DE3243090A1 - Verfahren zur herstellung von (+)-(alpha)-terpineol durch mikrobiologische umwandlung von limonen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von (+)-alpha-Terpineol durch
• mikrobiologische Umwandlung von Limonen Mikrobiologische Umwandlungen von Limonen sind seit längerer Zeit bekannt¹). Die beschriebenen Reaktionen waren jedoch zunächst Ergebnisse von Untersuchungen des Abbaus von nicht eindeutig beschriebenem Limonen mit Pseudomonaden2 8) und Enterobacteraceae91'10>. Das Substrat diente hierbei als Kohlenstoff- und Energiequelle dieser Mikroorganismen. Aspergillus niger NCIM 612 oxidiert Limonen zu (+)-cis-Carveol und Neben- und Folgeprodukten11). Alle Metabolite konnten jedoch nur in geringen Substanzmengen als Intermediärprodukte des Abbaus isoliert werden.
• Ein auf Kohlenwasserstoffen gezuchteter Stamm von Corynebacterium hydrocarboclastus oxidiert dagegen das Cosubstrat Limonen zu Carvon, welches in präparativer Ausbeute gewonnen wurdel2).
• alpha-Terpineol wurde bisher nur ohne Zuordnung zur (S)-oder (R)-Strukturrethe bei der Umwandlung des Limonens mit Aspergillus niger NCIM 612 als Erfindungsgemäß wurde demgegenuber festgestellt, daß sich bei Biotransformationen von (R)-(+)-Limonen das optisch reine (+)-4(R)-alpha-Terpineol präparativ herstellen läßt.
• Für diese Umwandlung ist Penicillium digitatum, beispielsweise der Stamm DSM 62840 geeignet, wobei nur geringe Mengen an Nebenprodukten gebildet werden.
• Erfindungsgemäß wird reines alpha-Terpineol neben geringen Mengen des Diols gebildet. Das Produkt ist nicht nur reiner als das des Stands der Technik11), sondern entsteht auch in wesentlich höheren Ausbeuten Mit Peniöillium digitatum, beispielsweise dem Stamm DSM 62840, wird auch racemisches Limonen (Dipenten), d.h. die Mischungen von R(+)-Limonen und S(-)-Limonen, zu pha-Terpineol umgewandelt.
• Die dabei anzuwendenden Fermentationsbedingungen enteprechem dem Stand der Technik1).
• Neben dem speziell angegebenen Stamm ist es dem Fachmann routinemäßig mUglich (insbesondere anhand der in Beispiel 1 beschriebenen Farbreaktion des (+)-alpha-Terpineols) weitere brauchbare Stämme von Penicillium digitatum zu ermitteln.
• Die nach diesen Verfahren herstellbare Substanz ist Ausgangspunkt für weitere chemische Synthesen und wird von entsprechenden Industrien als Marktprodukt geführt13) oder ist als Riechstoffkomponente bekannt14).
• Beispiel 1 FUnf 2000 ml Erlenmeyerkolben mit 400 ml sterilisierten Kulturmedien, enthaltend 1 % D(+)-Glucose, 2 X Malzextrakt, 1 X Universalpepton (Merck) und 0,5 % Hefeextrakt, werden mit Jeweils fünf Imprösen aus einer 7 Tage alten, aussporulierten Schrägagarkultur von Penicillium digitatum DSM 62840 beimpft.
• Anschließend wird bei 27 0C im Dunkeln und 100 rpm. inkubiert. Nach vollständigem Verbrauch der Glucose (ca. 72 h) wird unter aseptischen Bedingungen 0,2 ml R(+)-Limonen/Kolben zugesetzt. Nach einer Kontaktzeit von 24 h ist das Edukt vollständig umgewandelt.
• Der Verlauf der Umwandlung wird dUnnschicht-chromatographisch verfolgt. Dazu wird 1 ml einer steril entnommenen Probe mit 0,2 ml Ethylacetat versetzt, 2 min. geschüttelt und 2 min. zentrifugiert. Vom Überstand werden 0,01 ml auf HPLC-Fertigplatten, Kieselgel 60 (Merck) aufgetragen und 5 cm mit Dichlormethan/Aceton (95 + 5) entwickelt.
• Anschließend wird die Platte mit folgender Färbelösung besprüht: 0,6 ml Anisaldehyd 1,0 ml Schwefelsäure 50,0 ml Essigsäure Zur Sichtbarmachung der Flecken wird 2 min. bei 100 oC inkubiert.
• FUr die präparative Aufarbeitung werden Uberstand und Myoel 3mal mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Phasen eingeengt.
• Die Reinigung des Produktes geschieht entweder mittels Wasserdampfdestillation und anschließender Destillation oder durch Chromatographie an Si-60-Säulen (Merck) mit Hexan/ Ethylacetatgemischen. Aus einem Ansatz von 2,1 g R(+)-Limonen können 46 % der Theorie (+)-alpha-Terpineol isoliert werden.
• Beispiel 2 Dieses Beispiel unterscheidet sich von Beispiel 1 dadurch, daß anstelle von R(+)rLimonen dl-Limonen (Dipenten) als Substrat eingesetzt wird.
• Es werden zu zwei 2000 ml Kulturen Je 0,5 ml Dipenten sugesetzt.
• Aus einem Ansatz mit 0,860 g dl-Limonen werden 0,205 g (20 % der Theorie) erhalten, Literatur 1) K. Kies0ich Microbial Transformations of Non-Sterold Cyclic Compounds Georg Thieme, Stuttgart 1976 2) R.S. Dhavalikar, P.N. Rangachari, P.K. Bhattacharyya Ind. 3. Biochem. 3, 158 (l966) 3) N.R. Ballal, P.K. Bhattacharyya, P.N. Rangachari Biochem. Biophys. Res. Comn. 29, 275 (1967) 4) N.R. Ballal, P.K. Bhattacharyya, P.N. Rangachari Biochem. Biophys. Res. Comn. 23, 473(1966) 5) N.R. Ballal, P.K. Bhattacharyya, P.K. Rangacharl Ind. 3. Biochem. 5, 1 (1968) 6) B.L. Hugund, P.K. Bhattacharya P.N. Rangachari Arch. Microbfol. 71, 258 (1970) 7) B.L. Hugund, P.K. Bhattacharyya, P.N. Rangacharl Ind. 3. Biochem. , 80 (1970) 8) J.R. Devi, P.K. Bhattacharyya Biochem. Biophys. 14, 359 (1977) 9) R.S. Dhavalikar Ind. J. Biochem. 3, 144 (1966) 10) S.G. Dhere, R.S. Dhavalfkar Scl. Cult. 36, 292 (1970) 11) G.K. Swamy, K.L. Dhanchandani, P.K. Bhattacharyya Abstr. Sympos. on Recent Advances in the Chemistry of Terpenolds (Nation. Inst. of Sciences of India, New Delhi) (1965), 10.
• 12) Hasegawa Co.
• Jap. Pat. 7 238998 (1972) L3) Terpendenrate Hoechst Hoechst AG, Verkauf Organische Chemikalien O+W., Katalog 1981 14) G. Ohloff Recent Developments in the Field of Natural Occurring Aroma Components Fortschritte d. .tCh-ie, Org.Jaturstoffe 35, S.460

Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE Verfahren zur Herstellung von (+)-alpha-Terpineol, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man dl-Limonen mit dem Fungus Penicillium digitatum oder dessen Enzymen fermentiert.
2. 2. Verfahren zur Herstellung von (+)-alpha-Terplneol, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man R(+)-Limonen mit dem Fungus Penicillium digitatum oder dessen Enzymen termentiert.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e n n -z 1 c h n e t , daß man den Stamm DSM 62840 verwendet.