DE3145505A1

DE3145505A1 - Transfereinrichtung zur entnahme von gefriergetrockneten schnitten aus der kuehlkammer eines gefriermikrotomes, insbesondere eines kryo-ultramikrotomes

Info

Publication number: DE3145505A1
Application number: DE19813145505
Authority: DE
Inventors: Walter Wien Bilek
Original assignee: C Reichert Optische Werke AG
Current assignee: C Reichert Optische Werke AG
Priority date: 1981-11-17
Filing date: 1981-11-17
Publication date: 1983-05-26
Also published as: FR2516652A1; SE8206494L; GB2110838A; GB2110838B; JPS5892928A; FR2516652B1; SE8206494D0

Description

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C. REICHERT, Optische Werke AG

Österreich

Transfer-Einrichtung zur Entnahme gefriergetrockneter Schnitte aus der Kühlkammer eines Gefriermikrotomes, insbesondere eines Kryo-Ultramikrotomes

Die Erfindung betrifft eine Transfereinrichtung zur Entnahme gefriergetrockneter Schnitte aus der Kühlkammer eines Gefriermikrotomes, insbesondere eines Kryo-Ultramikrotomes mit den. Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Biologische Objekte werden für histochemische Zwecke, insbesondere zur Durchführung einer Röntgenmikroanalyse in einem Elektronenmikroskop, häufig nach einem rapiden Einfrieren ("Kryofixation") im gefrorenen Zustand in Kühlkammern geschnitten ("Kryomikrotomie" bzw. "Kryo-Ultramikrotomie^u).Da man derartige hydratisierte Kryoschnitte im Elektronenmikroskop nur schwer durchstrahlen und analysieren kann, wendet man heute häufig das Verfahren der Gefriertrocknung an, um die Transperenz der Schnitte im Elektronenstrahl zu erhöhen und den Transfer der Schnitte von der Kühlkammer in das Elektronenmikroskop zu vereinfachen. Der Schnitt wird zu diesem Zweck beispielsweise in der trockenen Stickstoffatmosphäre der Kühlkammer auf Temperaturen ^. -80 C erwärmt. Der größte Teil der freibeweglichen Wassermolekel wird hierbei an das Kammergas abgegeben, das dauernd an den Schnitten vorbeiströmt und die Wassermolekel an die umgebende Raumatmosphäre abführt. Es ist jedoch schwierig, die Schnitte auf den normalerweise verwendeten, extrem leichten Trägernetzen nach erfolgter Gefriertrocknung aus der Kühlkammer zu entnehmen, ohne daß beim Eintritt in die feuchte Raumatmosphäre Kondensate oder Sublimate von Wasser auf den kalten Schnittflächen entstehen. Derartige Wasserniederschläge führen augenblicklich zu einer Umverteilung von Ionen und kleinen Molekeln und entwerten dadurch jede nachfolgende Mikroanalyse. Man hat daher versucht, die auf Objektträgernetzen aufgebrachten Schnitte bereits in der Kühlkammer in kleine Behälter, beispielsweise kleine Kunststoffkapseln, einzuschließen und in diesen Kapseln aus der

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Kühlkammer zu entnehmen. Leider erfordert dieser Präparationsgang sehr dichte Kapseln, welche in der Kühlkammer bei Temperaturen unter -100⁰C nur sehr schwer zu handhaben sind. Gleiches gilt für den Einschluß der Objektträgernetze in Blech- oder Plastikfolien.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Transfereinrichtung zu schaffen^ die relativ einfach aufgebaut und daher in ihrer Handhabung sicher und einfach ist, und die zudem nicht jene hohen Anschaffungskosten verursacht, die zwar bei Systemen zum Transfer gefroren-hydratisierter Schnitte bei tiefen Temperaturen notwendig ist und akzeptiert wird, für den Transfer gefriergetrockneter Schnitte jedoch nicht erforderlich ist und daher abgelehnt würde. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine·Einrichtung gelöst, deren Merkmale in Kennzeichenteil des Patentanspruches 1 angegeben sind.

Die erfindungsgemäße Einrichtung entspricht den gestellten Anforderungen dadurch in hohem Ausmaß, daß die Netze ohne besondere Vorrichtungen von Hand aus von der zum Anpressen und Trockenen vorgesehenen Heizplatte auf eine Platte verschoben werden können, welche den Boden eines kleinen Rezipienten bildet, der nach dem Verschieben der Netze auf die Platte aufgesetzt, mit einer kleinen Pumpe evakuiert und danach aus dem Kammerraum entnommen werden kann, wobei die Temperatur des Rezipienten und der Bodenplatte während der Entnahme erheblich über der Temperatur der Kühlkammer verbleibt»

Vorteilhafte Weiterbildungen der .Transfereinrichtung können darin bestehen, daß der Rezipient zumindest teilweise aus durchsichtigem Material gefertigt ist, daß zur vorsichtigen Belüftung des Rezipienten ein spezielles Ventil vorgesehen ist, welches das Risiko stärkerer Konvektionen beim Belüften ausschließt, daß für Objektträgernetze in der Basisplatte Vertiefungen zum Einbringen und Entnehmen sowie eine spezielle Abdeckung vorgesehen sind, sowie daß die Basisplatte des Rezipienten durch eine Heizpatrone beim Beschikken bzw. vor dem Öffnen erwärmt werden kann, so daß eine einwandfreie Dichtung mittels eines Q-Ringes gewährleistet ist und jede Anlagerung von Wasser an den Biokolloiden des gefriergetrockneten Materials mit Sicherheit ausgeschlossen wird. Hierbei kann eine thermostatische Regelung der Temperatur zusätzlich verhindern, daß die Wärme das Objekt schädigt.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Kühlkammer bekannter Bauart mit dan als Transfereinrichtung benützten Rezipienten ohne Darstellung der Vakuumpumpe im geöffneten Zustand vor der Entnahme der Schnitte aus der Kühlkammer;

Fig. 2 eine schematische Darstellung des verschlossenen evakuierten Rezipienten nach Entnahme aus der Kühlkammer mit Vakuumpumpe und Ventilsystem zum Belüften;

Fig. 3a eine schematische Darstellung einer modifizierten Ausführung des Rezipienten mit einer thermostatisch beheizbaren Bodenplatte mit Vertiefungen zum Einlegen und Entnehmen der Objektträger sowie einem Deckel zum Schutz der Schnitte beim Transfer und beim Belüften im Querschnitt,

Fig. 3b die Bodenplatte dieser Ausführung mit den Ausnehmungen zur Ablage und Wiederaufnahme der Netze in Aufsicht.

Fig. 1 stellt eine Kühlkammer mit einer mehrschichtigen Kammerwand 1 dar, welche in nicht näher dargestellter Weise durch gasförmigen oder flüssigen Stickstoff auf eine Temperatur unter 0 C abgekühlt ist und durch einen kontinuierlichen Strom trockenen kalten Stickstoffgases im Inneren frostfrei gehalten wird. Zum Herstellen der Gefrierschnitte 2 wird das gefrorene-biologische Objekt 3 an der Schneide des Messers 4 vorbeigeführt. Die von der Messerschneide abgenommenen Schnitte 2 werden mittels geeigneter Vorrichtungen innerhalb des Kammerraumes 5 beispielsweise auf die häufig hierfür verwendeten kreisscheibenförmigen Netze 6 mit einem Durchmesser von 2,3 bzw. 3 mm übertragen und mit diesen Netzen auf die Anpreß- und Trockenplatte 7 überführt, auf der sie mit einem geeigneten Stempel flach angepreßt und bei einer Temperatur ^ -80⁰C getrocknet werden. Erfindungsgemäß werden die Netze 6 mit den angepreßten und getrockneten Schnitten von der Platte 7 auf eine^Platte 8 geschoben, die auf Grund ihrer räumlichen Position auf einfache Weise ein Verschieben des Netzes ermöglicht. Hierzu ist die Oberfläche der Platte 8 etwas unter der Oberfläche der Platte 7 angeordnet. Die Platte 8 wird knapp vorher in die Kammer 1 eingebracht und befindet sich bei diesem Transfer daher etwa auf Raumtemperatur, wobei ein zu rascher Wärmeaustausch

+ unmittelbar anschließende, auf einer Auflage liegende

mit der Auflage durch eine Isolation, beispielsweise eine Schaumstoffplatte 9 so gemindert wird, daß er bei einer zügig ausgeführten Präparation kein störendes Ausmaß erreicht. Nach dem Verschieben der Netze auf die Platte 8 wird der ebenfalls raumwarme Rezipient 10 auf die Platte 8 aufgesetzt und soweit evakuiert, daß er die Entnahme mit der⁺Platte 8 aus dem Kammerraum ohne das Risiko einer öffnung erlaubt. Zwischen dem Rezipienten 10 und der Bodenplatte 8 befindet sich im einfachsten Fall ein O-Ring 11 zur Abdichtung des Raumes sowie am Rezipienten ein Saugstutzen 12, an dem eine Schlauchverbindung 13 zur Pumpe angeschlossen werden kann.

Fig. 2 zeigt eine vollständige erfindungsgemäße Transfereinrichtung mit einer einfachen Handpumpe 14 mit Manometer 15 sowie einem Lufteinlaßventil 16. Der Lufteinlaß kann über ein Trockenmittel 17 erfolgen, das sich in bekannter Weise in einem Röhrchen zwischen dem Ventil 16 und der Schlauchverbindung 13 befindet und das Einführen feuchter Luft verhindert. Dem Erfindungsgedanken gemäß kann die Bodenplatte 8 mit ihrer planen Unterseite auf eine beheizte Platte 18 aufgelegt und auf diese Weise soweit über die Raumtemperatur erwärmt werden, daß das Risiko einer Aufnahme von Luftfeuchtigkeit beim öffnen des Rezipienten ausgeschlossen werden kann. Eine vorteilhafte Weiterbildung der erfindungsgemäßen Einrichtung kann darin bestehen, daß der Rezipient 10a aus durchsichtigem Kunststoff oder Glas besteht und dadurch eine laufende Kontrolle der Position der Netze mit den Schnitten ermöglicht.

Fig. 3a zeigt die schematische Darstellung einer ebenfalls vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Rezipienten im Querschnitt. Die Bodenplatte 8 a halter! in diesem Fall drei Füße 19 mit spitzen Enden, welche einen ausgedehnteren Festkörperkontakt zwischen der Platte 8 a und der jeweiligen Auflage auf ein Minimum reduzieren und den Wärmeaustausch auf diesem Weg stark einschränken. Ebenso kann erfindungsgemäß der Wärmeaustausch zwischen der Platte 8 a und dem umgebenden Kammergas durch eine Isolationsschicht 9 a reduziert werden. In der Bodenplatte 8 a befinden sich die Elemente für eine thermostatische Beheizung, beispielsweise eine Heizpatrone 20 und ein Temperaturfühler 21, die über ein mehradriges Kabel 22 mit einem nicht gesondert dargestellten Steuergerät verbunden sind. Das mehradrige Kabel 22 wird hierbei über einen Arm mit isolierendem Haltegriff 23 aus dem Kaltraum ausgeführt. Eine weitere vorteilhafte Weiterbildung kann darin bestehen, daß für die Netze 6 mit den Schnitten Vertiefungen 8 b vorgesehen sind, die in bekannter Weise durch Langlochfräsungen geringer Durchmesser so verbunden sind, daß + an ihm durch den Unterdruck gehaltenen

ein Wiederaufnehmen der abgelegten Netze mit einer Pinzette leicht möglich ist (Vgl. hierzu auch Aufsicht Fig. 3 b). Eine vorteilhafte Weiterbildung kann dabei darin bestehen, daß die einzelnen Vertiefungen durch entsprechende Ziffern und/oder Buchstabenbezeichnungen eine klare Zuordnung der darin befindlichen unterschiedlichen Präparate erlauben. Eine andere vorteilhafte Weiterbildung besteht schließlich darin, daß die abgelegten Netze innerhalb des Rezipienten 10 mit einem Deckel 24 so abgedeckt werden können, daß weder die Erschütterungen beim Transfer noch die beim Belüften des Rezipienten entstehende Konvektion die Lage der Schnitte oder die Lage der Netze verändern kann. Hierbei kann die räumliche Lage des Deckels 24 auf der Bodenplatte 8 a in bekannter und in der Fig. 3 nicht dargestellter Weise durch Stifte bestimmt und festgelegt werden.

Die anhand der Fign. 1 bis 3 beschriebenen Konstruktionen zeigen lediglich wenige bevorzugte Varianten zur Verwirklichung des Erfindungsgedankens. Die Erfindung kann darüber hinaus in zahlreichen nicht dargestellten oder beschriebenen Kombinationen oder Varianten verwirklicht werden. So ist. es beispielsweise möglich, die Dichtung zwischen dem Rezipienten und der Bodenplatte durch exakt plan geschliffene Flächen an Stelle eines O-Ringes zu realisieren. Art, Aufstellung und Anschluß des Vakuumsystems, der Belüftungseinrichtung sowie Art und Anordnung einer Heizung und der Isolation der Bodenplatte können im Bereich bekannter technischer Lösungsvarianten abgeändert werden, ohne daß hierdurch die kennzeichnenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Einrichtung berührt werden. Ebenso ist es unerheblich für den Erfindungsgegenstand, welche Materialien in fachgerechter Anpassung an die jeweils verwendeten Objekte sowie Temperaturbereiche verwendet werden. Pumpe, Ventil und Heizanordnung stellen zwar ebenso wie der Rezipient und die Bodenplatte integrierende Elemente der Erfindung dar, können aber ebenso wie die elektrische Anlage in unterschiedlichster, durch den jeweiligen Stand derTechnik gegebener Weise und Wirkverbindung realisiert werden. Die dargestellten und beschriebenen Ausführungsformen können ins of erne keine vollständige Auflistung und Möglichkeiten und Kombinationen,sondern lediglich Beispiele für die erfindungsgemäße Transfereinrichtung darstellen.

Leerseite

Claims

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C. Reichert Optische Werke AG
A - Wien

Ansprüche

*·" PATENTANWÄLTE Dr. rer. nat. DIETER LOUIS Dlpl.-Phy». CLAUS PDHLAU Dlpl.-Ir.g. FRANZ LOHRENTZ Dlpl.-Phy.t.WOLFGANG SEGETH

FERDIfMND-MARIA-STR. 6 8130 STARNSERG

21 356/7

.J Transfereinrichtung zur Entnahme von gefriergetrockneten Schnitten aus der Kühlkammer eines Gefriermikrotoms, insbesondere eines Kryo-Ultramikrotoms, gekennzeichnet durch einen an eine Vakuumpumpe (14) angeschlossenen oder anschließbaren, in die Kühlkammer (5) einbringbaren Rezipienten (1o, 1oa), der eine Öffnung und eine die Öffnung umschließende Dichtfläche (11) besitzt, und durch eine auf die Grosse der Öffnung abgestimmte und dichtend an die Dichtfläche (11) anlegbare gesonderte Trägerplatte (8, 8a) zur Aufnahme der Schnitte, wobei die Trägerplatte (8, 8a) gesondert in die Kühlkammer (5) einbringbar und durch dichtendes Aufsetzen des Rezipienten (1o_f 1oa) mit dessen Dichtfläche (11) auf die Trägerplatte (8, 8a) und nach Evakuieren des Rezipienten aus der Kühlkammer (5) zusammen mit dem Rezipienten entnehmbar ist.

Transfereinrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezipient (1o, 1oa) glockenförmig ist und die Trägerplatte (8, 8a) im aufgesetzten Zustand des Rezipienten eine dessen Öffnung verschließende Bodenplatte bildet.

3ο Transfereinrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Kühlkammer (5) eine Anpress- und Heizfläche (7) und unmittelbar daneben eine Auflage (9) für die Trägerplatte (8, 8a) derart angeordnet ist, daß die Oberseite der Trägerplatte (8, 8a) auf gleicher Höhe oder geringfügig unterhalb der Anpress- und Heizfläche (7) liegt.

4. Transfereinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezipient (1θ/ 1oa) über eine Schlauchleitung (13) mit der Vakuumpumpe (14) verbunden ist, und daß die Schlauchleitung (13) zugleich als Handhabe für den Rezipienten dient.

5. Transfereinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zum Belüften des Rezipienten (1o, 1oa) ein Ventil (16) vorgesehen ist.

6. Transfereinrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Ventil (16) eine Trockenpatrone (17) oder dgl. enthält.

7. Transfereinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezipient (1oa) zumindest teilweise aus einem durchsichtigen Material besteht.

8. Transfereinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis Ί, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberseite der Trägerplatte (8a) zur Aufnahme von die Schnitte (2) tragenden Objektträgernetzen

(6) bestimmte Vertiefungen (8b) aufweist, denen eine Markierung zur Identifikation der Schnitte (2) zugeordnet ist.

9. Transfereinrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vertiefungen (8b) im wesentlichen auf Form und Grosse der Objektträgernetze (6) abgestimmt sind, jedoch seitliche Verbreiterungen aufweisen, die das Erfassen der Objektträgernetze (6) mittels einer Pinzette erleichtern.

1o. Transfereinrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Vertiefungen (8b) durch einen Deckel (24) abdeckbar sind, der auf den Querschnitt des Rezipienten (1o, 1oa) im Bereich von dessen öffnung derart abgestimmt ist, daß ein Verschieben des Deckels (24) beim Transport des Rezipienten verhindert wird.

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11o Transfereinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1o, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerplatte (8a) an ihrer Unterseite wärmeisoliert ist.

12«, Transfereinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1o, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Kühlkammer (5) vorgesehene Auflage für die Trägerplatte (8) wärmeisoliert ist.

13ο Transfereinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerplatte (8a) mittels eines thermostatisch regelbaren Heizsystems (2o, 21, 22) beheizbar ist.

14. Transfereinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerplatte (8a) einen Isoliergriff (23) aufweist.