 이용가능한 추가 정보, 예를 들어, 패혈증 증상, 패혈증 또는 특정 패혈증-관련 합병증이 발달할 위험 증가에 따라 환자의 예후/위험에 대한 보다 정확한 평가를 가능하게 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "면역물질(immunoagent)"은 항원과 특이적으로 결합하거나 면역반응하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자로 이해된다. 바람직한 면역물질은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 각각의 항체 단편이다. 특히, 바이오마커를 결정하기 위한 면역분석법에서는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체가 사용된다.

특정 면역물질은 표적 분자 또는 관심 분자, 즉 샘플로부터의 바이오마커와 같은 분석물에 결합하는 데 사용될 수 있는 분자로 이해되는, 포획 분자 또는 분자 스캐폴드일 수 있다. 이러한 분자는 표적 분자에 특이적으로 결합하기 위해 표면 전하, 소수성, 친수성, 루이스 공여체 및/또는 수용체의 존재 또는 부재와 같은, 표면 특징 측면에서 그리고 공간적으로 모두, 적절하게 형성된다. 이에 따라, 결합은, 예를 들어, 이온성, 반데르발스, 파이-파이, 시그마-파이, 소수성 또는 수소 결합 상호작용 또는 전술한 상호작용 중 둘 이상의 조합 또는 포획 분자 또는 분자 스캐폴드와 표적 분자 간의 공유 작용에 의해 매개될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자, 탄수화물 분자, PNA 분자, 단백질, 펩티드 및 당단백질, 예를 들어, 앱타머, DARpins(Designed Ankyrin Repeat Proteins), 아피머(Affimers) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

구체적으로, 면역물질은 표적 항원에 대한 이의 친화도가 바이오마커를 함유하는 샘플에 포함된 다른 분자에 대한 것보다 적어도 100배 또는 1000배 더 높은 경우, 본 명세서에 기재된 바이오마커와 같은 표적 항원을 특이적으로 인식하는 것으로 간주된다. 표적 항원을 인식하기 위해 주어진 특이성을 갖는 항체를 개발하고 선택하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

특정의 양태에 따르면, 면역분석법은 표지된 적어도 하나의 항체 및 고체상(solid phase)에 결합되거나 고체상에 선택적으로 결합될 수 있는 또 다른 항체를 사용할 수 있다. 제1 항체 및 제2 항체는 액체 반응 혼합물에 분산되어 존재할 수 있고, 제1 표지 성분이 제1 항체에 결합될 수 있고, 상기 표지 시스템의 제2 표지 성분이 제2 항체에 결합되어, 검출할 바이오마커에 대한 두 항체의 결합 후, 측정 용액에서 생성된 샌드위치 복합체의 검출을 허용하는 측정가능한 신호가 생성된다.

특정의 양태에 따르면, 본 명세서에 기재된 방법은, 하기 단계를 포함하는, 면역분석법으로서 수행될 수 있다:

a) 샘플을 바이오마커의 제1 에피토프에 특이적인 제1 항체 또는 이의 항원-결합, 및 바이오마커의 제2 에피토프에 특이적인 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및

b) 바이오마커에 대한 제1 및 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합을 검출하는 단계.

특히, 제1 항체 및 제2 항체는 액체 반응 혼합물에 분산되어 존재할 수 있으며, 여기서 제1 표지 성분이 제1 항체에 결합되고/거나 상기 표지 시스템의 제2 표지 성분이 제2 항체에 결합되어, 두 항체가 하나 이상의 바이오마커 또는 이의 단편에 결합한 후, 측정 용액에서 생성된 샌드위치 복합체의 검출을 허용하는 측정 가능한 신호가 생성된다.

특정한 경우에, 방법은 샌드위치 면역분석법으로 수행되며, 구체적으로 하나의 항체는 고체상, 예를 들어, 코팅된 테스트 튜브의 벽, 마이크로타이터 플레이트, 또는 자성 입자에 고정되고, 다른 항체는 검출가능한 표지 또는 표지에 대한 선택적 부착을 가능하게 하고 형성된 샌드위치 구조의 검출을 제공하는 수단을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 범위 내에서 "감염(infection)"은 병원성 또는 잠재적 병원성 물질/병원체(pathogens), 유기체 및/또는 미생물에 의한 정상적으로 멸균된 조직 또는 체액의 침입에 의해 야기되는 병리학적 과정을 의미하고, 특히 바람직하게는 세균, 바이러스, 곰팡이, 및/또는 기생충에 의한 감염(들)과 관련이 있다.

본 명세서에 기재된 바이오마커 및/또는 면역시약은 표지화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "표지(label)"는 "표지된(labelled)" 화합물을 생성하기 위해 또 다른 화합물에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 검출가능한 모이어티를 포함한다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성할 수 있다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는, 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.

본 명세서에 기재된 바이오마커 또는 면역시약은 검출가능한 신호를 제공하는 표지, 예를 들어, 방사성동위원소, 형광물질, 효소, 항체, 자성 입자와 같은 입자, 화학발광물질, 양자점, 또는 특이적 결합 분자 등에 직접적으로 또는 간접적으로 컨주게이션될 수 있다. 바람직한 표지는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 형광 표지, 표지 효소 및 방사성동위원소를 포함한다. 적합한 표지는, 예를 들어, 루시페린, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라사이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, CASCADE BLUE®, TEXAS RED®, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705 및 OREGON GREEN™와 같은, 형광 또는 화학발광 화합물을 포함한다.

적합한 표지는 또한 안정한 동위원소 표지(예를 들어, ²H(D와 동일), ¹³C, ¹⁵N 등), 방사성동위원소 표지라고도 하는 방사성 표지(예를 들어, ¹²⁵I, ³⁵S, ³²P, ¹⁸F, ¹⁴C, ³H 등), 특정 결합 분자(예를 들어, 비오틴, 스트렙타비딘, 디곡신 및 항디곡신 등), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제 또는 고추냉이 퍼옥시다아제와 같은, 효소를 포함하는 생물학적 표지, 및 기타 표지를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "질량 분광계(mass spectrometry)" 또는 "MS"는 화합물을 이들의 질량으로 식별하는 분석 기술을 의미한다. 샘플의 바이오마커 레벨을 질량으로 정량화하는 잘 알려진 기술이 있다.

일반적으로, MS는 질량 대 전하 비율과 기상 이온의 풍부도를 측정하여 샘플에 존재하는 화합물(예를 들어, 분자)의 양과 유형을 식별할 수 있다. MS는 화학 화합물을 이온화하여 하전된 분자 또는 분자 단편을 생성하고 이들의 질량 대 전하 비율을 측정한다. 분자 이온 및/또는 분자 단편은 실제로 특정 질량을 가진 하전된 이온이다. 분자 이온 및/또는 조각의 질량을 전하로 나눈 값을 "질량 대 전하비(mass-to-charge ratio)"(m/z)라고 한다. 양이온 모드에서 대부분의 분자 이온 및/또는 조각은 +1의 전하를 가지므로, 질량 대 전하 비율은 일반적으로 분자 이온 및/또는 조각의 분자량을 나타낸다. MS는 충돌 셀(MS/MS 모드 또는 MRM 모드라고 함)을 이용하여 분석된 각 화합물에 대한 질량 스펙트럼을 생성하며, 여기서 x축은 질량 대 전하 비율을 나타내고 y축은 검출된 각 단편에 대한 신호 강도(풍부도)를 나타낸다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 그리고 본 개시의 도움으로, 주어진 화합물에 의해 생성된 질량 스펙트럼 및 MS/MS 모드 또는 MRM 모드에서 이의 생성 이온 스펙트럼은 매번 본질적으로 동일하며, 화합물의 "지문(fingerprint)"으로 간주된다. 이 지문은 화합물을 식별하고 안정적이고 재현가능하게 정량화하는 데 사용할 수 있다.

질량 스펙트럼의 y축은 상대적 풍부도 축일 수 있다. 풍부도가 가장 큰 피크를 일반적으로 "기본 피크(base peak)"라고 하며, 상대적 풍부도 축을 만들기 위해, 기본 피크 강도를 100%로 설정하여, 전체 질량 스펙트럼을 기본 피크로 정규화한다. 일부 실시형태에서, 분자 이온 피크는 기본 피크일 수 있다. 그러한 실시형태에서, 전체 질량 스펙트럼은 분자 이온 피크에 대해 정규화될 수 있으며, 여기서 분자 이온 피크는 100% 상대적 풍부도를 나타낸다.

본 명세서에 기재된 방법의 특정의 실시형태에 따르면, 내부 표준이 대상체 또는 환자로부터의 샘플에 추가된다. 샘플에 대한 상기 내부 표준의 첨가에 의해, 즉 샘플의 스파이킹에 의해, 샘플 내의 내부 표준의 농도가 알려지고, 예를 들어, HPLC-질량 분석 크로마토그램에서, 내부 표준의, 피크 아래 영역, 즉 피크 영역을 결정함으로써, 예를 들어, 내부 표준 및/또는 본 명세서에 기재된 바이오마커의, 피크 영역과 물질의 농도 사이의 관계가, 예를 들어, 동위원소 표지를 포함하는 본 명세서에 기재된 바이오마커일 수 있는, 본 명세서에 기재된 바이오마커의 피크 면적과 내부 표준의 피크 면적의 비율을 계산함으로써, 결정될 수 있다.

특정 질량 분광계의 경우, 면역-농축 기술, 샘플 준비와 관련된 방법 및/또는 크로마토그래피 방법과 같은, MS 분석 전에 샘플은 처리될 수 있으며, 예를 들어, MS는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC)와 같은 액체 크로마토그래피(LC)와 결합될 수 있다.

선택적 샘플 준비 방법은 분해, 분획화, 샘플의 펩티드로의 분해, 고갈, 농축, 투석, 탈염, 알킬화, 펩티드 환원, 단백질 침전 및/또는 추출(액체/액체 및 고체상)을 위한 기술을 포함한다.

분석물의 선택적 검출은 탠덤 질량 분광계(MS/MS)로 수행될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "대상체(subject)" 또는 "개체(individual)" 또는 "환자(patient)"는 온혈 포유동물, 특히 인간을 지칭할 것이다.

구체적으로, 용어 "환자(patient)"는 포유동물, 구체적으로 인간, 치료를 받거나 특정 질환 또는 장애, 특히 본 명세서에 추가로 설명된 그러한 증상인 것으로 진단되거나 위험에 처한 대상체를 포함한다. 용어 "치료(treatment)"는 예방적 및 치료적 치료를 모두 포함하는 것을 의미한다.

구체적으로, 대상체는 임의의 질환 증상을 앓고 있고 패혈증이 발달할 위험이 있는 환자이다. 특히, 대상체는 이미 감염성 질환을 앓고 있는 것으로 진단되어 선택적으로 항생제 치료를 받고 있을 수 있다. 따라서 본 명세서에 기재된 방법은 패혈증 증상의 개시를 결정하고/하거나 패혈증 질환 또는 질환 진행을 예방하기 위해 개시된 항생제 치료의 성공을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 이러한 경우, 바이오마커 레벨은 항생제 치료의 성공 가능성을 나타내는 지표로 사용될 수 있다. 또한 항생제 치료가 효과가 있거나 환자의 건강 상태가 호전될 가능성이 높기 때문에, 항생제 치료를 지속할지 또는 변경해야 할지를 결정할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "기준 레벨(reference level)"은 다음과 같이 이해된다.

용어 "레벨(level)"은 본 명세서에서 바이오마커의 절대적 또는 상대적 양 또는 농도, 바이오마커의 존재 또는 부재, 바이오마커의 양 또는 농도의 범위, 바이오마커의 최소 및/또는 최대 양 또는 농도, 바이오마커의 평균 양 또는 농도, 및/또는 바이오마커의 중간 양 또는 농도로 이해된다. 특정 레벨은 농도를 나타내는 양의 값으로 제공되며, 구체적으로 중량/부피, w/v, 또는 샘플에서 바이오마커의 배수 변화로 표현된다.

구체적으로, 기준 레벨은 임계치이며, 질환의 각 위험 또는 중증도에 대한 바이오마커 농도를 나타내는 컷오프 값으로도 이해된다. 임계값을 결정하는 각각의 농도는 샘플 분리 시점 및 상기 샘플에서 바이오마커 레벨을 결정하기 위해 사용되는 분석 또는 검출과 같은 다수의 파라미터에 따라 달라진다.

상승되거나 "더 높은(higher)" 레벨은, 예를 들어, 참조에 비해 유의하게 더 높다. 본 명세서에서 사용되는 "유의한(significant)"이라는 용어는 표준 편차의 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배의 차이를 지칭할 수 있다. 표준, 훈련 데이터 또는 임계치에서 파생된 것과 같은, 특정 참조 값과 관련하여, 유의한 상승 또는 증가된 양은 특히 적어도 1.5배 더 많은 양, 바람직하게는 적어도 2배 또는 3배의 차이를 나타내는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "컷오프 값(cutoff value)"은 질환 또는 질환 증상을 앓고 있는 대상체를 질환 또는 질환 증상을 앓지 않는 환자 및/또는 대상체와 구별하고, 특히 특정(예를 들어, 고위험) 질환 또는 질환 진행에 있는 대상체와 질환 또는 질환 진행의 위험이 없는 환자 및/또는 대상체, 예를 들어, 건강한 대상체 또는 병원체에 의해 감염되지 않은 대상체를 구별하는 임계치 값을 의미한다.

여기에서 사용된 용어 "참조(reference)" 또는 "대조군(control)"은 이러한 진단 분석의 결과와 비교하여 관찰된 차이점 또는 유사점을 기반으로 합리적으로 결론을 도출할 수 있도록 하는 제제 또는 값일 수 있다. 적합한 값은, 예를 들어, 질환 또는 질환 진행의 심각한 증상이 나중에 발달되는 1명 이상의 환자의 생물학적 샘플로부터 얻은 것과 같은, 질환 또는 질환 진행에 대한 미리 결정된 레벨의 예측가능성이다. 이와 관련하여, 양성 예측치 또는 음성 예측치를 참조로 이용할 수 있다.

관련 기준 레벨은 잘 알려진 방법, 예를 들어, 질환에 걸린 환자의 샘플을 건강한 대상체 또는 그러한 질환을 앓지 않는 대상체와 비교하여 일상적으로 얻을 수 있는 광범위한 데이터를 기반으로 하여 결정될 수 있다. 이러한 참조는 집단 평균 레벨, 예를 들어, 평균 바이오마커 집단 값으로 이해되며, 그로 인해 패혈증 환자로 진단된 환자는 대조군 집단과 비교될 수 있으며, 여기서 대조군은 바람직하게는 10, 20, 30, 40, 50명 또는 그 이상의 대상체를 포함한다. 다양한 인구(백인, 아시아인, 아프리카인 등)의 혈장/혈청/혈액 내 비-질환자 농도 레벨은 인종마다 다를 수 있다.

바이오마커의 적절한 정상 기준 레벨은 하나 이상의 적절한 대상체에서 원하는 바이오마커의 레벨을 측정하여 결정할 수 있으며, 이러한 기준 레벨은 대상체의 특정 모집단에 맞춰질 수 있다(예를 들어, 기준 레벨은 연령-일치 또는 성별-일치일 수 있으며, 그리하여 특정 연령 또는 성별의 대상체로부터의 샘플 중의 바이오마커 레벨과 패혈증 증상, 표현형, 또는 특정 연령 또는 성별 그룹에서의 이의 결여에 대한 기준 레벨 사이에 비교가 이루어질 수 있다).

전형적으로, 질환 증상을 앓지 않는 환자의 샘플에서 질환 증상을 예측하기 위한 참조 값은 질환 진행을 예측하기 위한 참조 값보다 낮다. 후자는, 예를 들어, 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 또는 심지어 적어도 20배 증가될 수 있다.

기능 분석은 확립된 기술에 따라 기준 레벨 또는 컷오프로 사용하기 위해 통계적으로 유의한 값을 표시하는 데 사용할 수 있다. 실험실은 임상적으로 관련된 프로토콜에 따라 분석의 기능적 민감도를 독립적으로 확립할 수 있다.

"샘플(sample)" 또는 "생물학적 샘플(biological sample)" 또는 "검체(specimen)"라는 용어는 대상체로부터 분리된 생물학적 물질을 의미한다. 생물학적 샘플은 원하는 바이오마커를 검출하기에 적합한 임의의 생물학적 물질을 함유할 수 있고, 대상체로부터의 세포 및/또는 비-세포 물질을 포함할 수 있다. 샘플은, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 피부, 표피 조직, 지방 조직, 대동맥 조직, 간 조직, 소변, 피지, 세포 샘플, 가래, 활액 또는 타액과 같은 임의의 적합한 생물학적 조직 또는 유체로부터 분리될 수 있다.

본 바이오마커는 예측 마커, 예를 들어, 독립형 진단 마커로 또는 (예를 들어, 진단 조합 키트에서의) 추가 마커 결정과 같은 추가 진단 조치와 함께 사용될 수 있다.

특정 실시양태에 따르면, 본 명세서에 기재된 방법은 추가로 상기 환자로부터의 샘플에서 적어도 하나의 추가 바이오마커의 레벨을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 추가 바이오마커는 바람직하게는 프로칼시토닌(PCT) 또는 이의 단편(들) 및/또는 락테이트이다.

샘플에서 바이오마커를 검출하기 위한 특정 방법은 HPLC, UHPLC 또는 질량분광계(MS)(특히 UV 검출 또는 형광 검출과 조합)과 결합된 UPLC, 발광 면역분석(LIA), 방사면역분석(RIA), 화학발광- 및 형광-면역분석, 효소 면역분석(EIA), 효소-연관 면역분석(ELISA), 발광-기반 비드 어레이, 자기 비드 기반 어레이, 단백질 마이크로어레이 분석, 신속한 테스트 형식, 예를 들어, 면역크로마토그래피 스트립 테스트, 및 자동화 시스템 /분석기로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

특히, 샌드위치 형식을 사용할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 바인더(예를 들어, 이들 중에서 바이오마커를 특이적으로 인식하는 면역물질)는 생물학적 샘플과 접촉하기 전에 기질에 컨주게이션된다. 하나 이상의 바인더는 검출 분자로 역할하도록 검출가능한 표지에 컨주게이션될 수 있다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 바인더는 검출가능한 표지에 컨주게이션된다. 이 구성에서, 하나 이상의 바인더는 생물학적 샘플과 접촉하기 전에 기질에 컨주게이션되어 포획물질로 역할을 할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바인더는 생물학적 샘플과 접촉하기 전에 기질에 컨주게이션될 수 있고/있거나 하나 이상의 바인더는 검출가능한 표지에 컨주게이션된다. 그러한 경우에, 하나 이상의 바인더는 포획물질 및 검출물질 중 하나 또는 둘 모두로서 역할할 수 있다.

특정의 양태에 따르면, 바람직하게는 전자 건강 기록(EHR)으로부터의 데이터를 이용하여 패혈증 증상 또는 패혈성 쇼크의 위험이 있는 입원 환자를 식별하기 위해, 머신 러닝 알고리즘이 분명한, 소프트웨어 시스템이 사용될 수 있다. 머신 러닝 접근방식은 환자의 EHR 데이터(예컨대, 실험실, 바이오마커 발현, 바이탈, 및 인구통계)를 이용하여 랜덤 포레스트 분류기에서 훈련할 수 있다. 머신 러닝은 단순한 규칙-기반 시스템과 달리, 명시적으로 프로그래밍하지 않고도 데이터의 복잡한 패턴을 학습할 수 있는 능력을 컴퓨터에 제공하는 인공 지능의 한 유형이다.

본 명세서에 추가로 기재된 것과 같은 진단 제제는 본 명세서에 기재된 것과 같은 바이오마커를 특이적으로 인식하는 면역물질 및, 검출가능한 표지 또는 면역물질 및/또는 바이오마커에 결합하는 면역물질의 반응 생성물과 특이적으로 반응하는 시약인, 추가 진단 시약을 포함할 수 있다.

진단 제제는 선택적으로 조성물 또는 부품 키트에 본 발명의 바이오마커를 특이적으로 인식하는 면역물질 및 추가 진단 시약을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "진단 키트(diagnostic kit)"라는 용어는 질환 또는 질환 증상을 판단하기 위해, 또는 질환, 특히 질환의 발병, 또는 질환 진행을 예측하기 위해 하나 이상의 분석물 또는 마커의 측정/검출을 수행하기 위해 조합 또는 혼합물로 사용될 수 있는 키트 또는 부품 세트를 의미한다. 특히, 키트는 적어도 검출 분자 및/또는 바인더(예를 들어, 면역물질)를 포함하고, 여기서 검출 분자 및/또는 바인더는 마커 또는 각각의 분석물, 또는 그러한 마커 또는 분석물의 반응 생성물을 특이적으로 인식한다. 또한, 다양한 시약이나 도구가 키트에 포함될 수 있다. 진단 키트는 바람직하게는, 선택적으로 분석을 수행할 때 편리하게 첨가될 수 있는 물, 버퍼 또는 부형제와 같은 일반적이거나 비특이적인 물질 또는 성분 없이 생물학적 샘플에서 바이오마커의 양을 결정하기 위한 모든 필수 성분을 포함한다. 진단 키트는 해당 방법을 수행하기 위한 임의의 유용한 시약을 포함할 수 있으며, 이에는 마이크로비드 또는 평면 어레이 또는 웰과 같은 기질, 바이오마커 분리를 위한 시약, 특정 표적에 대한 검출 분자, 검출가능한 표지, 용매, 버퍼, 링커, 다양한 분석 성분, 차단제 등이 포함된다.

키트에는 진단 방법에 사용하기 위한 지침(instructions)도 포함될 수 있다. 이러한 지침은, 예를 들어, 키트에 포함된 디바이스, 예를 들어, 마커를 결정하기 전에 세포 및/또는 단백질 함유 분획을 분리하는 것과 같이 진단 목적으로 생물학적 시료를 준비하기 위한 도구 또는 디바이스에 제공될 수 있다. 키트는 저장-수명이 적어도 6개월인 상업용 키트와 같이, 보관 안정성 형태(storage stable form)로 편리하게 제공될 수 있다. 보관 안정성 키트는 바람직하게는 적어도 6개월, 보다 바람직하게는 적어도 1년 또는 2년 동안 보관될 수 있다. 이는 건조(예를 들어, 동결건조) 성분으로 구성될 수 있고/있거나 방부제를 포함할 수 있다.

바람직한 진단 키트는 포장 또는 사전 포장 단위로 제공되며, 예를 들어, 성분은, 일상적인 실험을 용이하게 하는 단지 하나의 패키지로 포함되어 있다. 이러한 패키지는, 예를 들어, 일련의 생물학적 샘플에 대한 테스트를 수행하는 데 적합한, 1회 이상의 테스트에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 표지를 포함하는 바이오마커일 수 있는 표준 또는 참조 대조군으로서 바이오마커 제제를 추가로 적합하게 함유할 수 있다.

진단 조성물은 생물학적 샘플과의 반응 혼합물에서 즉시 사용할 수 있는 시약, 또는 이러한 시약의 보존된 형태, 예를 들어, 동결건조와 같은 보관 안정성 형태; 급속 냉동(예를 들어, 액체 질소에서), 초저온 보관(-70℃ 및 -80℃), 냉장 보관(-20℃ 및 5℃) 및 제어된 실내 온도(15℃-27℃); 표준 시료 보관, 예를 들어, 글리세롤 스톡, 조직 파라핀-블록, (협측) 면봉 및 보존된 형태의 시약을 재구성하거나 준비하여 바로 사용할 수 있는 시약을 얻을 수 있는 기타 표준 생물학적 샘플 보관 방법일 수 있다. 이러한 즉시 사용 가능한 시약은 일반적으로 수용액, 특히 (생리학적) 버퍼 조건(예를 들어, EDTA 버퍼링된, 포스페이트 버퍼, HBSS, 시트레이트 버퍼 등)의 형태이다.

진단 제제(특히 조성물 또는 진단 키트)에 포함된 추가 진단 시약은 면역물질 및/또는 바이오마커에 결합하는 면역물질의 반응 생성물과 특이적으로 반응하는 시약일 수 있다. 대상체에서 패혈증 증상을 진단하거나 모니터링하기 위한 면역분석을 수행하기 위해 적절한 진단 시약이 적절하게 사용된다. 적절한 진단 시약은 용매, 버퍼, 염료, 항응고제, 면역물질에 특이적으로 결합하는 리간드 및/또는 본 명세서에 기재된 바이오마커에 결합하는 면역물질의 반응 생성물일 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 선택적으로 표지가 있는 면역물질 및/또는 표지가 있는 추가의 진단 시약, 예컨대, 면역물질, 또는 면역물질 및 바이오마커의 면역 복합체를 특이적으로 인식하는 시약, 및/또는 면역물질 및 진단 시약 중 적어도 하나를 고정시키기 위한 고체상을 함유하는, 본 명세서에 기재된 바이오마커에 결합하는 면역물질의 진단 제제를 제공한다.

면역물질 또는 진단 시약은 직접 표지되거나 간접적으로 표지될 수 있다. 간접 표지는 면역물질 또는 진단 시약과 복합체를 형성하는 표지된 결합제(binding agent)를 포함할 수 있다.

바람직한 진단 제제 또는 분석법은, 예를 들어, 테스트할 샘플에서 바이오마커의 존재와 양을 테스트하기 위해, 고체상, 예를 들어, 라텍스 비드, 금 입자 등에 고정된 본 명세서에 기재된 바이오마커를 특이적으로 인식하는 면역물질을 포함한다.

본 발명은 이에 제한되지 않고 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.

실시예

실시예 1: 혈청, 혈장 및 소변에서 BM1을 검출하기 위한 재료 및 방법

본 발명의 구조 (I)의 바이오마커는 본 명세서에서 BM1이라고도 한다. 이 실시예에 따르면, BM1은, 예를 들어, 혈청 혈장이나 혈액으로부터 또는 소변 희석에 의한 아세토니트릴 또는 메탄올을 이용한 단백질 침전 후 역상 (RP)-컬럼 상에서의 HPLC-MS/MS로 검출되었다.

장비:

대상체의 샘플에서 BM1을 검출하기 위해, 다음과 같은 장비를 사용하였다.

[표 1]: 실시예에서 사용된 장비

장비/재료	타입/생산자
워크 스테이션 "XEVO1"
UPLC 펌프	ACQUITY I 클래스 플러스 바이너리 솔벤트 매니저	워터스 코퍼레이션, 미국
오토샘플러/샘플 매니저	ACQUITY I 클래스 플러스 샘플 매니저 FTN-I	워터스 코퍼레이션, 미국
샘플 오거나이저	ACQUITY 샘플 오거나이저	워터스 코퍼레이션, 미국
컬럼 오븐/컬럼 매니저	ACQUITY 컬럼 매니저	워터스 코퍼레이션, 미국
질량 분광계	XEVO TQ-XS	워터스 코퍼레이션, 미국

샘플 준비:

건강한 인간 대상체에서 BM1의 농도를 측정하기 위해, 혈청, 혈장 및 소변 샘플을 인간 또는 비인간 동물 대상체로부터 얻었다. 상기 샘플을 다음과 같이 준비하였다.

a) 샘플 준비 절차

[표 2]: 샘플 준비

단계	샘플 준비 절차 (단계별)
1	각 혈장/혈청/혈액 샘플 50㎕를 원추형 유리 샘플 바이알(부피 대략 5mL)로 옮김
1a	소변 샘플만 해당: 물 950㎕ 추가
1b	약 1분 동안 DVX-2500 멀티-튜브 볼텍서(2500 rpm)로 볼텍싱
1c	단계 1b의 희석된 샘플 50㎕를 원추형 유리 샘플 바이알(부피 대략 5 mL)로 옮김
2	내부 표준 작업 용액 20㎕ 추가(모든 매트릭스 혈장/혈청/혈액/소변에 대해 계속함)
3	단백질 침전을 위한 ACN 100㎕ 추가
4	약 1분 동안 DVX-2500 멀티-튜브 볼텍서(2500 rpm)로 볼텍싱
5	4000 rpm에서 2분 동안, 예를 들어, 메가퓨즈(Megafuge) 16으로 원심분리
6	표지된 빈(원추형) 오토-샘플러 바이알에 물 100 ㎕를 첨가
7	피펫 팁을 적시지 않고 약 50㎕를 오토-샘플러 바이알로 옮김
8	적절한 바이알 캡으로 바이알 압착
9	약 1분 동안 DVX-2500 멀터-튜브 볼텍서(2500 rpm)로 볼텍싱
10	[최대 85시간 이내 분석]; 분석할 때까지 약 25℃에서 오토-샘플러 조건에서 보관

b) 크로마토그래피

a)에 기술된 것과 같이 분석을 위해 준비된 샘플을 후속적으로 하기 파라미터에 따라 HPLC 크로마토그래피에 적용하였다:

[표 3]: 크로마토그래피 및 오토-샘플러 파라미터

파라미터	계획된 범위/설명
이동상 용매 A	물 내에 0.1%의 포름산
이동상 용매 B	90% 아세토니트릴 중, 0.1% 포름산
크로마토그래피 실행	0.0 내지 0.5 분 등용매: 0% B
	0.5 내지 3.0분 선형 구배: 0% B → 25% B
	3.01 내지 4.0분 등용매: 100% B
	4.01 내지 5.2분 등용매: 0% B
유속	1 mL/분
주입 부피	3㎕
컬럼	YMC Pack Pro C8, 100 × 3 mm, 12 nm (YMC, Japan)
컬럼 온도	60℃
일반적인 컬럼 압력	XEVO1에 주입 후 약 350 바(bar), 방법-특이적, 오직 정보제공용
BM1 및 내부 표준의 체류시간	2.6분±20%

질량 분광계를 이용한 BM1 검출

준비된 샘플을 이후, 표 4에 기재된 파라미터에 따라, UPLC-질량 분광계에 적용하였다.

[표 4] MS-검출(UNISpray를 이온 소스로 이용하는 XEVO TQ-XS)

파라미터	계획된 범위/설명
MS 방법 .exp에 정의된 것과 같은 파라미터	계획된 범위/설명
MS 이온화 모드 및 극성	US+ (양이온 모드의 UNISpray)
MS 검출 모드	MRM (다중 반응 모니터링)
오토 디웰(Auto dwell)	켜짐
디웰 시간[s]	약 0.053 (피크당)
체류 윈도우[분]	1 내지 3 (샘플 매니저 주입 시간과 비교하여 이 함수의 획득 시간을 정의함)
콘(Cone) 전압	20 V
MS 튠 방법 .ipr에 정의된 것과 같은 파라미터	계획된 범위/설명
임팩터 전압	3.0 kV
탈용매 온도	600℃
탈용매 기체 유속	1200 [L/h]
콘 기체 유속	200 [L/h]
네뷸라이저	압력 = 7 바 (고정 파라미터)
충돌 기체 유속	0.2 [mL/분]
수직 위치	대략 5.5 유닛
임팩터 위치	4 ¼ 유닛, 니들 팁이 약 1 ㎜보임
사중극자 분해능은 다음과 같이 정의됨: 분석기 LM 분해능 1 / 분석기 HM 분해능 1/이온 에너지 1 분석기 LM 분해능 2 / 분석기 HM 분해능 2/이온 에너지 2	3.0 / 15.0 / 0.5 AND 2.7 / 15.0 / 0.5

결과 평가 및 계산

건강한 인간의 혈장 샘플에서 BM1 함량을 보여주는 예시적인 크로마토그램을 도 1에 제시하였다. 패혈증을 앓고 있는 인간의 혈장 샘플에서 BM1 함량을 보여주는 예시적인 크로마토그램을 도 2에 제시하였다.

반올림 절차

크로마토그래피 데이터 시스템(CDS)에 공급되고 이로부터 검색된 농도 데이터는 5자리 유효 숫자로 반올림한다. 스프레드시트에서 추가 계산을 수행한 후 3자리 유효 숫자를 반올림하여 기록한다. 정확도 및 변동 계수(CV)는 한 자리 숫자로 기록한다.

반올림 절차 참조: 보고된 마지막 숫자는 후속 숫자가 "5"보다 크거나 같으면 반올림한다.

회귀 및 통계

보정 표준에 따라, 보정 곡선 피팅을 데이터 처리 소프트웨어를 이용하여 피크 면적 비(분석물 BM1/내부 표준)로 설정하였다. 분석물 BM1 농도를 내부 표준 방법을 이용하여 평가하였다.

HPLC-MS/MS 분석을 위해, 적절하고 안정적인 회귀 모델을 사용하였다. 따라서, 가중치가 1/농도(conc)인 2차(quadratic) 회귀 모델을 기본값으로 설정하였다. 이는 발생할 수 있는 회귀 모델의 변경을 피하기 위해, 특히 방법이 여러 프로젝트에서 수개월 또는 수년에 걸쳐 이용되는 경우에 사용하였다.

분석물 BM1의 농도를 다음의 회귀 모델, 가중 계수 및 공식을 이용하여 결정하였다:

평균값을 기반으로, 정밀도 결과(CV 기준) 및 정확도(아래에 표시된 공식)를 스프레드시트를 이용하여 계산하였다.

통계 모델에 대한 적절한 간행물은, 예를 들어, 다음에 소개되어 있다:

· Green, J.R., Statistical Treatment of Experimental Data (Elsevier, New York, 1977), page 210 ff

· Lothar Sachs, Angewandte Statistik - Anwendung statistischer Methoden (Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo 1984)

소프트웨어

PCT의 검출

PCT 레벨과 비교하기 위해, PCT를 상업적 검정, 예를 들어, Elecsys BRAHMS PCT, 프로칼시토닌(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)으로 측정하였다.

실시예 2: 건강한 인간 또는 비인간 동물 대상체에서 BM1 레벨의 결정.

건강한 인간 대상체에서의 BM1 레벨.

전술한 것과 같이 샘플을 준비하고 상기 샘플에서의 BM1 레벨을 실시예 1에 기재된 방법에 따라 측정하였다.

건강한 인간 대상체에서, 소변 내 BM1 농도는 혈장 농도에서의 BM1 농도보다 약 20~100배 더 높다. 따라서, 소변의 기준 레벨은 혈청이나 혈장보다 약 20-100 더 높다.

건강한 또는 패혈증이 없는 기준(음성 대조군 - 심부전) 모집단에서 얻은 데이터를 기반으로 하는 기준 레벨은 다음과 같다:

소변에서의 기준 레벨은 약 2500 내지 4500 ng BM1/mg 크레아티닌이다.

혈장 또는 혈청에서의 기준 레벨은 약 15 내지 40 ng BM1/mL이다.

건강한 비인간 동물 대상체에서의 BM1 레벨.

건강한 비인간 동물 혈장 또는 혈청에서의 BM1 농도를 테스트하고 건강한 인간 레벨과 비교하였다. 래트, 개, 토끼, 햄스터, 원숭이 및 마우스로 구성된 2 내지 3종의 다른 개체 또는 풀을 테스트하였다. 래트, 개, 토끼, 햄스터, 원숭이 및 마우스는 인간과 비교했을 때 매우 유사한 수치를 나타냈다.

송아지, 라마, 알파카, 염소, 및 소의 일부 샘플은 약 10 내지 30 ng/mL의 농도 레벨을 나타냈고, 일부 패혈성 송아지는 BM1에 대해 약 40 내지 80 ng/mL의 농도 레벨을 나타냈다.

실시예 3: 패혈증을 앓을 위험이 있는 대상체와 건강한 대상체에서의 BM1 레벨의 비교

392개의 혈장/혈청 샘플을 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 앓고 있는 129명의 인간 환자, 또는 심부전으로 진단된 패혈증이 아닌 환자(=대조군)로부터 얻었다.

환자 수, 패혈증 대(vs.) 심장 질환(대조군)

결과

패혈증, 또는 패혈성 쇼크를 앓고 있는 환자의 혈장 또는 혈청 내 BM1 레벨은 패혈증 증상을 앓고 있지 않는 환자의 각각의 샘플에 비해 유의하게 더 높았다.

실시예 4: BM1과 PCT의 성능 비교

BM1 및 PCT 레벨은 실시예 1에 기재된 것과 같이 측정하였다.

수신자 조작 특성

ROC 곡선 아래 면적(도 3)

매트릭스: 민감도/특이성 - 바이오마커 1

사용된 컷오프 값: 32 ng/mL(계산됨)

매트릭스: 민감도/특이도 - 프로칼시토닌

사용된 컷오프 값: 0.5 ng/mL(문헌에 따름)

지표 요약

실시예 5: 바이오마커로서 BM1의 생체분석적 특성화

혈장과 소변의 비교(ng BM1/mg 크레아티닌)

다음 동위원소 표지된 내부 표준을 BM1(1000 ng/mL)의 양을 결정하는 데 사용하였다: N6-(N-트레오닐카보닐)아데노신-13C4,15N(구조식/화학식(II)의 화합물).

패혈성 환자 및 대조군 환자의 혈장(또는 혈청) 및 소변 샘플을 분석하고 정량화하였다.

BM1은 매우 친수성인 것으로 밝혀졌으며 건강한 지원자의 소변 농도는 혈장/혈청보다 약 20 내지 100배 더 높았다. 패혈성 환자의 소변 농도는 매우 높을 수 있다. 패혈성 환자의 소변에서 BM1의 기준 레벨은 약 5000 내지 16000 ng/mg 크레아티닌이었다(건강한 경우, 실시예 2 참조).

패혈증이 있거나 없는 인간 신생아의 BM1 레벨

패혈증이 없는 신생아와 패혈증이 있는 신생아(1~10일)의 혈장 샘플을 분석했다. BM1은 질환의 신뢰할 수 있는 마커임이 입증되었다. 신생아의 PCT는 출생 직후 혈장이나 혈청에서 PCT 수치가 매우 높고(약 10 내지 30 ng/mL), 4~6일 이내에 정상 농도(패혈증에 대한 PCT의 컷오프는 혈장/혈청 중에서 0.5 ng/mL임)로 감소되기 때문에, 신생아의 PCT는 이 환자 그룹에 대해 임상의에 의해 실제로 이용되지 않으며; 따라서 PCT 레벨은 생후 첫 4-6일 이내에 안정적이지 않으므로 특징적이지 않다.

BM1을 신생아 샘플(패혈증이 있는 경우와 없는 경우)에서 결정하였다. 건강한 사람의 농도 레벨은 약 80 내지 120 ng/mL(n=6)이었으며, 패혈성 신생아의 경우 농도가 최대 300 ng/mL(n=7)까지 증가했다.

추가 연구:

동일한 환자의 PCT 결과와 비교하여 아래의 특정 환자 그룹에서 BM1 결정:

다발성 외상 환자

심한 화상을 앓고 있는 환자

대수술 후의 환자

말라리아 환자

특정 종양 환자

실시예 6: BM1 검출을 위한 ELISA

빠른 분석을 위해 임상 실험 장비에 맞는 면역학적 테스트를 제공한다. 이 예시적인 ELISA를 BM1 특이적 면역물질을 사용하여 혈장 또는 소변에서 BM1을 결정하는 데 사용할 수 있다. BM1을 특이적으로 인식하는 단클론 항체는, 맞춤형 디자인과 같은, 상업적 공급원으로부터 제공받을 수 있다. 대안적으로, 다클론 비인간 동물(예를 들어, 토끼 또는 양) 항체를 사용할 수 있다.

실시예 7: HPLC-MS/MS에 대한 내부 표준

동위원소 표지된 BM1을 위에서 언급한 분석된 인간 혈장 및 소변 샘플(실시예 1)의 정량적 생체분석을 위한 내부 표준으로 사용한다.

¹³C₄, ¹⁵N₁-BM1(5 질량 단위 고분자량).

구조는 본 명세서에 추가로 기재된 것과 같은 화학식 (II)이다.

Claims

대상체에서 패혈증 증상을 예측하는 방법으로서,
a. 상기 대상체의 샘플에서 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계로서, 상기 바이오마커는 하기 구조 (I) 또는 이의 염인, 단계; 및
b. 상기 레벨과 상기 바이오마커의 미리결정된 기준 값을 비교하는 단계,
를 포함하고,
상승된 바이오마커 레벨은 패혈증 증상의 위험 지표를 나타내는, 방법:

.
제1항에 있어서,
상기 기준 레벨 값은 상기와 같은 위험에 처하지 않은 대상체 또는 대상체 그룹에서의 바이오마커의 레벨, 또는 상기 패혈증 증상을 나타내는 임계치 레벨인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 패혈증 증상이 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 패혈성 쇼크 및 다발성 장기 기능장애 증후군(MODS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 패혈증 질환인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이오마커가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 분석 방법을 적용하여 측정되는, 방법:
(i) 효소면역 분석, 측방 유동 면역크로마토그래피 분석, 형광 면역분석, 방사면역분석, 및 자기 면역분석과 같은, 면역분석;
(ii) HPLC 크로마토그래피, UPLC 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피(GC) 또는 박층 크로마토그래피와 같은, 크로마토그래피,
(iii) 모세관 전기영동, 및
(iv) SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF 및 ESI-Q-TOF와 같은 질량 분광계 분석, 또는 NMR 분광법.
대상체에서 패혈증 질환을 모니터링하는 방법으로서,
a. 제1 시점에서 대상체의 샘플에서 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계로서, 상기 바이오마커는 청구항 1에 정의된 것과 같은 것인, 단계; 및
b. 이후 제2 시점에서 동일한 대상체의 샘플에서 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계,
를 포함하고,
상기 제1 시점과 제2 시점 사이의 바이오마커 레벨의 증가는 패혈증 질환의 진행을 나타내는, 방법.
패혈증 증상에 대해 대상체에게 적용되는 적어도 하나의 치료 유효성을 모니터링하는 방법으로서,
a. 제1 시점에서 대상체의 샘플에서 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계로서, 상기 바이오마커는 청구항 1에 정의된 것과 같은 것인, 단계; 및
b. 이후 제2 시점에서 동일한 대상체의 샘플에서 상기 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계,
를 포함하고,
상기 제1 시점과 제2 시점 사이에서 상기 바이오마커 레벨의 감소는 치료 성공을 나타내는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 청구항에 있어서,
상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 가래, 활액 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 체액인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 청구항에 있어서,
상기 샘플에 내부 표준 화합물을 스파이킹하고, 상기 바이오마커의 양을 상기 내부 표준 화합물의 레벨과 상기 바이오마커의 레벨을 비교하여 측정하고, 바람직하게는 상기 내부 표준 화합물이 동위원소 표지를 포함하는 바이오마커인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 내부 표준은 검출가능한 표지를 포함하는 구조 (I)의 것 또는 이의 염이고, 바람직하게는 C, H, N, 또는 O 중 적어도 하나의 원자가 각각의 중동위원소 C¹³, D, N¹⁵, O¹⁷ 및 O¹⁸로 치환된 것인, 방법.
패혈증 증상을 결정하는 방법에서의 진단 제제의 용도로서, 상기 진단 제제는 조성물 또는 부품 키트로 제공되고, 다음 성분을 포함하는, 용도:
a. 청구항 1에 정의된 바와 같은 바이오마커를 특이적으로 인식하는 면역물질;
b. 검출가능한 표지, 또는 면역물질 및/또는 바이오마커에 결합하는 면역물질의 반응 생성물과 특이적으로 반응하는 시약인 추가 진단 시약; 및
c. 면역물질 또는 진단 시약 중 적어도 하나를 고정시키기 위해 선택적으로 추가 포함되는, 고체 지지체.
패혈증 증상을 결정하는 방법에서 청구항 1에 정의된 바와 같은 바이오마커를 특이적으로 인식하는 면역물질의 용도로서, 상기 면역물질은 검출가능한 표지를 포함하는 것인, 용도.
하기 구조 (I)의 화합물 또는 이의 염의 패혈증 증상 바이오마커 용도:

.
패혈증 증상을 앓지 않는 대상체에서 패혈증 증상을 예측하는 방법으로서,
a. 상기 대상체의 샘플에서 소분자 바이오마커의 레벨을 측정하는 단계, 및
b. 상기 레벨을 상기 바이오마커의 미리 결정된 기준 값과 비교하는 단계,
를 포함하고,
상승된 바이오마커 레벨은 패혈증 증상 개시의 위험 지표를 나타내고, 상기 바이오마커는 청구항 1에 정의된 바와 같은 것인, 방법.
패혈증 증상을 앓지 않는 대상체에서 패혈증 증상을 모니터링하는 방법으로서,
a. 제1 시점에서 대상체의 샘플에서의 소분자 바이오마커 레벨을 측정하는 단계, 및
b. 이후 제2 시점에서 동일한 대상체의 샘플에서의 바이오마커 레벨을 측정하는 단계,
를 포함하고,
상기 제1 시점과 제2 시점 사이의 바이오마커 레벨의 증가는 패혈증 증상 발병을 의미하고, 상기 바이오마커는 청구항 1에 정의된 바와 같은 것인, 방법.