DE3390125T1 - Neue Vitamin D-Analogverbindungen - Google Patents

Description

Wisconsin Alumni Research Foundation North Walnut Street
Madison- Wisconsin 53705
USA

Beschreibung

Neue Vitamin D-Analogverbindungen ίο;

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Verbindungen,die durch eine dem Vitamin D ähnlichen Aktivität gekennzeichnet sind.

Insbesondere betrifft die Erfindung fluorierte Analoga des Vitamins D₃·

Stand der Technik
²^ Es ist derzeit gesichert, daß die Wirkung von Vitamin D bei der Regulierung der Calcium- und Phosphat-Hämeostase in Tieren und Menschen von dem Metabolismus des Vitamins in vivo zu hydroxylierten Formen abhängt. Im Falle des Vitamins D- beinhaltet diese metabolische ° Aktivierung eine anfängliche Hydroxylierung am Kohlenstoffatom 25, um 25-Hydroxyvitamin D₃ zu ergeben, woran sich eine andere Hydroxylierung am Kohlenstoffatom 1 anschließt, um 1crf,25-Dihydroxyvitamin D₃ zu erzeugen. Diese letztere Verbindung wird allgemein als die aktive Form

des Vitamins D₃ angesehen, und ist so dasjenige Mittel, welches direkt für die Stimulierung des intestinalen Calciumtransports und der Knochenmineral-Mobilisierung in vivo verantwortlich ist.

1o<,25-Dihydroxyvitamin D₃ ist jedoch selbst Subjekt eines weiteren Metabolismus in vivo, wobei es beispielsweise durch enzymatische Hydroxylierung am C-24-Atom

r -3-

in 1o(, 24 ,2 5-Trihydroxy vitamin D₃ umgewandelt wird. Diese in 24-Stellung hydroxylierte Form ist jedoch weniger aktiv als 1«,25-Dihydroxyvitamin D₃ selbst und die Hydroxylierung in 24-Stellung kann tatsächlich einen Schritt in Richtung einer Inaktivierung und in Richtung eines Abbaus der aktiven Form des Vitamins bedeuten. Somit werden in dem Ausmaße, in dem die Hydroxylierung in 24-Stellung auftritt ,die Körpervorräte des physiologisch am meisten aktiven Metaboliten, 1cx,25-Dihydroxyvitamin D^, erschöpft.

Aus diesem Grunde wurden neulich die 24,24-Difluoroverbindungen vorgeschlagen als pharmakologisch gewünschte Analoga und Ersatzverbindungen, da das Vorhandensein der 24-Difluoro-Substituenten die Hydroxylierungsreaktionen in 24-Stellung, welche die Aktivität herabmindern, blökkiert. Es hat sich tatsächlich erwiesen, daß derartige Verbindungen zumindest äquivalente Wirkungen aufweisen und im allgemeinen überlegen sind gegenüber dem entsprechenden nicht-fluorierten Metaboliten (vgl. US-PSen 4 196 133 und 4 201 881; Tanaka et al, J. Biol. Chem. ,254, 7163 (1979); Tanaka et al, Arch. Biochem. Biophys. 199, 473 (1980)).

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, welche die wünschenswerten Eigenschaften hoher Wirksamkeit und einer blockierten C-24-Stellung aufweisen. Ein Beispiel einer derartigen Verbindung ist das 24-Fluoro-1,25-dihydroxyvitamin D,, welches durch die nachfolgende

Struktur angegeben werden kann:
30

3310121

-Sr

und die entsprechenden Acylderivate dieser Verbindungen, wie auch deren 5,6-trans-Isomeren.

;,

Die oben gezeigte Struktur ist durch das Vorhandensein der die Aktivität steigernden Hydroxylgruppen an den Kohlenstoffatomen 1 und 25 gekennzeichnet, wie sie in dem natürlichen Metaboliten auftauchen, und durch Fluor als einen blockierenden Substituenten am Kohlenstoffatom 24. Der Blockierungs-Substituent behindert die Einführung der 24-Hydroxylgruppe über einen in vivo-Metabolismus. Aufgrund der Gegenwart eines einzelnen Fluor-Substituenten besitzen diese Verbindungen gegenüber den vorher vorgeschlagenen, in 24-Stellung blockierten Analoga (US-PSen 4 201 881 und 4 196 133, oben genannt) den Vorteil, daß sie biologisch und chemisch dem natürlichen 1,25-Dihydroxy-Metaboliten ähnlicher und diesem nahe verwandt sind, und somit ein mehr erwünschter Ersatz für die natürliehe Verbindung sind. Aufgrund dieser geringeren Fluorsubstitution kann diese neue Analogverbindung auch vorteilhaft und in breiterem Umfang bei der Behandlung von Knochenerkrankungen und damit in Zusammenhang stehenden CaI-cium-Störungen verwendet werden, da es bei praktischen pharmazeutischen Anwendungen von Arzneimitteln oft wünschenswert ist, die Einführung von unnatürlichen Fremdelementen so weit wie möglich zu vermeiden.

24-Fluoro-1o<,25-dihydroxyvitamin D₃ kann durch enzymatische Hydroxylierung in vitro von 24-Fluoro-25-hydroxyvitamin D₃ (US-PS 4 305 880) am Kohlenstoffatom unter Verwendung eines Homogenisats von Nierengewebe, welches von Küken mit Vitamin D-Mangel erhalten wurde, hergestellt werden. Das erforderliche Homogenisat wird folgendermaßen hergestellt: Einen Tag alte Leghorn-Küken wurden mit einer Vitamin D-Mangeldiät, die 1 % Calcium enthielt, für einen Monat gefüttert (Omdahl et al, Biochemistry, J_0, 2935-2940 (1971)). Die Küken wurden sodann getötet, ihre Nieren wurden entfernt und ein 20 %-iges (Gewicht/Volumen) Homogenisat wurde in einer eisgekühlten 0,19 M Sucroselösung, die 15 mM Tris-acetat (Trihydroxymethylaminoethanacetat, pH 7,4) und 1,9 mM Magnesiumacetat enthielt, hergestellt. (Omdahl, J., et al. Biochemistry, 10, 2935-2940 (1971) und Tanaka, Y., et al, Arch. Biochem. Biophys. 171, 521-526 (1975)).

Um die gewünschte Analogverbindung, 24-Fluoro-1«*,25-dihydroxyvitamin D₃ herzustellen, wird sodann die Vorläuferverbindung, 24-Fluoro-25-hydroxyvitamin D₃ mit diesem Homogenisat inkubiert. Das folgende Verfahren erläutert eine Inkubation in kleinem Maßstab, jedoch soll verstanden werden, daß diese Mengen in geeigneter Weise erhöht werden können, wenn dies gewünscht wird.

Eine Probe (ca. 3 ug) 24-Fluoro-25-hydroxyvitamin D₃ in 25 μΐ 95 %-igem Ethanol wird zu einem aliquoten Teil des Nieren-Homogenisats (hergestellt nach obiger Beschreibung und stellt etwa 6 00 mg Nierengewebe dar), suspendiert in 4,5 ml einer Pufferlösung (pH 7,4), die 0,19 M Sucrose, 1,5 mM Tris-acetat, 1,9 mM Magnesiumacetat und 25 mM Succinat enthält, zugesetzt. Nach dem Schütteln des Gemisches für einen Zeitraum von 2 Stunden bei 37⁰C wird die Reaktion durch Zugabe eines 2:1-Gemisches von Methanol:CHCl₃-Lösungsmittel abgebrochen. Die organische Phase des sich ergebenden Gemisches wird abgetrennt und

eingedampft und der Rückstand, welcher das gewünschte 24-Fluoro-1«,25-Dihydroxyvitamin D₃ enthält, wird einer Chromatographie unterworfen.

Die anfängliche Reinigung des Produktes wird leicht durchgeführt mittels der Chromatographie über kleine Sephadex LH-20-Säulen (Pharmacia Corp., Piscataway, N.J.), wobei Lösungsmittelsysteme, wie CHCl₃:Hexan (65:35, v/v) oder Hexan:CHCl₃:MeOH (9:1:1, v/v) verwendet werden, jedoch höchstbevorzugt das Produkt durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie gereinigt wird. (Ein Chromatograph, der für einen derartigen Zweck geeignet ist, ist ein Modell ALC/GPC 204 Hochdruck-Flüssigkeitschromatograph (Waters Associates, Medford, MA), ausgerüstet mit einem Ultraviolett-Detektor, der bei 254 nm arbeitet.) Die wie oben erhaltene Probe wird auf eine Silicagelsäule injiziert (Zorbax-SIL, 0,46 χ 25 cm, hergestellt von Dupont,

7 Inc.), die unter einem Druck von 0,69 χ 10 Pa (1000 psi) betrieben wird, wodurch eine Fließgeschwindigkeit von etwa 2 ml/min, erzeugt wird. Unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, welches 9 % 2-Propanol in Hexan enthält, wird die Probe zweimal durch diese Säule zurückgeführt (indem das Gerät auf seine Rückflußstellung eingerichtet wird) und anschließend gesammelt. Das Lösungsmittel wird verdampft und der Rückstand wird weiter auf einer Umkehrphasen-Säule /Zorbax-ODS (Octadecylsilan, welches an ein fein granuliertes Silicalgel gebunden ist), Abmessung 0,45 χ 25 cm, ein Produkt der Firma Dupont and Co.J unter Verwendung des gleichen Hochdruck-

Flüssigkeitschromatographen, der bei einem Druck von 2,1 χ 10 Pa (3000 psi) arbeitet, gereinigt. Das Produkt wird mit einem Lösungsmittelgemisch von H-0/MeOH (1:3) eluiert, einmal rückgeführt und anschließend gesammelt.

Die gesammelten Fraktionen werden eingedampft und der

Rückstand wird erneut über eine Direktphasen-Silicagelsäule (Zorbax-SIL, Abmessung 0,46 χ 25 cm) unter Verwen-

dung genau der gleichen Bedingungen, wie sie oben beschrieben wurden, rechromatographiert. Nach zweimaliger Rückführung wird die Probe gesammelt und nach Verdampfen des Lösungsmittels wird das reine Produkt (24-Fluoro-1α,25-dihydroxyvitamin D₃) erhalten und durch sein Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei 264 nm und durch sein charakteristisches Massenspektrum-Muster (MW = 4 34) charakterisiert und quantifiziert.

Aus dem 24-Fluoro-1tf,25-Dihydroxyvitamin D₃ wird das entsprechende 5,6-trans-Isomere leicht durch mit Jod katalysierte Isomerisierung nach dem allgemeinen Verfahren von Verloop et al, Rec. Trav. Chim. Rays-Bas JA' 1004 (1969) hergestellt. So wird durch Behandlung von 24-Fluoro-1(X,25-dihydroxyvitamin D₃ in Ether-Lösung, die einen Tropfen Pyridin enthält, mit einer Lösung von Jod in Hexan (ca. 0,5 mg/ml) über einen Zeitraum von 15 Minuten und anschließender Zugabe einer wässrigen Lösung von Natriumthiosulfat, Abtrennung der organischen Phase und Verdampfen des Lösungsmittels ein Rückstand erhalten, aus dem das gewünschte 24-Fluoro-1tf,25-dihydroxy-5,6-transvitamin D₃ durch eine Kombination von Umkehrphasen- und Geradphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung der oben beschriebenen Systeme oder durch Dünnschichtchromatographie (TLC) über Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan-Lösungsmittelgemischen isoliert wird.

Acylierte Derivate der beiden obigen Verbindungen, die zu bestimmten Anwendungen erwünscht sein können, werden nach herkömmlichen Methoden dargestellt, d*h. Behandlung einer Lösung der Hydroxylverbindung mit einem Acylierungsmittel, wie einem Acylanhydrid oder einem Acylchlorid. Verschiedene Verfahren für derartige Acylierungen sind dem Fachmann, wie auch die benötigten Acylierungsreagentien bekannt. So ergibt beispielsweise die Behandlung von 24-Fluoro-1,25-dihydroxyvitamin D₃ mit Essigsäureanhydrid

U-

in Pyridin oder Gemischen von Pyridin und einem inerten Co-Lösungsmittel bei Temperaturen unterhalb von 50⁰C das entsprechende 1,3-Diacetat, während unter stärkeren Bedingungen, beispielsweise 80 bis 90⁰C,das 1,3,25-Triacetat erhalten wird. Andere Acylate, wie Propionate, Butyrate, Benzoate, Nitrobenzoate, Hemisuccinate, Hemiglutamate, Hemiadipate, Hemidiglykolate, etc. werden in analoger Weise durch Umsetzung des Vitaminalkohols mit den entsprechenden Anhydriden oder Acylchloriden hergestellt. Gewünschtenfalls werden die Acylgruppen in derartigen acylierten Derivaten auf herkömmliche Weise, wie durch Hydrolyse mit einer milden Base (KOH/MeOH oder ähnlichen Bedingungen) entfernt. Mittels selektiver Acylierung und/oder Deacylierung, die an 24-Fluoro-1o(,25-dihydroxyvitamin D, oder seinem 5,6-trans-Isomer durchgeführt werden, kann man Verbindungen erhalten, die durch die nachfolgenden Strukturen gekennzeichnet sind:

.R-, O

worin jeder der Reste R₁ , R₂ und R-., die untereinander gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder ein Acylrest ist.

In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen bezieht sich der Begriff Acyl auf eine aliphatisch^ Acylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in allen möglichen isomeren Formen, wie Acetyl, Propionyl, Butyryl, etc.,

sr - S-

oder auf herkömmliche aromatische Acylgruppen, wie Benzoyl, Nitrobenzoyl, Halogenbenzoyl, Methylbenzoyl, etc., oder auf eine Dicarbonsäure-Acylgruppe mit 2 bis 6 Atomen Kettenlänge, wie sie durch Oxalyl, Malonyl, Succinyl, Glutaryl, Adipyl, Diglycolyl, etc. dargestellt ist.

Die hohe, dem Vitamin D ähnliche Aktivität der neuen Verbindungen gemäß der Erfindung, die derjenigen des natürlichen Hormons, 1,25-Dihydroxyvitamin D^, ähnlich ist, legt ihre Anwendung als therapeutische Mittel bei Erkrankungen, die den Calcium- und Phosphat-Metabolismus einschließen, mit möglicherweise besserer Beibehaltung des Verbindungsvorrats in vivo aufgrund der Interferenz mit der Hydroxylierung in 24-Stellung stark nahe.

Claims (4)

1. Patentansprüche

   1 T) Verbindungen der Struktur

   worin jeder der Reste R.., R„ und R-,, die untereinander gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder ein Acylrest ist. 20
2. 2. Verbindungen nach Anspruch 1, worin jeder der Reste R.J , R₂ und R 'ein Wasserstoffatom, ein Acetyl- oder ein Benzoylrest ist.
3. ²⁵ 3. 24-Fluoro-1c*,25-dihydroxyvitamin D₃.
4. 4. 24-Fluoro-1 (X, 25-dihydroxy-5 ,6-trans-vitaniin D,