DE3317551A1

DE3317551A1 - Perfusionseinrichtung zum "in vitro"-bespuelen verankerungsabhaengiger biologischer zellsysteme

Info

Publication number: DE3317551A1
Application number: DE19833317551
Authority: DE
Inventors: Stephan Dipl.-Chem. Dr.rer.nat. 8000 München Nees
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-05-13
Filing date: 1983-05-13
Publication date: 1984-11-15
Also published as: US4762794A; DE3317551C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Perfusionseinrichtung zum Bespülen von durch eine Unterlage getragenen biologischen Zellsystemen nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1 .

Zur Untersuchung gerichteter, biologischer, physiologischer, biochemischer und pharmakologischer Prozesse ist es wünschenswert, physiologische Zellschichten, die in Pflanze, Tier oder Mensch Grenzflächen zwischen verschiedenen Körperbereichen mit entsprechenden Aktivitäten bilden, dadurch nachzubilden, daß Zellen dieser Zellarten außerhalb der natürlichen Umgebung im "In-Vitro"-System einer Gewebekultur auf einer porösen oder semi-permeablen Unterlage gezüchtet werden. Dabei handelt es sich bei den Zellarten beispielsweise um Endothelien der Blutgefässe, Lymphgefässe usw. oder um Epithelien des Darmes, der Bronchien und der Niere usw. Bei den an den Grenzflächen ablaufenden Aktivitäten handelt es sich beispielsweise um enzymatische Prozesse, um die Abgabe von stoffen(Metabolite, Hormone etc.) aus den Zellen der Zeilschicht an die Umgebung, um die Aufnahme von Stoffen aus der Umgebung in die Zellen oder um einen Transport von Stoffen von der luminalen Seite der Zellen durch die Zellen zur basalen Seite der Zellen und umgekehrt.

Um die zuvor geschilderten Aktivitäten bzw. Prozesse genau studieren zu können, werden die entsprechenden Zellen auf einer in einer Halte- und Spannvorrichtung befindlichen Unterlage, bei der es sich vorzugsweise um einen porösen

Filter, der beispielsweise aus Celluloseacetat oder PoIycarbonat besteht und eine Porengröße bis zu 0,5 μΐη aufweist, oder bei der es sich um eine Dialysemembran handelt, einseitig aufgezüchtet. Die so auf der Unterlage etablierte Zellschicht wird anschließend in eine Perfusionskammer gebracht, in der sich eine an der Zellschicht vorbeiströmende Perfusionsflüssigkeit befindet. Während der Passagezeit wird die Perfusionslösung durch die biologischen Aktivitäten der Zellen in ihrer Zusammensetzung verändert. Das Ausmaß der Zellaktivitäten kann deshalb durch eine quantitative, vergleichende Untersuchung der Zusammensetzung von zuströmender und abströmender Perfusionsflüssigkeit erfaßt werden.

Um die Zellschicht in der Perfusionskammer unter vollkommener Erhaltung ihrer morphologischen Struktur und physiologischen Funktion studieren zu können, ist es erforderlich, daß ihre Unterlage schon während der Etablierung der Zellschicht (noch außerhalb des Perfusionssystems im Gewebekulturlabor) in einer Halte- und Spannvorrichtung angeordnet ist und diese später ohne mechanische Krafteinwirkung auf die Unterlage bzw. die Zellen für die Untersuchungen in das Perfusionssystem eingesetzt werden kann.

Bei den genannten Untersuchungen besteht ein weiteres Problem darin, daß es schwierig ist, die Perfusionsflüssigkeit in einer geeigneten Weise der Zellkammer (Perfusionskammer) zuzuführen und von dieser zur Meßseite (Ausflußseite) wegzubefördern. Bekannterweise wird dies, dadurch bewerkstelligt, daß die Perfusionsflüssigkeit auf einer Seite der die Unterlage enthaltenen Kammer durch einen Zugang kontinuierlich zugeführt und auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer durch einen Ausgang abgeleitet wird. Bei einer derartigen Anordnung verteilt sich die zufließende Flüssigkeit je nach Kammersymmetrie unterschiedlich auf die ein-

zelnen Bereiche der Kammer, bevor sie gebündelt wieder abfließt; entsprechend wird die in der Kammer befindliche Zellschicht in ihren einzelnen Bereichen mehr oder weniger gut bespült. Untersuchungen der aus der Kammer ausströmenden Perfusionsflüssigkeit ergeben in diesen Fällen keine genauen Ergebnisse, weil plötzlich beginnende oder endende Prozesse an den Zellen, welche die die Zellen umgebende Perfusionsflüssigkeit in irgendeiner Weise verändern, infolge der unterschiedlich langen Strömungswege zwischen dem Zugang und dem Ausgang der Kammer nur verzögert bzw. "verwischt" an der Ausström- bzw. Meßseite der Kammer gemessen werden können. Im Laborjargon wird dieser nachteilige Vorgang als sogenanntes "Schwänzen" bezeichnet.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, eine Einrichtung zum Bespülen einer auf einer in einer Halte- und Spannvorrichtung befindlichen Unterlage aufgezüchteten Zellschicht in einer Perfusionskammer anzugeben, durch die eine scharf eluierende (auswaschende) Perfusion und damit eine genaue Messung der an den Zellen ablaufenden Prozesse möglich ist.

Diese Aufgabe wird durch eine Einrichtung gelöst, die durch die in dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruches angegebenen Merkmale gekennzeichnet ist.

Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß - bei weitgehender mechanischer Schonung der Zellen - durch eine insbesondere zeitlich gesehen genaue Erfassung der an den Zellen der Zellschicht ablaufenden Prozesse eine genaue Imitation der physiologischerweise z.B. an den Endothelien von Blutgefässen oder Lympfgefässen usw. und an den Epithelien des Darmes, der Bronchien, der Niere usw. ablaufenden Vorgänge im "In Vitro"-Versuch möglich ist.

Insbesondere besteht ein weiterer wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, daß ein Bespülender auf einer porösen bzw. semi-permeablen Unterlage aufgezüchteten lückenlosen Zeilschicht von beiden Seiten erfolgen kann, so daß insbesondere auch die Vorgänge erfaßbar und reproduzierbar sind, bei denen ein Transport durch die Zeilschicht von der apikalen Seite der Zellen zu der basalen Seite der Zellen und umgekehrt erfolgt.

Vorteilhafterweise ist die erfindungsgemäße Einrichtung so aufgebaut, daß sie schnell und einfach zum Austausch einer in der Perfusionskammer enthaltenen ,in einer Halte- und Spannvorrichtung befindlichen Unterlage auseinandergebaut werden kann. Beim Zusammenbau der Einrichtung wird eine eingesetzte Halte- und Spannvorrichtung vorteilhafterweise so aufgenommen, daß automatisch die nach allen Seiten dichte Perfusionskammer entsteht.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die erfindungsgemäße Einrichtung auch über einen langen Zeitraum äußerst zuverlässig und sicher arbeitet und leicht durch gasförmige Sterilisierungsmittel aseptisch gemacht werden kann.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor.

Im folgenden werden die Erfindung und deren Ausgestaltungen im Zusammenhang mit den Figuren näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 einen Schnitt durch die einzelnen Teile

einer zerlegten erfindungsgemäßen Einrichtung ;

Fig. 2 eine Seitenansicht der erfindungsgemäßen

Einrichtung,

Fig. 3 einen Schnitt durch die zusammengebaute Einrichtung und

Fig. 4 eine vereinfachte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Einrichtung.

In der Fig. 1 ist ein erstes blockförmiges Gehäuseteil der erfindungsgemäßen Einrichtung mit 1 bezeichnet. Ein zweites blockförmiges Gehäuseteil der Einrichtung ist mit 6 bezeichnet. Die beiden Gehäuseteile 1 und 6 sind durch in der Fig. 1 nicht dargestellte Befestigungseinrichtungen aneinander befestigbar. Beispielsweise handelt es sich bei derartigen Befestigungseinrichtungen um Schrauben, die durch Bohrungen 25 des Gehäuseteiles 1 hindurchgeführt werden und in mit Innengewinde versehenen Sackbohrungen 65 des Teiles 6 verschraubt werden. An den sich im zusammengebauten Zustand gegenüberliegenden Flächen der Gehäuseteile 1 und 6 sind Vertiefungen 24 bzw. 64 vorgesehen, die vorzugsweise an ihrem Umfang jeweils eine Rille 23 bzw. 63 aufweisen, die sich weiter in das Gehäuseteil 1 bzw. 6 hineinerstrecken als die Vertiefung 24 bzw. 64. Seitlich neben den Vertiefungen stehen die Randbereiche der Gehäuseteile 1 bzw. 6 zweckmäßigerweise über, so daß bei deren Zusammensetzen zwischen ihnen die Kammer gebildet wird.

Vorzugsweise sind die Vertiefungen 24 bzw. 64 kreisförmig und die Rillen 23 bzw. 63 kreisringförmig ausgebildet.

Von dem Boden der Vertiefung 24 aus erstreckt sich eine

Ausnehmung bzw. Bohrung 22 eine vorgegebene Strecke tief in das Gehäuseteil 1 hinein. Diese Bohrung mündet in einen Ausgang 21, der vorzugsweise ebenfalls die Form einer Bohrung aufweist, deren Längsachse beispielsweise senkrecht zur Längsachse der Bohrung 22 verläuft, so daß sich die den Ausgang 21 bildende Bohrung in der aus der Fig. 1 ersichtlichen Weise zum oberen Ende des Gehäuseteils 1 hin öffnet.

In der entsprechenden Weise verläuft vom Boden der Vertiefung 64 des Gehäuseteils 6 aus eine Ausnehmung bzw. Bohrung 62 in das Teil 6 hinein. Diese Bohrung 62 steht mit einem weiteren Ausgang bzw. einer weiteren Bohrung 61, deren Längsachse sich vorzugsweise senkrecht zur Längsachse der Bohrung 62 erstreckt, in Verbindung.

In der entsprechenden Weise verläuft eine weitere Ausnehmung bzw. Bohrung 26 vom Boden der Vertiefung 24 in das Gehäuseteil 1 hinein und steht mit einem Zugang, vorzugsweise einer Bohrung 27 in Verbindung, deren Längsachse sich vorzugsweise derart senkrecht zur Längsachse der Bohrung 26 erstreckt, daß sich der Zugang 27 zu einer Seitenfläche des Gehäuseteils 1 öffnet.

Entsprechend erstreckt sich zur Bildung eines weiteren Zuganges vom Boden der Vertiefung 64 aus eine Ausnehmung bzw. Bohrung 66 in das Gehäuseteil 6 hinein, die mit einer senkrecht zur Längsachse der Bohrung 66 verlaufenden Ausnehmung bzw. Bohrung in Verbindung steht, die den zu einer Seitenfläche des Gehäuseteils 6 führenden weiteren Zugang der Einrichtung bildet.

Vorzugsweise bestehen die Gehäuseteile 1 und 6 aus einem autoklavierbaren Material, bei dem es sich beispielsweise um ein nichtrostendes Metall handelt.

In der aus der Fig. 1 ersichtlichen Weise ist ein scheibenförmiges, flexibles Teil 4, bei dem es sich vorzugsweise um ein autoklavierbares Silikongummiteil mit einem ringförmigen in die Rille 2 3 eingreifenden Ansatz 41 handelt, in die Vertiefung 24 eingesetzt. Das Teil 4 weist außerdem in die Bohrungen 22 und 26 hineingreifende einstückig mit dem Teil 4 ausgebildete Vorsprünge 42 bzw. 45 auf. Durch die VorSprünge 42 bzw. 45 und das Teil 4 verlaufen jeweils Durchgänge 43 bzw. 48, die jeweils die freie Oberfläche des Teiles 4 mit dem Ausgang 21 bzw. mit dem Zugang 27 verbinden. In der entsprechenden Weise ist in die Vertiefung 64, die Bohrungen 62 und 66 und die Rille 63 des Gehäuseteiles 6 ein weiteres scheibenförmiges, flexibles Teil 7, vorzugsweise ein autoklavierbares Silikongummiteil mit einem Ansatz 71, Vorsprüngen 72 und 75 und Durchgängen 73 und 78 eingesetzt. Dabei sind die Teile 4 und 7 so bemessen, daß sie die Vertiefungen 24 bzw. 64, die Rillen 23 bzw. 63 und die Bohrungen 22 bzw. 62 und 26 bzw. 66 im eingesetzten Zustand ausfüllen.

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Insbesondere sind die Vorsprünge 42, 72, 45, 75 so dimensioniert, daß ihre ümfangsbereiche dichtend an den Innenwandungen der entsprechenden Bohrungen 22, 62, 26, 66 anliegen,

Zweckmäßigerweise sind an wenigstens einem der Teile 4 bzw. 7 die Halte- und Spannvorrichtung 5, in der die die Zellschicht 54 tragende unterlage 52 eingespannt ist, aufnehmende Justiernasen 44 derart vorgesehen, daß die zwischen die Justiernasen 44 eingesetzte Halte- und Spannvorrichtung 5 konzentrisch zur Längsachse der Vertiefung 24 angeordnet ist.

In einem weiter vertieften Bereich 29, der vom Boden der Vertiefung 24 aus in das Gehäuseteil 1 hineinverläuft und vorzugsweise konzentrisch zur Längsachse der Vertiefung 24 angeordnet ist, befindet sich eine Platte 35, die vorzugsweise aus nichtrostendem Stahl besteht. Diese Platte 35 stellt einen Teil einer Membranpumpe dar, die nachfolgend noch im einzelnen erläutert werden wird. In der entsprechenden Weise ist in einem weiter vertieften Bereich 69 im Gehäuseteil 6, der vom Boden der Vertiefung 64 aus in das Gehäuseteil 6 hineinragt und vorzugsweise konzentrisch zur Längsachse der Vertiefung 64 angeordnet ist, eine vorzugsweise ebenfalls aus rostfreiem Stahl bestehende Platte 85 vorgesehen, die Teil einer weiteren Membranpumpe ist.

Durch diese Membranpumpen sind die Platten 35 und 85 in Richtung der Pfeile 39 bzw. 89 bewegbar, so daß die Teile 4 bzw. 7 ebenfalls in Richtung der Pfeile 3 9 bzw. 89 bewegt werden. In dem Ausgang 21 und in dem Ausgang 61 ist jeweils ein Einwegventil 211 bzw. 611 vorgesehen, die es

ermöglichen, daß die Perfusionsflüssigkeit nur in Richtung der Pfeile 222 bzw. 622 fließt. In der entgegengesetzten Richtung kc.nn die Perfusionsflüssigkeit nicht fließen. In ähnlicher Weise sind in den Zugängen 46 und 68 Einwegventile 461 bzw. 681 vorgesehen, die lediglich eine Strömung der Perfusionsflüssigkeit von außen in den Durchgang 48 bzw. 78 hinein ermöglichen (Fig. 2).

In der Fig. 2, die eine Seitenansicht des Gehäuseteiles zeigt, betreffen die in Klammern befindlichen Bezugszeichen Elemente des Gehäuseteiles 2, dessen Seitenansicht der Einfachheit halber nicht eigens dargestellt ist, da sie der Seitenansicht des Gehäuseteiles 1 weitgehend entspricht.

Der vorzugsweise Aufbau der Ventile wird nun im Zusammenhang mit den in Fig. 1 und 2 dargestellten Ventilen erläutert. Fig. 1 zeigt die im Ausgang 21 bzw. 61 angeordneten Einwegventile 211 bzw. 611. Fig. 2 zeigt außerdem die im Zugang 27 bzw. 6 7 angeordneten Einwegventile 461 bzw. 681. Vorzugsweise besteht jedes Einwegventil aus einem scheibenförmigen Ventilkörper 9, in dem sich eine Öffnung 91 befindet. An einer Oberfläche des scheibenförmigen Ventilkörpers 9 ist eine zweckmäßigerweise einstückig mit dem Ventilkörper 9 ausgebildete scheibenförmige Klappe vorgesehen, die je nachdem, von welcher Richtung aus Druck auf sie ausgeübt wird, die Öffnung 91 verschließt oder nicht. Die Öffnung 91 wird genauer gesagt dann nicht durch die Klappe 92 verschlossen, wenn der Druck durch die öffnung 91 hindurch auf die Klappe 92 einwirkt. Im umgekehrten Fall wird die Klappe 92 fest gegen die ihr zugewandte Oberfläche des Ventilkörpers 9 gepreßt. Dadurch wird die Öffnung 91 verschlossen. Vorzugsweise bestehen der Ventilkörper 9 und die Klappe 92 aus Silikongummi. Um eine präzise und leichte Anordnung eines Ven-

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tiles in dem Ausgang 21 bzw. 61 oder dem Zugang 27 bzw. 67 zu ermöglichen, sind vorzugsweise,wie dies die Fig. 2 zeigt, in diesen Gängen nach innen ragende Schultern 93 vorgesehen, an denen ein Randbereich des Ventilkörpers 9 zur Anlage gelangt, wenn das Ventil von außen in einen Zugang bzw. in einen Ausgang hineinaeschoben wird. Um das Ventil in der richtigen Lage zu halten, werden jeweils von außen einen Durchgang aufweisende Einsatzteile in den Gängen vorzugsweise verschraubt, wobei die unteren Enden der Einsatzteile 95 an.dem Ventilkörper 9 dichtend anliegen und diesen gegen die Schultern 93 pressen. Im Falle der Anordnung der Fig. 1 pressen die unteren Enden der Einsatzteile 91 die Ventilkörper direkt gegen die ihnen zugewandten Flächen der Vorsprünge 42 bzw. 73.

Die scheibenförmigen Körper der Ventile liegen mit ihren Umfangsbereichen jeweils dichtend an den Innenwandungen der ihnen zugeordneten Bohrungen an.

Um bei einer Bewegung der Platten 35 bzw. 85 in die Richtung der Pfeile 39 bzw. 89 das Entstehen eines Unterdrukkes hinter den Teilen 4 bzw. 7 zu verhindern, sind die insbesondere auch aus der Fig. 2 ersichtlichen Durchgänge 28 in dem Gehäuseteil 1 bzw. 6 vorgesehen, die eine Verbindung zwischen dem Boden der Vertiefung 24 bzw. 64 und der Umgebung herstellen. Wie aus der Fig. 2 ersichtlich ist, sind mehrere derartige Durchgänge gleichmäßig um die Längsachse der Vertiefungen 24 bzw. 64 verteilt. In Fig. 1 ist aus Gründen der Einfachheit für jedes Gehäuseteil 1, 6 jeweils nur ein Durchgang dargestellt.

Die Platten 35 bzw. 85 stehen jeweils über Abstandsteile bzw. 83, die in Durchgängen des Behäuseteils 1 bzw. 6 angeordnet sind, mit einer weiteren Platte 3 bzw. 8 in Verbindung, die in Ausnehmungen 40 bzw. 80 des Gehäuseteiles 1 bzw. 6 angeordnet sind, wobei sich die Ausneh-

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mungen 40 bzw. 80 jeweils an der den Ausnehmungen 24 bzw. 64 gegenüberliegenden Seiten der Gehäuseteile 1 bzw. 6 befinden. Die Platten 3 bzw. 8 sind jeweils mit den Abstandsteilen 33 durch Befestigungseinrichtungen starr verbunden, bei denen es sich zweckmäßigerweise um Schrauben 30 (Fig.2) handelt, die in Innengewinde der Abstandsteile 33 eingreifen. In der entsprechenden Weise sind auch die Platten 3 5 bzw. 85 an den Abstandsteilen 33 bzw. 83 befestigt, so daß eine starre Verbindung zwischen den jeweiligen Platten 3 und 35 bzw. 8 und 85 besteht. Um eine Bewegung der Abstandsteile 33 in den ihnen jeweils zugeordneten Bohrungen zu ermöglichen bzw. zu erleichtern, ist vorzugsweise jeweils zwischen dem Außenumfang eines Abstandsteiles 33 und der Innenwandung einer zugeordneten Bohrung eine reibungsvermindernde Hülse 32 angeordnet.

In sich vom Boden der Vertiefungen 40 bzw. 80 in die Gehäuseteile 2 bzw. 6 hineinerstreckenden Ausnehmungen sind Energiespeicher, vorzugsweise Schraubenfedern 36 bzw. vorgesehen, die die Platten 3 bzw. 8 und die damit verbundenen weiteren Teile in einer definierten Lage halten, in der die Platten 35 bzw. 85 etwa an den ihnen jeweils zugewandten Seiten der Teile 4 bzw. 7 anliegen. Beispielsweise erfolgt die Bewegung der Platten 35 bzw. 85 in Richtung der Pfeile 39 bzw. 89 dadurch, daß in Halteeinrichtungen 37 bzw. 87 der äußeren Platten 3 bzw. 8 drehbar gelagerte Nockenfolger 38 bzw. 88, die vorzugsweise als Rollen ausgebildet sind, durch nicht dargestellte Nockenscheiben in Richtung der Pfeile 39 bzw. 89 bewegt werden. Wenn die Nockenscheiben keine Kraft auf die Nockenfolger 38 bzw. 88 ausüben, werden die Platten 3 bzw. 8 und die damit verbundenen weiteren Teile durch

die Kraft der Federn 36 bzw. 86 entgegen der Richtung der Pfeile 39 bzw. 89 in die vorgenannten definierten Lagen bewegt.

Bei der erfindungsgemäßen Einrichtung wird die Begrenzung des Hubes der Platten 39 bzw. 89 durch die Bemessung der Dicken der Platten 3 bzw. 8 und der Tiefen der Ausnehmungen 29 bzw. 6 9 erreicht. Der mögliche Hub entspricht dabei dem Abstand zwischen dem Boden der Ausnehmung 40 bzw. 80 und der dem Boden zugewandten Seite der Platte 3 bzw, 8, wenn sich diese in der definierten Lage befindet. Durch die Hubbegrenzung werden Beschädigungen der auf die Unterlage aufgewachsenen Zellen durch die sich bewegenden Teile 4 bzw. 7 vermieden.

Im Zusammenhang mit der Fig. 3, die die zusammengesetzten Tile 1 und 6 zeigt, wird nun die Funktion der erfindungsgemäßen Einrichtung zur beidseitigen Bespülung der auf einer Unterlage angeordneten Zellschicht näher erläutert. Beispielsweise wird die Unterlage 52 von einer Halte- und Spannvorrichtung 5 gehalten, die aus zwei konzentrischen Ringen 51 und 53 besteht, die im Randbereich der Unterlage 52 zusammengedrückt werden. Die auf einer Seite der Unterlage 52 aufgewachsene Zellschicht ist mit 54 bezeichnet. Beim Zusammenbau der Gehäuseteile 1 und 6 wird die Halte- und Spannvorrichtung 5, wie dies bereits erläutert wurde, zwischen den Nasen 44 justiert. Wenn die Gehäuseteile 1 und 6 danach aneinander verschraubt werden, werden die Flächen der konzentrischen Ringe 51 bzw. 53, die den aus dem Gummimaterial bestehenden Teilen 4 bzw. 7 zugewandt sind, so gegen die Teile bzw. 7 gepreßt, daß auf jeder Seite der Unterlage 52 eine dichte Kammer A bzw. B entsteht. Dabei steht die Kammer A

über den Durchgang 43 mit dem Ausgang 21 und über den Durchgang 48 mit dem Zugang 46 in Verbindung. Die Kammer B steht über den Durchgang 73 mit dem Ausgang 61 und über den Durchgang 78 mit dem Zugang 6 8 in Verbindung. Dabei werden in der Kammer A die an der apikalen Seite der Zellschicht ablaufenden Prozesse erfaßt. In der Kammer B werden dagegen die an der basalen Seite der Zellschicht ablaufenden Prozesse erfaßt, über die in den Ausgängen und Zugängen befindlichen Einsatzteile 95 und damit verbundene Schlauchleitungen (nicht dargestellt) erfolgt eine Verbindung zu äußeren Einrichtungen, von denen aus die Perfusionsflüssigkeit unter hydrostatischem Druck zugeführt bzw. zu denen die Perfusionsflüssigkeit zur Vornahme der Untersuchungen bzw. Messungen abgeführt wird. Dabei funktioniert die erfindungsgemäße Einrichtung in der Weise, daß bei einer durch die Nockenfolger 38 bzw. 88 bewirkten Bewegung der Platten 35 bzw. 85 und damit der Teile 4 bzw. 7 in Richtung der Pfeile 39 bzw. 89 Perfusionsflüssigkeit aus den Kammern A bzw. B durch die Durchgänge 43 bzw. 73, die Ventile 221 bzw. 611 zu den Ausgängen 21 bzw. 61 befördert wird. Dabei wird in den Kammern A und B befindliche Perfusionsflüssigkeit bei diesem Vorgang gleichzeitig auch infolge einer eintretenden Verwirbelung vermischt, so daß die durch die ablaufenden Prozesse bedingten Veränderungen der Perfusionsflüssigkeit bzw. die darin gelösten Inhaltsstoffe gleichmäßig über die Kammern A bzw. B verteilt sind. Während dieses Vorganges sind die in den Zugängen 2 7 bzw. 67 jeweils vorgesehenen Ventile 461 bzw. 681 (Fig. 2) geschlossen. Bei der Bewegung der Platten 35 bzw. 85 in der entgegengesetzten Richtung der Pfeile bzw. 89 werden die in den Ausgängen 21 bzw. 61 angeord-

neten Ventile 221 bzw. 611 jeweils geschlossen. Gleichzeitig werden die in den Zugängen 2 7 bzw. 68 jeweils vorgesehenen Ventile geöffnet, so daß Perfusionsflüssigkeit in die Kammern A bzw. B einströmen kann. Gleichzeitig erfolgt auch bei dieser Bewegung der Platten 35 bzw. 85 eine erneute Verwirbelung und Vermischung der in den Kammern A und B enthaltenen Perfusionsflüssigkeit.

Um eine Einwirkung von einseitig gerichteten Kräften auf die auf der Unterlage 52 aufgewachsene Zellschicht 54 von der dieser Zellschicht 54 gegenüberliegenden Seite der Unterlage 52 aus zu vermeiden, die zu einer Beschädigung und Ablösung der Zellschicht 54 von der Unterlage 52 führen könnte,werden die Nockenfolger 38 bzw.88 vorzugsweise so angesteuert, daß sich die Platten 35 bzw. 85 gleichphasig, d.h. gleichzeitig in Richtung der Pfeile 39 bzw. 89 (oder umgekehrt) bewegen. Auf diese Weise wird erreicht, daß sich die von beiden Seiten auf die Unterlage 52 und die darauf aufgewachsene Zellschicht 54 einwirkenden Kräfte, die gleichgroß sind, kompensieren und daß auf die Zellen nur durch die Strömung der Perfusionsflüssigkeit bewirkte Scherkräfte einwirken, die beispielsweise der physiologischen Blutströmung entsprechen.

In der Fig. 4 ist eine vereinfachte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Einrichtung dargestellt, bei der nur eine einzige Membranpumpe vorhanden ist. Die Halte- und Spannvorrichtung 51, 53 mit der darin befindlichen Unterlage 52, auf die die Zellschicht 54 aufgezüchtet ist, liegt einerseits an dem Teil 4 an,das in dem bereits beschriebenen Gehäuseteil 1 enthalten ist. An der Stelle des Gehäuseteiles 6 ist bei der vereinfachten Ausführungsform ein Gehäuseteil 6" vorgesehen, das keine Membranpumpe

aufweist. Dabei liegt die Halte- und Spannvorrichtung 51, 53 an der dem Gehäuseteil 6' zugewandten Seite an einem scheibenförmigen Teil 7¹ aus silikongummiartigern Material dichtend an, wenn die Gehäuseteile 1 und 6' miteinander in der früher berexts beschriebenen Weise verbunden sind.

Bei dieser vereinfachten Ausführungsform wird die Perfusionsflüssigkeit lediglich durch den Teil der Kammer gepumpt, der zwischen der Unterlage 52 und dem Teil 4 des Gehäuseteiles 1 angeordnet ist.

Eine derartig vereinfachte Ausführungsform der Erfindung ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn nur Vorgänge untersucht werden sollen, die unmittelbar zwischen den einzelnen Zellen der Zellschicht 54 und der sie überströmenden Perfusionsflüssigkeit ablaufen.

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Claims

Dlpl.-lng. Nikolaus von Puflkarner 0017 irr 1 Patentanwalt 3 ό « /00 I Zugelassen beim Europäischen Patentamt Postadresse: Pienzenauerstraße 2 8000 München 80 Telefon: (089) 980324 und 9872 Telex: 522767 P 3314 N Dr. rer. nat. Stephan Nees Waldwiesenstraße 30b 8000 München 70 Perfusionseinrichtung zum "In Vitro"-Bespülen verankerungsabhängiger biologischer Zellsysteme Patentansprüche

1. Perfusionseinrichtung zum Bespülen von durch eine Unterlage getragenen biologischen ein- oder mehrreihigen Zellsystemen, wobei die Unterlage und' das darauf aufgezüchtete Zellsystem in einer einen Zugang und einen Ausgang aufweisenden Kammer einsetzbar sind und wobei eine Vorrichtung vorgesehen ist, durch die der Kammer eine Perfusxonsflüssigkext über den Zugang zuführbar und über den Ausgang entnehmbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (38, 37, 33, 35) so ausgebildet ist, daß sie ein wenigstens einen Teil einer Wand der Kammer

bildendes flexibles erstes Teil (4) in Bewegungen versetzt, die im wesentlichen senkrecht zur Oberfläche des ersten Teiles (4) verlaufen, daß dem Zugang (27) ein erstes Ventil (461) und dem Ausgang (21) ein zweites Ventil (211) zugeordnet sind, daß sich bei einer die Kammer verkleinernden Bewegung des ersten Teiles (4) das erste Ventil (461) schließt, um den Zugang (27) zu versperren, daß sich das dem Ausgang (21) zugeordnete zweite Ventil (211) bei einer die Kammer verkleinernden Bewegung des ersten Teiles (4) öffnet, um den Ausgang (21) zu öffnen, und daß sich bei einer die Kammer vergrößernden Bewegung des ersten Teiles (4) das erste Ventil (461) öffnet und das zweite Ventil (211) sperrt.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß ein erstes Gehäuseteil (1) vorgesehen ist, das an seiner der Unterlage (52) zugewandten Seite das erste Teil (4) aufweist, daß das erste Teil (4) einen sich von der Oberfläche aus durch das Teil (4) erstreckenden ersten Durchgang (48) aufweist, der über das erste Ventil (461) mit dem Zugang (27) in Verbindung steht, daß das erste Teil (4) einen sich von der Oberfläche aus durch das erste Teil erstreckenden zweiten Durchgang (4 3) aufweist, der über das zweite Ventil (211) mit dem Ausgang (21) in Verbindung steht, daß ein zweites Gehäuseteil (6, 6'), das ein zweites aus einem flexiblen Material bestehendes Teil (7, 7¹) aufweist, vorgesehen ist, an dem das erste Gehäuseteil (1) derart befestigbar ist, daß eine die Unterlage haltende an dessen Randbereich im wesentlichen ringförmige Halte- und Spannvorrichtung (5) zwischen dem ersten Teil (4) und dem zweiten Teil (7, 7¹) jeweils dicht festklemmbar ist, wenn das erste und das zweite Gehäuseteil (1; 6, 6¹) zur Bildung der Kammer aneinander befestigt werden.

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3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das zweite Teil (7) des zweiten Gehäuseteiles (6) einen dritten Durchgang (78) aufweist, der sich durch das zweite Teil (7) erstreckt und über ein drittes Ventil (681) mit einem zweiten Zugang (67) in Verbindung steht, daß das zweite Teil (7) einen vierten Durchgang (73) aufweist, der über ein viertes Ventil (611) mit'dem zweiten Ausgang (61) in Verbindung steht, daß eine weitere Vorrichtung (87, 88, 8, 83) vorgesehen ist, durch die das zweite Teil· (7) in Bewegungen senkrecht zur Oberfläche des zweiten Teiles (7) versetzbar ist und daß das dritte Ventil (481) schließt und sich das vierte Ventil (611) öffnet, wenn eine Bewegung des zweiten Teiles (7) die Kammer verkleinert und daß sich das dritte Ventil (481) öffnet und das vierte Ventil (611) schließt, wenn eine Bewegung des zweiten Teiles (7) die Kammer vergrößert.

4. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß das erste Teil (4) und das zweite Teil (7) aus einem Silikongummi-Material bestehen.

5. Einrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , daß das erste Teil (4) und das zweite Teil (7) jeweils in einer in dem ersten Gehäuseteil (1) vorgesehenen ersten Vertiefung (24) bzw. in dem zweiten Gehäuseteil (6) vorgesehenen zweiten Vertiefung (64) einsetzbar ist, daß das erste Teil (4) und das zweite Teil (7) in ihren Randbereichen jeweils einen Ansatz (41 bzw. 71) aufweisen, der jeweils in eine Rille (23 bzw. 63) eingreift, die in dem Randbereich der ersten Vertiefung (24) bzw. der zweiten Vertiefung (64) vorgesehen ist, daß das erste Teil (4) und das zweite Teil (6) jeweils einen ersten bzw. zweiten Vorsprung (45 bzw. 75) aufweist, der jeweils in eine zu dem ersten Zugang (27) bzw. zu dem

zweiten Zugang (67) vom Boden der ersten Vertiefung (249 bzw. vom Boden der zweiten Vertiefung (4) verlaufende Bohrung (26, 66) derart eingreift, daß der Umfang der Vorsprünge jeweils dichtend an den Innenwandungen der Bohrungen (26, 66) anliegt , daß durch den ersten Vorsprung (45) der erste Durchgang (48) und durch den zweiten Vorsprung (75) der zweite Durchgang . (78) verlaufen, daß das erste Teil (4) ferner einen dritten Vorsprung (42) aufweist, der in eine vom Boden der ersten Vertiefung (24) aus zum ersten Ausgang (21) verlaufenden dritten Bohrung (22) eingreift, daß ein vierter Vorsprung (72) des zweiten Teiles (7) in eine vierte Bohrung (62) , die sich vom Boden der zweiten Vertiefung (64) aus zum zweiten Ausgang (61) erstreckt, eingreift, daß der dritte Vorsprung (42) und der vierte Vorsprung (72) jeweils derart in die dritte bzw. vierte Bohrung eingreift, daß jeweils der Umfang des dritten Vorsprunges (42) bzw. der Umfang des vierten Vorsprunges (72) dicht an der Innenwandung der dritten bzw. vierten Bohrung angreift, und daß durch den dritten Vorsprung (42) der dritte Durchgang (43) und durch den vierten Vorsprung (72) der vierte Durchgang (73) verlaufen.

6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß das erste, zweite, dritte und vierte Ventil Einweg-Ventile sind und daß jeweils ein Ventil in einem ihm zugeordneten Zu- bzw. Ausgang derart angeordnet ist, daß eine öffnung (91) seines scheibenförmigen Ventilkörpers (9) mit dem ihm zugeordneten Durchgang in Verbindung steht, daß der scheibenförmige Ventilkörper (9) in dem ihm zugeordneten Zu- bzw. Ausgang gegen eine Verschiebung in Längsrichtung des jeweiligen Zu- bzw. Ausganges festgelegt ist, daß der Umfang des scheibenförmigen Ventilkörpers (9) jeweils dicht an der Innenwandung

des ihm zugeordneten Zu- bzw. Ausgangs anliegt, und daß jeweils an einer Seite des scheibenförmigen Ventilkörpers (9) eine die öffnung (91) in Abhängigkeit von der Richtung des auf sie ausgeübten Druckes freigebende oder verschliessende Ventilklappe (92) vorgesehen ist.

7„ Einrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Ventilklappe (92) die Form einer einstückig und einseitig an den Ventilkörper (9) angeformten dünnen Scheibe aufweist.

8.. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn ζ e ichne t , daß das erste Teil (4) und/oder das zweite Teil (7) sich senkrecht zur Oberfläche von dem ersten Gehäuseteil (1) und/oder dem zweiten Gehäuseteil (6) wegerstreckende Justiernasen (44) aufweist, die die Halte- und Spannvorrichtung (5) umschließen können.

9. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet., daß die Vorrichtung bzw. die weitere Vorrichtung jeweils eine erste (35) bzw. zweite (85) Platte aufweist, die in dem ersten Gehäuseteil (1) bzw. in dem zweiten Gehäuseteil (6) neben dem ersten · Teil (4) bzw. heben dem zweiten Teil (7) in einem ersten bzw. zweiten weitervertieften Bereich (29) bzw. (69) der ersten Vertiefung (24) bzw. der zweiten Vertiefung (64) in ihrer Längsrichtung bewegbar angeordnet ist,und daJ? die erste bzw. zweite Platte (35 bzw. 85) an der ihr jeweils zugewandten Seite des ersten bzw. zweiten Teiles (4 bzw. 7) anliegt.

10. Einrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die erste Platte (35) bzw. die zweite Platte (85) durch ;5rste Abstandsteile (33) bzw. durch zweite Abstandsteile (88), die in dem ersten Gehäuseteil (1) bzw. in dem zweiten Gehäuseteil (6) von dem ersten weitervertieften Bereich (29) bzw. von der zweiten weitervertieften Bereich verlaufenden Bohrungen bewegbar sind, jeweils mit einer dritten (3) bzw. vierten (8) Platte starr verbunden ist, daß die dritte Platte (3) bzw. die vierte Platte (8) jeweils in einer ersten Ausnehmung (40) bzw. in einer zweiten Ausnehmung (80) vorgesehen und in ihrer Längsrichtung verschiebbar ist, daß sich die erste Ausnehmung (40) bzw. die zweite Ausnehmung (80) jeweils zu der entsprechenden Seite des ersten Gehäuseteiles (1) bzw. des zweiten Gehäuseteiles (6) öffnet, die dem ersten Teil (4) bzw. dem zweiten Teil (7) gegenüberliegt, und daß an der dem ersten Teil (4) bzw. dem zweiten Teil (7) jeweils gegenüberliegenden Seite der dritten Platte (3) bzw. der vierten Platte (8) ein jeweils durch einen Nocken bewegbarer Nockenfolger (38) bzw. (88) befestigt ist.

11. Einrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß der Nockenfolger (38, 88) die Form einer an der dritten Platte (3) bzw. an der vierten Platte (11) drehbar befestigten Rolle aufweist.

12. Einrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß die ersten Abstandsteile (33) bzw. die zweiten Abstandsteile (83) jeweils in Hülsen (32) angeordnet sind, die aus einem reibungsvermindernden Material bestehen und in den Bohrungen angeordnet sind, die den ersten bzw. zweiten weitervertieften Bereich (29, 69) jeweils mit der ersten (40) bzw. zweiten (80) Ausnehmung verbinden.

13. Einrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß Energiespeicher (36 bzw. 86) in sich vom Boden der ersten Ausnehmung (40) bzw. vom Boden der zweiten Ausnehmung (80) aus erstreckenden Öffnungen vorgesehen sind und gegen die dritte (3) bzw. vierte (8) Platte drücken und diese in eine definierte Lage bringen, und daß zwischen der dritten bzw. vierten Platte und dem Boden der ersten bzw. zweiten Ausnehmung jeweils ein Abstand vorgesehen ist, der dem möglichen Hub der dritten bzw. vierten Platte entspricht, wenn sich diese in der definierten Lage befindet.

14. Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß vom Boden der ersten Vertiefung (24) und vom Boden der zweiten Vertiefung (64) aus jeweils Öffnungen (2) zur gegenüberliegenden Seite des ersten (1) bzw. zweiten (2) Gehäuseteiles verlaufen.

15. Verfahren zum Betrieb einer Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 , dadurch gekennzeichnet , daß die Nockenfolger (38, 88) derart betätigt werden, daß die erste und zweite Platte (39, 89) gleichphasig aufeinanderzu- und voneinanderwegbewegt werden.