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Verwendung von Pyrazolonderivaten als Lipoxygenasehemmer,
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bei der Therapie von Ischämien und Herzrhythmusstörungen, Haut- und
Augenentzündungen, sowie von rheumatischen, allergischen und asthmatischen Erkrankungen,
Oedemen, Lungenembolien, pulmonaler Hypertension, Schocklunge, Sauerstoffintoxikation
und Ulcerationen, Arzneimittel hierfür und Verfahren zu deren Herstellung Die vorliegende
Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter 1-substituierter Pyrazolon-(5)-Derivate
als Lipoxygenasehemmer, zur Verhütung und Behandlung von Ischämien, insbesondere
von Herzinfarkten nach Myokardischämien, von Herzrhythmusstörungen, von Hautentzündungen
(insbesondere Psoriasis) und Augenentzündungen, von rheumatischen, allergischen
und asthmatischen Erkrankungen, Schocklunge, Lungenembolien und Oedemen (insbesondere
Lungenoedemen), von pulmonaler Hypertension, Sauerstoff intoxikationen sowie von
Ulcerationen. Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittel gegen Haut- und Augenentzündungen
und Schocklunge sowie lipoxygenasehemmende, bronchodilatorische, antiarrhythmische,
antiischämische, antirheumatische, antiallergische,
antiasthmatische,
antioedemische und gastroprotektive Arzneimittel, welche durch den Gehalt an einer
therapeutisch wirksamen Menge des Pyrazolonderivats gekennzeichnet sind.
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In US-PS 3 147 276 wird beschrieben, daß gewisse 1-substituierte Pyrazolone-(5)
antiinflammatorische Eigenschaften besitzen. Weiter ist bekannt, daß zahlreiche
Pyrazolon-(5)-Derivate als Diuretika, Antihypertensiva und Antithrombotika eingesetzt
werden können (DE-OS 2 319 280, DE-OS 2 554 701, DE-OS 2 363 511 und DE-OS 2 554
703).
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Als mit Abstand stärkstes Antithrombotikum erwies sich das 3-Methyl-1-z2-(2-naphthvloxy)-ethyl7-2-pyrazolin-5-on
("Nafazatrom"), das in DE-AS 2 247 272 (US-PS 4 053 621) beschrieben wird. Von Nafazatrom
ist auch bekannt geworden, daß es als Stimulator von endogenem Prostacyclin (PGI2)
aus dem Gefäßendothel wirken kann (Vermylen et al., Lancet I, 528, 1979, Chamone
et al., Haemostasis 10, 297, 1981, McIntyre und Salzman, Thrombosis and Haemostasis,
46, Abstr. No. 45, 1981). Außerdem wurde von Wong und McGiff (J. Pharmacol. Exp.
Ther. 223, 757-760, 1982) gezeigt, daß Nafazatrom die 15-Hydroxyprostaglandindehydrogenase,
das PGI2-abbauende Enzym, blockiert.
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Darüber hinaus hemmt die Substanz die Lipoxygenaseaktivität (Busse
et al., Fed. Proc. 41, 1717, 1982).
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Wie sich zeigte, ist die antithrombotische Wirkung von Nafazatrom
außerordentlich strukturabhängig: So ver-
mindert beispielsweise
die Substitution von Methyl gegen Ethyl in der 3-Position des Nafazatroms dessen
Wirkung bei der Thromboseprophylaxe auf etwa 1/30, während beim entsprechenden 3-Benzyl-,
3-Isopropyl-, 3-n-Propyl- sowie 3,4-Dimethyl-Derivat auch bei 100-facher Dosissteigerung
gegenüber Nafazatrom kein Effekt feststellbar ist. Es ist daher als äußerst überraschend
anzusehen, daß diese Verbindungen und auch strukturell noch fernerliegende Pyrazolonderivate
dem Nafazatrom hinsichtlich der anderen oben erwähnten Wirkqualitäten zumindest
gleichwertig sind.
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Die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate entsprechen der
allgemeinen Formel
worin R für einen Aryl- oder Heteroarylrest mit 6 bis 12 C-Atomen steht, der gegebenenfalls
1 bis 3 gleiche oder verschiedene Substituenten aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl,
Alkyl, Alkenyl, Alkoxy, Alkylamino, Cyano, Trifluormethoxy, Nitro, Hydroxy, SOn-Alkyl
(n = 0 bis 2) oder SOn-Trifluormethyl (n = 0 bis 2) enthält, wobei unter Alkyl,
Alkenyl und Alkoxy jeweils Reste mit 1 bis 4 C-Atomen zu verstehen sind,
R1
Wasserstoff oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 18, vorzugsweise 1 bis 8
C-Atomen, welcher gegebenenfalls eine Hydroxy-, Ether-, Ester- oder Carboxylgruppe
sowie gegebenenfalls 1 bis 3 Halogenatome enthält, darstellt, R2 die Bedeutung von
R1 hat oder für einen Rest
steht, R³ Wasserstoff, einen Acyl- oder Sulfonylrest mit jeweils 1 bis 15 C-Atomen
darstellt und X für eine der Gruppen -CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-CH3-I -S-CH,-CH2-, -CH2-CH2-,
-CH2 - oder
steht, wobei das Sauerstoff- bzw. Schwefelatom an den Rest R gebunden ist, mit der
Maßgabe, daß X nicht für -O-CH2-CH2- steht, wenn R = B-Naphthyl; R1 = CH3 und R
= =H.
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Erfindungsgemäß bevorzugt einzusetzende Verbindungen der allgemeinen
Formel (I) sind solche, bei denen R für einen gegebenenfalls substituierten Naphthyl-,
Diphenyl- oder Phenylrest steht, besonders bevorzugt einen Naphthyl- oder Diphenylrest,
insbesondere
α - oder ß-Naphthyl. Bevorzugt tragen diese
Reste 0, 1 oder 2 Substituenten, insbesondere Br oder Cl.
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Bromnaphthylreste sind besonders bevorzugt.
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Erfindungsgemäß werden weiterhin solche Verbindungen der allgemeinen
Formel (I) bevorzugt, bei denen R1 für einen Phenyl-, Benzyl- oder Cyclohexylrest
oder einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest, vorzugsweise einen Rest mit 1 bis
4 C-Atomen, welcher gegebenenfalls eine Hydroxyl-, Ether-oder Estergruppe aufweist,
besonders bevorzugt eine gegebenenfalls verzweigte C1-C4-Alkylgruppe steht, und
2 die bevorzugte Bedeutung von 1j R die bevorzugte Bedeutung von R besitzt oder
auch Wasserstoff darstellt. Besonders bevorzugt ist mindestens einer der Reste R1
oder R2 nicht Wasserstoff und R1 und R2 besitzen zusammen 2 bis 7, insbesondere
2 bis 4 C-Atome.
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Weiterhin sind erfindungsgemäß Verbindungen der allgemeinen Formel
(I) bevorzugt, bei denen R³ für Wasserstoff oder einen aromatischen Acylrest mit
7 bis 13 C-Atomen, insbesondere einen Carboxyphenyl- oder Carboxynaphthylrest steht,
der gegebenenfalls 1 oder 2 Substituenten aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl,
C1-C4-Alkoxy und Nitro enthält. Besonders bevorzugt ist R3 Wasserstoff.
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Erfindungsgemäß bevorzugt sind schließlich auch Verbindungen, bei
welchen X für -O-CH2-CH2-, -S-CH2-CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2 - oder
steht, insbesondere für -O-CH2 -CH2-, -CH2-CH2-CH2- oder
Wenn R3 = H, dann können die erfindungsgemäß einzusetzenden Verbindungen außer in
der durch Formel (I) repräsentierten Form auch in einer der folgenden tautomeren
Formen oder als Gemisch der möglichen tautomeren Formen vorliegen:
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate der allgemeinen Formel (I)
sind aus DE-OS 2 319 280 (US-PS 3 957 814), DE-OS 2 363 511 (US-PS 4 002 641), DE-OS
2 554 701 und DE-OS 2 554 703 bekannt und können nach den dort im Detail beschriebenen
Verfahren hergestellt werden.
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Verbindungen der Formel (I), bei welchen R3 = H, werden erhalten,
wenn man A) Hydrazine der Formel R-X-NH-NH2 (11)
in welcher R und
X die oben angegebene Bedeutung haben, mit ß-Ketosäurederivaten der Formel
in welcher R1 und R2 die oben angegebene Bedeutung haben und Y für einen austretenden
Rest, z.B. einen Hydroxy-, Alkoxy-, Aralkoxy-, Amino- oder Alkylaminorest steht,
gegebenenfalls in Gegenwart inerter Lösungsmittel und basischer oder saurer Katalysatoren
wie Alkali-und Erdalkalihydroxide und -carbonate oder wie Halogenwasserstoffsäuren,
Schwefelsäure oder Sulfonsäuren, bei Temperaturen zwischen 10 und 200"C umsetzt,
oder B) Verbindungen der Formel R-X-A (IV) in welcher R die oben angegebene Bedeutung
hat und
A einen austretenden Rest wie Halogen oder einen Dialkyloxonium-,
Dialkylsulfonium-oder Trialkylammoniumrest oder einen Aryl-oder Trifluormethylsulfonsäurerest
darstellt, mit Pyrazolon-(5)-derivaten der Formel
in welcher R1 und R2 die oben angegebene Bedeutung haben, gegebenenfalls in Gegenwart
inerter Lösungsmittel und anorganischer oder organischer Basen wie Alkalihydroxide,
-carbonate, -alkoholate, -hydride oder -amide bei Temperaturen zwischen 10 und 2000C
umsetzt, oder C) Acetylencarbonsäurederivate der Formel
in welcher R1 und Y die oben angegebene Bedeutung haben,
mit Hydrazinen
der obigen Formel (II), gegebenenfalls in Gegenwart inerter Lösungsmittel und anorganischer
oder organischer Basen, bei Temperaturen zwischen 50 und 2000C umsetzt.
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Verbindungen der Formel (I), in denen R3 f H, werden erhalten, indem
man eine Verbindung der Formel
in welcher R, X, R1 und R2 die oben angegebene Bedeutung haben, mit Säurederivaten,
vorzugsweise mit a) Carbon- bzw. Kohlensäurederivaten der Formel
in welcher As einen austretenden Rest wie Halogen oder einen 5-gliedrigen, heterocyclischen
Azolring oder eine über ein Sauerstoff- oder Schwefelatom an den Carbonyl-Kohlenstoff
gebundene Alkylgruppe oder einen gegebenenfalls durch 1 bis 2 Nitrogruppen substituierten
Phenylrest oder einen Acyloxyrest bedeutet und 4 die Bedeutung von 3 R -C=O die
Bedeutung von R hat,
oder b) mit Sulfonsäurederivaten der Formel
R5-SO2-A" (VIII) in welcher R5-SO2 die Bedeutung von R3 hat und für Halogen steht,
gegebenenfalls in Gegenwart inerter Lösungsmittel und basischer Hilfsstoffe, wie
Alkali- oder Erdalkalihydroxide und -carbonate oder organischer Basen, wie Triethylamin
oder Pyridin bei Temperaturen zwischen -20 und 1500C umsetzt.
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Die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate hemmen überraschenderweise
die Lipoxygenaseaktivität, welche für die Biosynthese des chemotaktisch wirksamen
Leukotriens B4 und der spasmogen wirksamen Leukotriene C4 und D4 verantwortlich
ist.
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Bekannte Lipoxygenasehemmer wie Nordihydroguaretsäure, 3-Amino-1-
(3-trifluormethylphenyl) -pyrazolin (BW 755 C) Phenidon und 5,8,11,14-Eikosatetransäure
haben den Nachteil, daß sie entweder gleichzeitig als Cyclooxygenasehemmer oder
erst bei sehr hohen Konzentrationen wirksam sind. Die Hemmung des Enzyms Cyclooxygenase
des Arachidonsäuremetabolismus führt zu einer globalen Prostaglandinsynthesehemmung
und zu einer Stimulation des Lipoxygenaseweges, was Gastrotoxizität, entzündungsför-
dernde
und asthmatische Wirkungen und erhöhte Thromboseneigung infolge Hemmung der Prostacyclinsynthese
verursachen kann.
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Eine derartige Cyclooxygenasehemmung tritt bei der Applikation der
erfindungsgemäß zu verwendenden Pyrazolonderivate nicht ein. Diese zeigen im Gegenteil
eine ausgeprägte antiasthmatische, entzündungshemmende und gastroprotektive Wirkung.
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Uberraschenderweise hemmen die erfindungsgemäß zu verwendenden Pyrazolonderivate
selektiv die für die Biosynthese der Leukotriene B4, C4 und D4 verantwortliche 5-Lipoxygenase,
während die für die Biosynthese des endogenen Lipoxygenaseinhibitors 15-Hydroxyeikosatetraensäure
(15-HETE) zuständige 15-Lipoxygenase nicht gehemmt bzw. bei Konzentrationen 10ßg/ml
sogar stimuliert wird. Ebenso wird die 12-Lipoxygenaseaktivität durch die erfindungsgemäß
zu verwendenden Pyrazolonderivate bei diesen Konzentrationen nicht gehemmt. Au-Berdem
stimulieren die erfindungsgemäß zu verwendenden Pyrazolonderivate spezifisch die
Synthese von Prostacyclin (PGI2).
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überraschenderweise wird in Gegenwart der erfindungsgemäß einzusetzenden
Pyrazolonderivate nur die PGI2-Synthese stimuliert, während die Synthese der vasokonstriktorisch
wirksamen Prostaglandine und des TXA2 nicht beeinflußt ist. Die erfindungsgemäß
einzusetzenden Pyrazolonderivate weisen auch lokal gefäßdilatierende Effekte
auf,
die besonders im ischämischen Gewebe (z.B. Herz, Hirn, Peripherie) von therapeutischem
Nutzen sind. Im Unterschied zu Indomethacin, welches die Prostaglandinsynthese aus
der Arachidonsäure insgesamt hemmt, greifen die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate
viel spezifischer in den Stoffwechsel der für die Bildung des PGI2, des Thromboxans
und der Leukotriene maßgebenden Enzyme ein, so daß nicht nur der schädigende, gefäßverengende
und arrhythmienerhöhende Einfluß des Thromboxans und der Leukotriene reduziert sondern
auch der gefäßerweiternde Einfluß des Prostacyclins durch Stimulierung seiner Bildung
erhöht wird.
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Hinzu kommt, daß die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate
die schädigende Wirkung eines plötzlichen Sauerstoffeinstroms nach einer hypoxischen
oder anoxischen Periode reduzieren bzw. ausschalten. Schädigungen durch Reoxygenierung
können nach Bypass-Operationen auftreten. Die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate
werden daher bei derartigen Operationen geeignet sein, Sauerstoffschäden zu verhindern.
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Uberraschenderweise wurde auch gefunden, daß die erfindungsgemäß einzusetzenden
Pyrazolonderivate die Klebrigkeit von Leukozyten (stickiness) vermindern, d.h. deren
Wanderungsgeschwindigkeit erhöhen. Diese Verminderung der Leukozytenklebrigkeit
trägt ebenfalls zur Abnahme ischämischer Gebiete bei, denn die Leukozyten passieren
nach Behandlung mit den erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivaten den mikrozirkulatorischen
Bereich dieser Gebie-
te, ohne durch totalen oder zeitweiligen
Verschluß von kleinen Gefäßen bzw. Kapillaren eine Minderversorgung des entsprechenden
Gewebes hervorzurufen.
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Die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate können darüber
hinaus auch zur Therapie von pulmonaler Hypertension, Lungenembolien, Lungenoedemen
und Schocklunge (ARDS = "Adult Respiratory Distress Syndrom") herangezogen werden.
Die bronchodilatierenden Eigenschaften der Wirkstoffe lassen sich z.B. an der isolierten
Meerschweinchenlunge (nach der Methode von F.P. Luduena et al., Arch.Int.Pharmacodyn.
111, 392, 1957) zeigen.
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Die erfindungsgemäß einzusetzenden Verbindungen eignen sich auch für
die Therapie von Augen- und Hautentzündungen, insbesondere Psoriasis und Vitiligo.
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Die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate vermindern darüberhinaus
überraschenderweise die Größe von Herzinfarkten nach Myokardischämien und besitzen
positiven Einfluß auf Herzrhythmusstörungen. Auch diese erfindungsgemäßen Verwendungszwecke
der erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate werden durch die eingangs beschriebenen,
aus dem Stand der Technik bekannten Indikationen nicht nahegelegt: Substanzen zur
Therapie von Herzrhythmusstörungen werden nach ihren elektrophysiologischen Wirkungen
eingeteilt.
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Seit der Klassifizierung von Vaughan Williams (Pharmac.
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Ther. B 1, 115, 1975) unterscheidet man folgende Klassen: I) Membranstabilisierende
Antiarrhythmika vom a) Chinidintyp, z.B. Procain, Ajmalin b) Lidocaintyp, z.B. Lidocain,
Diphenylhydantoin II) Beta-Rezeptorenblocker, wie z.B. Propanolol u.v.a.
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III) Calciumantagonisten, wie z.B. Verapamil, Nifedipin u.v.a.
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IV) Substanzen mit Verlängerung der Aktionspotentialdauer, wie z.B.
Amiodaron.
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Die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate sind weder aufgrund
ihrer chemischen Struktur noch ihrer bisher bekannten Wirkungen unter die obigen
Gruppen zu subsumieren. Es war aus diesem Grund nicht vorhersehbar, daß die erfindungsgemäß
einzusetzenden Pyrazolonderivate antiarrhythmische Effekte entfalten.
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Ebensowenig war aufgrund der antithrombotischen Wirkung zu erwarten,
daß die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate nach erfolgtem Gefäßverschluß
-und zwar unabhängig von der Natur des Koranargefäßverschlusses - die Ausbreitung
der Myokardischämie stark einschränken und damit die Infarktgröße vermindern und
darüber hinaus zu einer rascheren Heilung und geringeren Kreislaufnebenwirkungen
führen. Wie durch Tierversuche gezeigt werden kann, verringern die erfindungsgemäß
einzusetzenden
Pyrazolonderivate die Ischämie-bedingte Anhebung der ST-Strecke als Infarktzeichen;
darüber hinaus steigt die R-Welle der peripheren Extremitäten-EKG weniger stark
an und bildet sich schneller zurück; ST-Intervalle werden weniger als in den Kontrollen
verändert, was auf eine verbesserte Repolarisation der Herzmuskelzellen bei vermindertem
Herzinfarkt schließen läßt.
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In den Arzneimitteln gemäß vorliegender Erfindung sind neben den erfindungsgemäß
einzusetzenden Pyrazolonderivaten auch pharmazeutisch unbedenkliche Verdünnungsmit-,tel
oder Trägermaterialien enthalten. Hierunter sind nicht-toxische Substanzen zu verstehen,
die nach dem Vermischen mit dem Wirkstoff diesen in einer für die Verabreichung
geeigneten Form liefern. Die Bezeichnung schließt vorzugsweise Wasser und üblicherweise
bei der chemischen Synthese verwendete organische Lösungsmittel mit niederem Molekulargewicht
aus, außer bei Vorliegen anderer pharmazeutisch erforderlicher Bestandteile wie
Salze in den richtigen Mengen, um eine isotonische Zubereitung herzustellen, Puffer,
oberflächenaktive Mittel, Farb- und Geschmacksstoffe und Konservierungsmittel. Beispiele
für geeignete feste und flüssige Verdünnungsmittel und Trägermaterialien sind die
folgenden: Wasserhaltige Puffermittel, die durch Zusatz von Glucose oder Salzen
isotonisch gemacht werden können; nicht-toxische organische Lösungsmittel wie Paraffine,
pflanzliche Öle, Alkohole, Glykole; gemahlene Natursteinmaterialien (beispielsweise
Kaoline, Aluminiumoxide,
Talkum oder Kreide); synthetische Gesteinspulver
(beispielsweise hochdisperse Kieselsäure oder Silikate); Zucker; und wäßrige Suspensionen
von Cellulosederivaten, z.B. Methylhydroxyethylcellulose (Tylose).
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In der Regel enthalten die erfindungsgemäßen Arzneimittel 0,5 bis
95 Gew.-%, bevorzugt 1 bis 90 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 50 Gew.-%, an den
erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivaten.
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Die orale Verabreichung kann unter Verwendung fester und flüssiger
Dosierungsformen wie Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulat, Suspensionen,
Lösungen und dergleichen vorgenommen werden. Gegebenenfalls können die Dosierungseinheiten
für die orale Verabreichung mikroverkapselt werden, um die Abgabe hinauszuzögern
oder über längere Zeit hinweg zu verlangsamen, wie beispielsweise durch Überziehen
oder Einbetten von teilchenförmigem Material in Polymere, Wachs oder dergleichen.
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Die parenterale Verabreichung kann unter Verwendung flüssiger Dosierungsformen
wie steriler Lösungen und Suspensionen erfolgen, die für die subkutane, intramuskuläre
oder intravenöse Injektion bestimmt sind.
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Diese werden durch Suspendieren oder Auflösen einer abgemessenen Menge
des Wirkstoffes in einem zur Injektion geeigneten nicht-toxischen flüssigen Streckmittel
wie einem wäßrigen oder öligen Medium und Sterilisierung der Suspension oder Lösung
hergestellt. Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Emulgatoren können ebenfalls
zugesetzt werden.
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Im allgemeinen beträgt beim Menschen die auf das Körpergewicht bezogene
Tagesdosis des Wirkstoffs für die parenterale Verabreichung 0,01 bis 50 mg/kg, vorzugsweise
0,1 bis 10 mg/kg, und für die orale Verabreichung 0,1 bis 500 mg/kg, vorzugsweise
0,5 bis 100 mg/kg, besonders bevorzugt 1 bis 50 mg/kg.
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Die Dosierungseinheit (Tablette, Kapsel, etc.) entält in der Regel
1 bis 100 mg, bevorzugt 5 bis 50 mg, besonders bevorzugt 10 bis 30 mg, an den erfindungsgemäß
einzusetzenden Pyrazolonderivaten.
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Beispiel 1 Lipoxygenasehemmende Wirkung Die im vorliegenden Beispiel
verwendeten Human-PMN-Leukozyten ( 95 %) wurden aus heparinisiertem Vollblut durch
eine Dextran-Sedimentation und anschließende Dichtegradiententrennung (Ficoll-Paque)
gewonnen (vgl.
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A. Boyum, Scand.J.Immunol., 5, Suppl. 5, 9, 1976).
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2 x 107 Zellen/ml wurden in Ca2+ -haltigem Dulbecco-Phosphat-Puffer
suspendiert und in Anwesenheit bzw.
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Abwesenheit von Lipoxygenasehemmer mit radioaktiv markierter Arachidonsäure
und dem Calcium-Ionophor A 23187 inkubiert. Nach 15 Minuten wurden die markierten
Lipoxygenaseprodukte aus dem angesäuerten Inkubationsmedium extrahiert und mit einem
für die Leukotriene (5-HETE-LTB4) geeigneten Fließmittelgemisch dünnschichtchromatographisch
getrennt (vgl. B. Jakschik et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 102, 624, 1981).
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Die Verteilung der Aktivität auf die verschiedenen Metaboliten wurde
am Dünnschichtscanner gemessen. Sie bildet ein Maß für die Lipoxygenasehemmwirkung
einer Prüfsubstanz bei einer bestimmten Konzentration.
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Unabhängig wurden die Lipoxygenasemetaboliten auch noch mittels HPLC
bestimmt. Diese Methode erlaubt es, mit Hilfe der UV-Detektion der Leukotriene den
endogenen Arachidonsäuremetabolismus zu studieren. Hierbei wurden die Zellen wie
oben beschrieben behandelt mit der Ausnahme, daß keine radioaktiv markierte Arachidonsäure
exogen hinzugefügt wurde. Die Hochdruckflüssigkeitschromatographie wurde auf Lichrosorb
RP-18(5Fm)-Säulen durchgeführt. Das Laufmittel war Methanol/Wasser/Eisessig 69/31/0.01.
Die Flußrate betrug 1 ml/min. Leukotrien B4 wurde bei 280 nm, die HETE-Derivate
bei 232 nm mittels der UV-Absorption bestimmt.
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Die Hemmung der LTB4-Biosynthese durch verschiedene Pyrazolonderivate
zeigt die nachstehende Tabelle 1:
Tabelle 1
| Verbindung Konzentration Hemmung |
| (g/ml) (%) |
| CH2 (cH3) 2 -5 100 |
| a 106 100 |
| 1010 2 ( 3)2 5-1100 65 100 |
| 5.10 89 |
| cH -5 100 |
| 22 32-CH2-NCX 3 5 106 87 |
| 5.106 62 |
| 5,10-7 |
| 30 |
| CH -5 100 |
| bO{H2 25 | 5.1°-6 100 |
| Qo 10 100 |
| Br ob CH 10 CH3 |
| oo cH3 10-6 100 |
| 5.106 100 |
| O22-N 75 |
| 75 63 |
| 5.10 |
| - -5 100 |
| 0 CH3 10 5 87 |
| $V; (CH2) 33 5,10-6 |
| 87 |
| 5.10 31 |
| 10,6 ~ 100 |
| wO<H2 CH2 Nc; 5 1o00o |
| Br 5.10 82 |
| 5.10 |
| Cl>-N 10 46 |
| Cl oo |
| CH3 ~ . |
| 00O22-N 10 100 |
| 51 6 83 |
| 5.10 75 |
Tabelle 1 (Fortsetzung)
| Verbindung Konzentration Hemmung |
| (g/ml) (%) |
| CH3 / 3 10-5 100 |
| O-CH,-CH2-N 5.1 CH3 5 10°~65 100 |
| Ii (CH2)5-CH3 106 93 |
| 0 |
| C6H5 |
| 10 C6H5 10-5 0 100 |
| ~CH2-CH2-CH2-N | 5 10°~6 181° |
| 1 6 81 |
| lr 10 |
| 0 |
| II CH2 CH2 CH2 N | 10-6 71 |
| 0 |
| 10 100 |
| 5.106 92 |
| 9 |
| Ii |
| 0 |
| CH 10-5 100 |
| Cl- O-CH -CH-N' 5.106 92 |
| 2 2 106 43 |
| CH3 |
| ,N~ .CH3 10-5 0-5 100 |
| c -6 |
| Cl- g - H-N' 5.10 100 |
| c.1/ CH3 ll CH2- C6H5 |
| 0 |
Tabelle 1 (Fortsetzung)
| Verbindung Konzentration Hemmung |
| (g/ml) (%) |
| 'ar3 |
| 2 2 N2 5 . 10 6 1 585 |
| . |
| wO<H2KH2-N 10 50 |
| O-CH,-CH"- |
| CH3 10 100 |
| 0=C'ffcol 5.106 80 |
| wO CH2KH2-NX 2 5.10'5 861° |
| QQ 22 O-C-CH, 5.106 61 |
| 0 |
| CH -O-C-CH3 1 o - 5 82 |
| 0 0 -6 |
| o-cH22-N Ncp 5.in~6 52 |
| 10 36 |
| CH23 |
| wO-CH2{:E12-N2 5 . 1 ° 6 93 |
| 106 -6 80 |
| 40 |
| 10'6 100 |
| °{2I2<H2 5. 5 .10 6 100 |
| 0 0 10 |
| (Vergleich) 5.10 7 30 |
Beispiel 2 SP-ezifische Protacyclinsynthese-Stimulation Die spezifische
PGI2-stimulierende Wirkung der Pyrazolonderivate wurde in vitro in einem Gemisch
aus Mikrosomen von Schafssamenblasen (RSVM) und Rinderaorten (BAM) gezeigt (vgl.
F. Cottee et al., Prostaglandins, 14, 413, 3 1977). 3H-Arachidonsäure wurde in Gegenwart
von 3.10 g/ml des Pyrazolonderivats mit einem Gemisch aus RSVM und BAM 10 Min. bei
250C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Ansäuern auf pH 3,5 gestoppt. Die Fettsäuremetaboliten
wurden mit Essigester extrahiert. Der Essigester wurde unter N2 abgedampft und der
Rückstand in CH30H/CHCl3 (1:1) aufgenommen und auf DC-Plastikfolien aufgetragen.
Die Trennung erfolgte mit einem Fließmittelgemisch Ethylacetat/Eisessig/Isooctan/H2O
(110:20:50:10; organische Phase) (P. Needleman et al., The Journal of Clinical Investigation
1978, 61, 839-849). Die Verteilung der Radioaktivität wurde mittels eines Radioscanners
gemessen.
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Die nachfolgende Tabelle zeigt den Einfluß der Pyrazolonderivate (10
4 g/ml) auf die Synthese verschiedener Prostaglandine in RSVM gegenüber dem Kontrollversuch
ohne Wirkstoff:
Tabelle 2
| Erhöhung der Konzentration (in %) |
| Prostaglandin gegenüber der Kontrolle |
| Verbindung 1 Verbindung 2 |
| 6=Keto-PGF1A 300 - 400 250 - 300 |
| PGD2 0 O |
| PGE2 O 0 |
| PGF2w 0 0 |
Verbindung 1 Verbindung 2
Beispiel 3 Leukozytenklebrigkeit Die Zahl der Leukozyten, die
ein Gefäß in einem bestimmten Abschnitt passieren, dient als einfaches Modell zur
Messung der Klebrigkeit von Leukozyten (Bray, M.A. et al.
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Prostaglandins 22, 213 (1981)). Die Anzahl der gezählten Leukozyten
wird umso größer, je geringer die Klebrigkeit dieser Zellen wird.
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Die unten beschriebenen Pyrazolonderivate wurden in diesem Modell
untersucht.
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Männliche Syrische Goldhamster (80-100 g) wurden mit Nembutal (i.p.;
60 mg/kg) narkotisiert. Nach Einbinden eines PE 10 Katheters in die A. femoralis
wird das Tier auf eine Präparierbühne nach Duling (MVR 5, 423 (1973)) gelegt und
die rechte Backentasche durch Einführen eines Q-Tips herausgezogen. Sie wird vorsichtig
in den dafür vorgesehenen Teil der Bühne gezogen, ausgespannt und fixiert.
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Ab Beginn der Präparation wird die vorbereitete Backentasche mit 5
ml/Min. Superfusat überspült. Die Temperatur der Lösung beträgt 360C. Unter Schonung
der Gefäße wird die obere Gewebsschicht längs durchtrennt und zur Seite geklappt.
Bei ca. 200-facher Vergrößerung wird eine Fläche von ca. 1 cm2 von Bindegewebe vorsichtig
freipräpariert. Das Tier wird mit der Präparierbühne auf den Objekttisch des Mikroskops
gelegt. Ein Thermo-
fühler wird in die linke Backentasche eingeführt.
Die Körpertemperatur des Tieres wird so kontrolliert und mit Hilfe einer IR-Lampe
(250 Watt) auf 36 + 0.30C gehalten.
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Die Messung der Leukozytenklebrigkeit wird bei ca. 500-facher Vergrößerung
vorgenommen. In dem freipräparierten Feld wird eine Venüle (30 - 40 iim ) ausgewählt.
In einem bestimmten Abschnitt dieses Gefäßes wird die Anzahl der pro Zeiteinheit
(Min.) vorbeiwandernden Leukozyten gezählt.
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Die i.a. Applikation der Pyrazolonderivate in 1 % wäßriger Tylose-Suspension
führte zu folgenden Ergebnissen:
Tabelle 3
| Verbindung Dosis Erhöhung der Wirkdauer |
| (mg/kg) Leukozytenzahl (%) (Minuten) |
| 1 0,1 75 30 |
| 2 1 25 30 |
| 3 1 200 >>60 |
| 4 0,1 35 40 |
| 5 1 200 30 - 50 |
| 6 1 30 20 - 30 |
Verbindung 1 Verbindung 2 Verbindung 3 Verbindung 4 Verbindung 5 Verbindung 6
Beispiel 4 Wirkung der Pyrazolonderivate am nach Langendorff perfundierten
Kaninchenherzen Von den Kaninchen (bis ca. 2 kg) wurde das Herz unter Nembutal-Narkose
entnommen und an der Aorta sowie an der A. pulmonalis kanüliert. Zur Messung der
isovolumetrischen Kontraktionen wurde ein flüssigkeitsgefüllter Ballon aus Silikonkautschuk
über den linken Vorhof in den linken Ventrikel eingeführt. Über eine Flüssigkeitsbrücke
war der Ballon mit einem Flüssigkeitsaufnehmer (Statham P 23 Db) verbunden. Der
Perfusionsdruck wurde mit einem Druckaufnehmer, der vor der Aortenkanüle des Herzens
über ein T-Stück mit dem Perfusionssystem verbunden war, aufgenommen. Die Registrierung
von Kontraktionskraft und Perfusionsdruck erfolgte mit dem Schnellschreiber Gould
2600 S. Die Herzen wurden elektrisch stimuliert mit der Frequenz 180/Min., Reizdauer
5 msec.
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Die Perfusion des Herzens erfolgte mit Krebs-Henseleit-Lösung (KH-Lösung),
die mit Carbogen (95 % 02, 5 % CO2) oder mit der Gasmischung 2 % °2' 5,6 % CO2,
Rest N2 begast wurde. Das Perfusionsvolumen betrug 20 ml/Min.
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das über eine Rollenpumpe (Fa. Desaga, 132100) eingestellt war. Die
Zugabe des Pyrazolonderivats (in 1 % wäßriger Tylose-Suspension) und der Thrombozytensuspensionen
(aus denselben Kaninchen, aus denen das Herz entnommen ist, gewonnen) erfolgte mit
Hilfe von Infusionspumpen
(Rollenpumpen, Fa. Braun-Melsungen),
wobei die Lösung oder Suspension mit der Fließgeschwindigkeit von 0,2 bzw. 0,1 ml/Min.
aus einer Infusionsspritze über einen Taigonschlauch und eine feine Kanüle kurz
vor dem Herzen in den zuführenden Schlauch infundiert wurde.
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7 Die Endkonzentration der Thrombozyten betrug 1 x 10 /ml KH-Lösung.
Die aus dem Herzen (Kanüle in A. pulmonalis) fließende Lösung wurde periodisch unter
Eiskühlung aufgefangen. Zur Messung der Konzentrationen von Thromboxan als TXB2
und von Prostacyclin als 6-Keto-PGF1 deren Bestimmung mit Hilfe von Radioimmunassays
erfolgte, wurden aliquote Volumenanteile gefriergetrocknet und in einem Zehntel
des ursprünglichen Volumens mit Wasser aufgenommen.
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Die in den Versuchen gefundenen Werte des Perfusionsdruckes bei Gabe
des Wirkstoffes im Vergleich zur Kontrolle sind aus der nachfolgenden Tabelle 4
ersichtlich:
Tabelle 4 Perfusionsdruck in g des Nullwertes
| 1.Phase 2.Phase 3.Phase 4.Phase 5.Phase |
| Kontrollversuch 100 155 - 83 214 |
| Verbindung 1 100 274 108 82 |
| Verbindung 2 100 176 107 83 103 |
1. Phase Vorphase; Begasung mit Carbogen 2. Phase Normoxie; Begasung mit Carbogen;
Zusatz von 1.107 Thrombozyten/ml; Dauer: 5 Minuten 3. Phase wie 2. Phase; Zusatz
von 1.10 5 g/ml Pyrazolonderivat; Dauer: 5 Minuten 4. Phase wie 3. Phase, jedoch
Begasung mit nur 2 % O2 (Hypoxie); Dauer: 10 Minuten 5. Phase wie 3. Phase (Reoxygenierung).
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Verbindung 1 Verbindung 2
Die Ergebnisse zeigen bei Zusatz von Thrombozyten in die Perfusionslösung
einen signifikanten Anstieg des Perfusionsdruckes im Vergleich zur Vorphase. Wird
in der nachfolgenden Phase mit sauerstoffarmer Lösung perfundiert (2 % °2)' so fallen
der Perfusionsdruck und die Kontraktionskraft stark ab. Bei anschließender Reoxygenierung
(Carbogenbegasung) erholt sich die Kontraktionskraft auf annähernd gleiche Werte
wie vor der Hypoxieperiode; der Perfusionsdruck steigt jedoch über das Druckniveau
der ersten Carbogenphase hinaus an.
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Überraschend ist, daß die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyrazolonderivate
den Anstieg des Perfusionsdruckes, der durch Zusatz von Thrombozyten zur Perfusionslösung
in der ersten und zweiten Carbogenphase bewirkt wird, signifikant inhibieren. Besonders
ausgeprägt zeigt sich diese Wirkung nach der Hypoxiephase in der Reoxygenierungsphase.
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Beispiel 5 Wirkung der Pyrazolonderivate auf experimentellen Herzinfarkt
des Hundes Die Wirkungen verschiedener Pyrazolonderivate auf den experimentellen
Herzinfarkt wurden im Hund nach akuter Unterbindung einer Koronararterie untersucht.
Bei Pentobarbital-narkotisierten Hunden wurde die vordere absteigende linke Koronararterie
(LAD) proximal langsam für 6 Stunden unterbunden. Die Arterie wurde nicht reperfundiert.
Eine Stunde vor Ligatur wurde das Pyrazolonderivat in 1 %iger wäßriger Tylosesuspension
intraduodenal als Bolus gegeben. In den Kontrollen wurde gleichermaßen vorgegangen,
jedoch ohne Wirkstoffgabe.
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Die Infarktgröße und das Perfusionsgebiet der LAD wurden durch eine
duale Perfusionsmethode mit Evans-Blau und Triphenyltetrazolium Chlorid dargestellt.
Nach der graduellen, langsamen LAD-Unterbindung verkleinerte das Pyrazolonderivat
den Infarkt beträchtlich. Dies war zu beobachten sowohl in Bezug auf das absolute
Infarktgewicht als auch in Bezug auf die Infarktgröße relativ zum linken Ventrikelgewicht.
Die Perfusionsgebiete der unterbundenen Arterien waren gleich. Initial sank als
Folge der Koronarligatur der Blutdruck, was zur reflektorischen Herzfrequenzsteigerung
führte. Sonst wurden keine durch Pyrazolonderivate verursachten, hämodynamischen
Wirkungen gesehen. Die Verbindungen verminderten die Infarkt-bedingten Erhöhungen
der ST-Segmente und der R-Zacke des peripheren EKG als Ischämiezeichen
was
auf elektrophysiologische Wirkungen schließen ließ.
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Literatur: Lucchesi et al., J.Pharmacol.Exp. Ther. 199: 310, 1978;
Fiedler, Basic Res.Cardiol. 78: 266, 1983.
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Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen zusammengefaßt.
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N Zahl der im jeweiligen Experiment untersuchten Hunde N1 Zahl der
durch die Ligatur getöteten Hunde.
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(Vergleich)
Verbindung 3:
Tabelle 1 Mortalität nach 6 h LAD-Ligatur
| Verbindung N Dosis Mortalität |
| (mg/kg) (N1) |
| 1 4 1 . |
| 4 3 0 |
| 6 10 |
| 4 1 3 |
| 4 3 0 |
| 8 10 0 |
| 3 2 10 0 |
Tabelle 2 Zeit, nach welcher Exitus durch Kammerflimmern eintritt; insgesamt 4 h
LAD-Ligatur
| Verbindung N Dosis N1 Exitus nach |
| (mg/kg) |
| 5 10 2 14 min 23 sec.; |
| 14 3 2 25 min 40 sec.; |
| 3 h 21 min |
| 4 1 3 24 min; 35 min; |
| 2 h 2 min. |
| 8 10 - |
| 2 4 3 - |
| 4 1 2 2 h 25 min; |
| 3 h 45 min |
| 3 0,5 1 2 h 16 min |
Tabelle 3 Größe des Infarkts nach 6 h LAD-Ligatur
| Dosis N Gewicht des Infarktgröße |
| linken Ventrikels Gewicht % des linken |
| (g) (g) Ventrikels |
| Kontroll- 8 97,3 + 4,3 24,1+3,4 24,8+2,8 |
| gruppe |
| 10 mg/kg |
| Verbin- 8 95,2 + 3,2 12,1+1,9 12,7+2,1 |
| dung 2 |