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Neues Antiturmormittel, her.gestellt durch mikrobielle
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stereoselektive Reduktion von 4-Demethoxydaunorubicin Die Erfindung
betrifft ein Verfahren, bei dem Mikroorganismen, die zu den Gattungen Streptomyces,
Corynebacterium und Mycobacterium gehören, für eine stereoselektive Reduktion der
funktionellen 13-Ketongruppe von 4-Demethoxydaunorubicin (I) verwendet werden und
speziell eines der beiden möglichen C-13-stereoisomeren 4-Demethoxy-13-dihydrodaunorubicine
gebildet wird. Die nachstehend als FCE 22723 bezeichnete neue Verbindung (II) ist
wertvoll als Antitumormittel und weist an experimentellen Tumoren eine Aktivität
auf, die mit der jenigen von 4-Demethoxydaunorubicin (I) vergleichbar ist. Das Substrat
für die mikrobielle stereoselektive Reduktion ist ein synthetisches Daunorubicin-Analogon,
das in der US-PS 4 046 878 der Anmelderin beschrieben wird.
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Eine nicht-stereoselektive Reduktion der funktionellen 13-Ketongruppe
von 4-Demethoxydaunorubicin (I), bei der ein Gemisch der beiden stereoisomeren C-13-Alkohole
gebildet wird, wird in der GB-Anmeldung Nr. 82/11692 (angemeldet am 22.04.1982)
der Anmelderin beschrieben.
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Die Erfindung betrifft insbesondere ein biosynthetisches Verfahren,
bei dem Corynebacterium mediolanum, Stamm ATCC 14004, Mycobacterium fortuitum, Stamm
NRRL B-8119, und ein neuer Mutant der Spezies Streptomyces peucetius, als Stamm
M 87 F.I. bezeichnet, hinterlegt bei der Deutsche Sammlung für Mikroorganismen,
wo er unter der Zugangsnummer DSM 2444 eingetragen ist, durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet
sind, die funktionelle 13-Ketongruppe von 4-Demetho>:ydaunorubicin stereoselek-
tiv
zu reduzieren und die neue Verbindung FCE 22723 (II) in den Fermentationsmedien
anzuhäufen.
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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung von FCE
22723 (II) aus Kultivierungsmedien, seine Konzentrierung aus roher Lösung und seine
Reinigung.
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Die Erfindung umfaßt in ihrem Rahmen das neue Antitumormittel Anthracyclin
FCR 22723 (II), das aus den biosynthetischen Verfahren erhalten worden ist, in der
reinen Form als Hydrochlorid.
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Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Arzneimittelzubereitung,
die die Verbindung II oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz dieser Verbindung
in Mischung mit pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägern enthält.
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Die Erfindung wird nachstehend ausführlich beschrieben.
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Die Mikroorganismen: Als spezielles Beispiel ist ein neuer Mutantenmikroorqanismus
Streptomyces peucetius, Stamm M 87 F.I. zu nennen.
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Mutanten, die durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet sind, die 13-Ketonfunktion
der Verbindung 1 stereoselektiv zu reduzieren und die neue Verbindung FCE 22723
(II) in dem Fermentationsbier anzuhäufen, können durch Mutation verschiedener Gattungen
von Bakterien einschließlich Streptomyces erhalten werden.
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Streptomyces peucetius subsp. aureus ATCC 31428 wurde in der hier
beschriebenen Weise unter Bildung eines neuen Laboratoriums-Mikroorganismus mutiert.
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Die Mutation von S. peucetius subs. aureus, ATCC 31428 unter Verwendung
von Nitrosoguanidin führte zur Bildung eines neuen Mutanten, der die Verbindung
I selektiv in die Verbindung II umwandelt. Dieser Mutantenmikroorganismus M 87 F.I.
von S. peucetius subs. aureus erhielt die Zugangsnummer DSM 2444 in der Deutsche
Sammlung für Mikroorganismen, Westdeutschland, wo er in der Dauerkollektion hinterlegt
worden ist.
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Die Morphologie des Mutanten M 87 F.I. ist nicht von derjenigen des
Ausgangsstamms S. peucetius ATCC 31428 zu unterscheiden, während beide Kulturen
in ihren Kulturmerkmalen und biochemischen Eigenschaften deutlich unterscheidbar
sind. So bildet der Mutant M 87 F.I. auf Agar-Medien nicht das strohgelbe bis zitronengelbe
lösliche Pigment, das seinen Ursprungsstamm S. peucetius ATCC 31428 kennzeichnet.
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Ferner kann der Mutant M 87 F.I. die Verbindung I selektiv in die
Verbindung II umwandeln, während der Ursprungsstamm S. peucetius ATCC 31428 in dieser
Hinsicht nicht selektiv ist. Diese Eigenschaft macht den Mutant M 87 F.I. äußerst
wertvoll in der hier beschriebenen Weise.
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Das Umwandlungsverfahren Die stereoselektive Umwandlung gemäß der
Erfindung kann in einem Kulturmedium von S. peucetius M 87 F.I. vorgenommen werden,
indem die Verbindung I als Substrat der Kultur während der Inkubationsperiode zugesetzt
wird.
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Die Verbindung I als Hydrochlorid kann nach Löslichmachung in sterilem
destilliertem Wasser zugesetzt werden. Der bevorzugte, aber nicht begrenzende Konzentrationsbereich
der Verbindung I in der Kultur beträgt etwa 100-400 ßg/l. Die Kultur wird in einem
Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise ein verwertbares
Kohlenhydrat, und eine Stickstoffquelle, beispielsweise eine verwertbare Stickstoffverbindung
oder ein proteinhaltiges Material enthält. Bevorzugt als Kohlenstoffquellen werden
beispielsweise Glucose, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Dextrin, Melasse
und dergl. Zu den bevorzugten Stickstoffquellen gehören Maisquellwasser, Hefeextrakt,
trockene Bierhefe, Sojabohnen-Mehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Casein, Fischmehl,
Brennereifeststoffe, tierisches Pepton, Fleischextrakt, Ammoniumsalze und dergl.
Kombinationen dieser Kohlenstoff-Stickstoffquellen können Vorteilhaft verwendet
werden. Spurenmetalle, beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Cobalt, Eisen und
dergl.,
müssen dem Nährmedium nicht unbedingt zugesetzt werden,
da Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums vor
der Sterilisation des Mediums verwendet werden.
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Das Umwandlungsverfahren kann im Bereich von etwa 72 Std. bis zu 8
Tagen liegen. Die Inkubationstemperatur während des Umwandlungsprozesses kann im
Bereich von etwa 250 bis etwa 370C liegen, wobei 290C bevorzugt werden. Der Inhalt
der Umwandlungsgefässe wird durch Schütteln bei etwa 250 UpM oder durch Bewegen
mit sterilisierter Luft belüftet, um das Wachstum des Mikrooryanismus zu erleichtern,
und dies steigert die Wirksamkeit des Umwandlungsverfahrens.
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Analysenmethoden Der Fortschritt der mikrobiellen Umwandlungsreaktion
wird überwacht, indem Proben der Fermentationen in verschiedenen Zeitabständen genommen
und bei pH 8,2 mit einem Dichloromethan: Methanol-Gemisch (9:1) extrahiert werden.
Wenn eine Probe des organischen Extraktes der Dünnschichtchromatographie (TLC) unterworfen
wird, wobei als Elutionsmittel ein Gemisch von Chloroform: Methanol:Essigsäure:Wasser
(Volumenverhältnis 80:20:7:3) verwendet wird, wird festgestellt, daß die Verbindung
FCE 22723 (II) bei einem mittleren Rf-Wert von 0,25 auftritt, während 4-Demethoxydaunorubicin
(I) bei Rf 0,35 gefunden wird. Eine quantitative Bewertung der beiden Anthracycline
kann nach Dünnschichtchromatographie unter Verwendung der vorstehend genannten Elutionssyteme
durch Abschaben der entsprechenden rotfarbigen Zonen und Elution mit Methanol und
abschließende spektrophotometrische Bestimmungen bei 482 nm vorgenommen werden.
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Isolationsverfahren Die ganzen Fermentationsbrühen, in denen die Verbindung
I der Umwandlung in FCE 22723 (II) unterworfen worden ist, werden mit Hilfe von
Diatomeenerde filtriert Der orangerote Mycelkuchen wird mit einem mit Wasser mischbaren
organischen Lösungsmittel, z.B. Methanol und anderen niederen Alkohlen, Dioxan,
Acetonitril und Aceton, extrahiert, wobei vorzugsweise Methanol verwendet wird.
Die Mycelextrakte werden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und mit den
filtrierten Fermentationsbrühen vereinigt, auf pH 8,2 eingestellt und dann mit einem
mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel wie n-Butanol, Chloroform,
Dichioromethan oder vorzugsweise einem 9:1-Gemisch von Dichloromethan und Methanol
extrahiert. Die organischen Extrakte enthalten FCE 22723 (II) zusammen mit der Verbindung
I und einigen geringfügigen Abbauprodukten.
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Reinigungsverfahren Der organische Extrakt wird unter vermindertem
Druck zur Trockne eingeengt, und der in Dichloromethan gelöste Rückstand wird an
einer pil 7 gepufferten Kieseloelsäure mit einem Gradienten eines Gemisches von
Dichloromethan Methanol :Wasser chromatographiert. Die Verbindung I wird zuerst
mit einem 89,5:10:0,5-Gemisch und anschließend die Verbindung FCE 22723 (II) mit
einem 30:5,5:0,6-Gemisch eluiert. Aus den zusammengegossenen Fraktionen wird nach
einer Wäsche mit Wasser, Einengung auf ein kleines Volumen in Gegenwart von n-Propanol,
Zusatz eines Xquivalents Salzsäure und eines Überschusses an Diethylether eine Fällung
von reinem FCE 22723 (11) als Hydrochlorid erhalten.
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Chemische und physikalische Eigenschaften FCE 22723 (II) als freie
Base ist in polaren organischen Lösungsmitteln und wäßrigen Alkoholen löslich, während
sein Hydrochlorid in Wasser und niederen Alkoholen löslich, aber in organischen
Lösungsmitteln unlöslich ist. Das Hydrochlorid von FCE 22723 hat die folgenden physikalisch-chemischen
Eigenschaften: Schmelzpunkt: 169°-170 (Zers.); Spezifische Drehung: [α]D23°
+177° (c: 0,05, CH3OH); UV-und VIS-Absorptionsspektrum: # MeOH 252, 286, 482, 514
nm (E1cm1% = 730, 150, 188 und 115).
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IR Spektrum (KBr): Peaks bei den folgenden Frequenzen: 3400, 2970,
2930, 1620, 1585, 1500, 1475, 1430, 1410, 1375, 1340, 1310, 1280, 1230, 1200, 1110,
1080, 1065, 1000, 980, 930, 910, 890, 870, 850, 820, 785, 765, 730, 700, 450 und
430 cm 13 C-NMR-Spektrum: (D20) bei 50 MHz: 16,7 (C-14, C-6'), 28,7 (C-2'), 32,8
(C-10), 34,2 (C-8), 47,8 (C-3'), 67,2 (C-5'), 68,0 (C-4'), 70,7 (C-7), 72,6 (C-13),
73,4 (C-9), 100,1 (C-1'), 110,5 und 111,3 (C-5a,C-lla), 127,3 und 127,5 (C-1, C-4),
132,8 und 132,9 (C-4a, C-12a), 135,1 (C-lOa), 136,2 und 136,4 (C-2, C-3), 138,0
(C-6a), 156,1 und 157,1 (C-6, C-11), 186,5 und 186,8 CC (C-5, C-12) Bruttoformel:
C26H2909N HC1 Massenspektrum: m/z (in FD; äquivalent der freien Base): 499 (M+).
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Eine selektive Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC)-Methode ermöglicht
die Trennung der beiden stereoisomeren C-13-Alkohole, die in einer in der GB-Patentanmeldung
82/11692 (angemeldet 22.04.1982) der Anmelderin beschriebenen Weise hergestellten
Probe von synthetischen 4-Demethoxy-13-dihydrodaunorubicin vorhanden sind und zwei
Peaks mit Retentionszeiten von 22,7 und 34 Minuten aufweisen.
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Bei Anwendung der gleichen HPLC-Methode erscheint FCE 22723 (II) als
einzelner Peak mit einer Retentionszeit von 34 Minuten entsprechend derjenigen des
sich langsamer bewegenden Bestandteils von synthetischen 4-Demethoxy-13-dihydrodaunorubicin.
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HPLC Methode Säule: Lichrosorb RP 18 (5 ßm) Iiibar Merck.
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Bewegliche Phase A: wäßrige Lösung von KH2PO4 (lOg/l), eingestellt
auf pH 2,6 mit Zitronensäure 0,5 M/CH3CN = 90/10 (Volumenverhältnis); Bewegliche
Phase B: CH3CN; Elution: isokratisch für 40 Minuten (80% A + 20% B): dort für 20
Minuten 40% A + 60% B.
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Durchflußmenge: 0,6 ml/min.
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Detektion: 254 nm.
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Biologische Aktivität Die wucherungsverhütende Wirkung von FCE 22726
(II) wurde "in vitro" an der Koloniebildung von HeLa-Zel.len untersucht. Wie in
Tabelle I angegeben, erwies sich die Verbindung II als dreimal starker als DNR (Daunorubicin)
und als ebenso stark wic 4-Demethoxydaunorubicin (I).
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Hinsichtlich der "in vivo"-Antitumor-Wirkung wurde FCE 22726 (II)
gegen ascitischer Leukämie P388 untersucht.
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CDF-l-Mäuse erhielten durch intraperitoneale Transpian-6 tation 10
ZelLen/Maus. Die Behandlung mit den zu untersuchenden Verbindungen erfolgte 24 Stunden
später.
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Tabelle II zeigt die Ergebnisse von zwei Versuchen. Bei der untersuchten
optimalen Dosis war FCE 22726 (II) stärker (-10 mal) als DNR und ebenso wirksam
wie 4-Demethoxydaunorubicin (I).
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Die Antitumor-Wirkung der Verbindung II, bewertet als Verlängerung
der Lebenserwartung, war derjenigen von DNR und der Ursprungsverbindung (I) bei
ihren optimalen Dosen gleich.
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Tabelle 1: Koloniebildungsfähigkeit von kultivierten HeLa-Zellen nach
Behandlung mit FCE 22723(II) .
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Dosis Hemmung von Hemmdosis Verbindung 50 (ng/ml) Kolonien (%) (ng/ml)
Daunorubicin 25 98 12,5 53 ~ 12 6,2 3 4-DemethoxyDNR(I) 12,5 100 6,2 96 .~ 3 3.1
50 1,5 16 FCE 22723 (II) 12,5 100 6,2 59 ~ 4 3,1 55 1,5 28 1Die HeLa-Zellem wurden
den Medikamenten 24 Stunden ausgesetzt.
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Tabelle 2: Antitumor-Wirkung von FCE 22723 (II) gegen ascitische Leukämie
P388 Verbindung Dosis MST Toxische mg/kg T/C % Todesfälle Daunorubicin 2,9 160;163
0/20 4,4 140;165 8/20 6,6 118;155 10/20 4-DemethoxyDNR(I)0,33 145;150 0/20 0,5 150;160
1/20 0,75 122;165 9/20 FCE 22723 (II) 0,14 136 0/10 0,22 140 0/10 0,33 140;154 0/20
0,5 145;150 4/20 0,75 113;165 7/20 1Behandlung i.p. am Tag 1 mittlere Uberlebenszeit,
ausgedrückt als Prozentsatz der unbehandelten Vergleichstiere; Daten von 2 Versuchen.
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Beschreibung bevorzugter Ausführ ngsformen Die Verfahren und das Produkt
gemäß der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
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Beispiel 1 Eine Kultur von Streptomyces peucetius, Stamm M 87 F.I.
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(DSM 2444) wurde 14 Tage bei 28°C auf Schrägagar des folgenden Erhaltungsmediums
(Medium SA) gezüchtet: 3% Glucose; 1,2% Bier-Trockenhefe; 0,1% NaCl; 0,05% KEl2P04;
0,1% CaC03; 0,005% MgSO4; 0,0005% FeS04.7H20; 0,0005% ZnS04.7H20; 0,00058 CuSO4.5H2O;
2% Agar; Beitungswasser zur Auffüllung auf lOOml; pH 6,7. Die Sterilisation erfolgt
durch 20-minütiges Erhitzen in einem Autoklaven auf 1150C.
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Die Sporen der in dieser Weise gezüchteten Kultur werden aufgefangen
und in 3 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspension wird in
300 ml-Erlenmeyer-K9lben geimpft, die 60 ml des folgenden flüssigen Nährmediums
enthalten: 0,3% trockene Bierhefe; 0,5% Pepton; 0,05% Ca(NO3)2.4H2O; Leitungswasser
zur Auffüllung auf 100 ml. Die Sterilisation erfolgt durch 20-minütiges Erhitzen
in einem Autoklaven auf 1200C. Der pH-Wert dieses Mediums nach der Ste-rilisation
liegt zwischen 6,8 und 7,0. Die beimpften Kolben werden zwei Tage bei einer Temperatur
von 28°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung geschüttelt, die mit 250 UpM
läuft und einen Kreis von 7 cm Durchmesser beschreibt. Je 1,5 ml der in der vorstehend
beschriebienen Weise gezüchteten Kultur werden in 300 ml-Erlenmeyer Kolben geimpft,
die 50 mJ des folgenden Umwandlunysmediums enthalten:
1,5% Hefeextrakt;
0,25% Kll2pO4; 1,5% Glucose; Leitungswasser zur Auffüllung auf 100 ml; pll-Wert
6,9. Die Sterilisation erfolgt durch Erhitzen im Autoklaven bei 1150C für 20 Minuten.
Die Glucoselösung wird getrennt sterilisiert und jedem sterilisiertem Kolben bei
der geeigneten Konzentration zugesetzt.
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Die Kolben werden somit bei 280C unter den für die Impfphase beschriebenen
Bedingungen 24 Stunden inkubiert. Nach dieser Zeit werden je 1,25 ml einer Lösung
der Verbindung I in sterilem destilliertem Wasser bei einer Konzentration von 10
mg/ml jedem Kolben zugesetzt. Die geschüttelten Kolben werden zwei weitere Tage
inkubiert, wobei eine 85%-ige Umwandlung der Verbindung I in die Verbindung II erzielt
wird.
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Beispiel 2 Eine Kultur von S. peucetius, Stamm M 87 F.I. wird auf
einem festen Nährmedium auf die in Beispiel beschriebene Weise gezüchtet. Die Sporen
von drei Schrägagarplatten werden zusammengegossen und in 10 ml sterilem destilliertem
Wasser zusammengefaßt. Die so erhaltene Suspension wird in einem mit Umlenkblechen
versehenen 2 l-Rundkolben geimpft, der 500 ml des für Beispiel 1 beschriebenen Impfmediums
enthält. Der Kolben wird 48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung, die
mit 120 UpM läuft und einen Kreis von 7 cm Durchmesser beschreibt, bei einer Temperatur
von 28"C inkubiert.
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Das gesamte Impfmaterial wird in einen 10 l-Fermentcr aus nicht rostendem
Stahl geimpft, der 7,5 1 des in Beispiel 1 beschriebenen Biotransformationsmediums
enthält, und mit Wasserdampf bei 120"C für 30 Minuten sterilisiert. Die Glucoselösung
wi.rd getrennt stei ilisiert und mit der geeicjneten Konzentration in den
sterilisierten
Fermenter gegeben. Die Kultur wird bei 280C unter Rühren mit 230 UpM dem Wachstum
überlassen und mit einem Luftstrom von 0,7 1/1 Medium/min belüftet. Nach 48 Stunden
wird die Substratverbindung bei der für Beispiel 1 beschriebenen Konzentration zugesetzt,
und die Kultur wird drei weitere Tage inkubiert, wobei eine 60%-ige Umwandlung der
Verbindung I in die Verbindung II erzielt wird.
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Beispiel 3 Eine Kultur von Mycobacterium fortuitum NRRL B 8119 wird
fünf Tage bei 300C auf dem folgenden Medium gezüchtet: 0,8% NaCl; 0,8E Pepton; 0,3%
Fleischextrakt; 0,3% Trockenhefe; 2% Agar; destilliertes Wasser zur Auffüllung auf
100 ml. Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven bei 1100C für 20 Minuten. Die in
dieser Weise erhaltene Zellsuspension wird in das in Beispiel 1 beschriebene Biotransformationsmedium
geimpft und drei Tage bei 300C dem Wachstum in 300 ml-Erlenmeyer Kolben überlassen,
die 50 ml Medium enthalten, indem die Kolben mit 220 UpM geschüttelt werden.
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Zu diesem Zeitpunkt wird die Substratverbindung bei der für Beispiel
1 beschriebenen Konzentration zugesetzt, und die Kultur wird unter den gleichen
Bedingungen drei weitere Tage inkubiert, wobei eine 60%-ige Umwandlung der Verbindung
I in die Verbindung II erzielt wird.
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Beispiel 4 Eine Kultur von Corynebacterium mediolanum, ATCC 14004,
wird fünf Tage bei 300C auf dem folgenden Medium gezüchtet: 0,88 Pepton; 0,8% NaCl;
0,62 Trockenhefe; 2% Agar; destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 100 ml.
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Die Sterilisatioii erfolgt im Autoklaven bei 1100C für 20 Minuten.
Die in dieser Weise erhaltene Zellsuspension wird in das in Beispiel 1 beschriebene
Biotransformationsmedium geimpft und drei Tage bei 30"C in 300 ml-Erlenmeyer Kolben,
die 50 ml Medium enthalten, durch Schütteln bei 220 UpM überlassen. Zu diesem Zeitpunkt
wird die Substratverbindung I bei der für Beispiel 1 beschriebenen Konzentration
zugesetzt, und die Kultur wird unter den gleichen Bedingungen drei weitere Tage
inkubiert, wobei 32%-ige Umwandlung der Verbindung I in die Verbindung II erzielt
wird.
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Beispiel 5 Die Voll-Brühe (5 1) aus einer gemäß Beispiel 2 erhaltenen
Fermentation wurde unter Verwendung von 2% Diatomeenerde als Filterhilfsstoff filtriert.
Der nasse Filterkuchen wurde mit Methanol (3 1) extrahiert. Nach der Filtration
wurden zwei weitere Extraktionen mit Methanol vorgenommen, um vollständige Rückgewinnung
der orangeroten Pigmente zu gewährleisten. Die vereinigten methanolischen Extrakte
wurden unter vermindertem Druck eingeengt, und das Konzentrat (1 1) wurde mit der
filtrierten Brühe vereinigt und bei pH 8-,2 mit einem Dichloromethan:Methanol-Gemisch
(9:1) erschöpfend extrahiert. Der organische Extrakt, der die Verbindungen I und
II mit gerinyen Mengen von Abbauprodukten enthielt, wurde unter vermindertem Druck
zur Trockne eingedampft.
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Der in Dichloromethan gelöste Rückstand wurde an einer bei pil 7 gepufferten
Kieselgelsäule mit einem Gradienten eines Dichloromethan:Methanol:Wasser-Gemisches
chromatographiert. Die Verbindung I wurde zuerst mit einem 89,5:10:0,5-Gemisch und
anschließend die Verbindung FCE 22723 (11) mit einem 30:5,5:0,6-Gemisch eluiert.
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Aus den zusammengegossenen Fraktionen wurden nach einer Wäsche mit
Wasser, Eiilengung auf ein kleines Volumen in Gegenwart von n-Propanol, Zugabe eines
Aquivalents Salzsäure und eines Überschusses von Diethylether reines FCE 22723 (11),
(0,72 g, 608) als Hydrochlorid (Schmelzpunkt 1690/1700C, Zers.) erhalten. Nach indem
gleichen Verfahren wurde die nicht umgewandelte Verbindung I (0,48 g, 40%) als Hydrochlorid
ebenfalls gewonnen.
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Beispiel 6 Die Voll-Brühe (500 ml) aus einer gemäß Beispiel 3 erhaltenen
Fermentation wurde extrahiert. Der Extrakt, der der Säulenchromatographie auf die
in Beispiel 5 beschriebene Weise unterworfen wurde, ergab reines FCE 22723 (II =
0,07 gb und die Verbindung 1 (0,05 g) als Hydrochloride.
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Beispiel 7 Die Voll-Brühe (500 ml) aus einer gemäß Beispiel 4 erhaltenen
Fermentation wurde auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise verarbeitet, wobei reines
FCE 22723 (II = 0,035 g) und die Verbindung I (0,075 g) als Hydrochloride erhalten
wurden.