DE3112264A1

DE3112264A1 - Konidien entomophager pilze und verfahren zu ihrer gewinnung

Info

Publication number: DE3112264A1
Application number: DE19813112264
Authority: DE
Inventors: Jind&rcaron;ich Praha Chromík; Jan Kybal; Sylvie Kálalová; Anna Sam&scaron;iñáková; Vladimír Vl&ccaron;ek; Jaroslav Weiser
Original assignee: Spofa Spojene Podniky Pro Zdravotnickou Vyrobu; Spofa Vereinigte Pharma Werke
Current assignee: Spofa Spojene Podniky Pro Zdravotnickou Vyrobu; Spofa Vereinigte Pharma Werke
Priority date: 1981-01-29
Filing date: 1981-03-27
Publication date: 1982-08-12
Also published as: DE3112264C2; CS212078B1; FR2480304B1; FR2480304A1; CA1145279A

Description

SPOFA spojene podniky pro zdravotnickou vyrobu

Prag, CSSR

Konidien entomophager Pilze· und Verfahren zu ihrer Gewinnung

Die Erfindung betrifft Konidien entomophager Pilze sowie ein Verfahren zu ihrer Gewinnung durch Oberflächenkultivierung auf einem Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen unter Zugabe von Mineralnährsalzen.

Wie bekannt ist, weisen die Sporen entomophager Pilze eine bedeutsame insektizide Wirkung gegenüber landwirtschaftlichen Schädlichen auf. Das Interesse für entomophage Pilze steigt daher ständig, besonders im Zusammenhang mit den Forderungen, die an moderne Umweltschutz-Methoden gestellt werden (vgl. C. M. Ignoffo, Environm. Lett. 8, 23,

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1975; N. V. Lappa et al., Zaschtschita rastenij 24, 1977). Die bisher angewandten chemischen Pestizide weisen ein relativ breites Wirkungsspektrum auf und stören infolgedessen das Gleichgewicht in der Natur; bei den Schädlingen entsteht ferner sehr rasch Resistenz, und die chemischen Rückstände entwerten die landwirtschaftlichen Produkte. Erfolgreiche Anwendungen von entomophagen Pilzen haben die Vorteile einiger Arten, vor allem aus der Gruppe der Deuteromyceten, erwiesen. Eine dieser Arten ist zum Beispiel der Pilz Beauveria bassiana (BaIs.) Vuill. (vgl. J. Kral, S. Neubauer, Zool. ent. listy 1953, 241; V. M. Goral, N. V. Lappa, Zachist, roslin 20, 51, 1974; P. Forron, Entomophaga 19, 103, 1974; A. Samsinäkovä, A. Cermäkovä, Sbornlk es. akad. zem. ved. Rostlinnä vyroba 6, 163, 1960). Ihrer Anwendung in großem Maßstab standen bisher die Schwierigkeiten entgegen, ein technologisch geeignetes Verfahren zur Gewinnung großer Mengen von Sporen zu entwickeln, die für die Herstellung wirksamer Präparate unter wirtschaftlich günstigen Bedingungen unentbehrlich ist (vgl. McCoy et al., J. Invert. Pathol. 19, 370, 1972; Entomophaga 20, 229, 1975; 0. A. Aljoschina et al., Mikrobiol. promyschlennost 5, 18, 19 76; J. Leopold et al., ZbI. Bakt. Abt. II., 128, 31, 1973). Die submerse Gewinnung von Sporen in einem synthetischen Nährmedium ist zwar technisch durchführbar, es zeigte sich jedoch, daß unter solchen Bedingungen nur die Blasto-arthrosporen entstehen, die während der Konfektionierung und Konservierung des Präparats stark an Virulenz verlieren. Diese Methode mußte daher aufgegeben werden; submers kultivierte Sporen werden deshalb nur noch, vor allem bei Zeitmangel, zur Inokulierung von Nährmedien für die stationäre Kultivierung von Luftkonidien angewandt. Die Luftkonidien, die sich von den apikalen Teilen der konidiogenen Zellen abschnüren, behalten selbst nach dem Trocknen langfristig eine unver-

minderte Wirksamkeit bei (vgl. A. Samsinakovä, J. Invert. Pathol. 8, 395, 1966; N. A. Telenga, V. N. Goral, Biol. met. borby 1967, 171).

Um die Produktion von Luftkonidieh bei Beauveria bassiana zu erzielen, wurden bisher verschiedene feste natürliche Substrate wie z. B. Kartoffeln, Zuckerrüben, Getreide u. ä. herangezogen; das Kultivierungsergebnis wurde ferner oft nur aufgrund des Trockengewichts des gewachsenen Mycels ohne irgendwelche Angaben über die Anzahl der Sporen oder eine nähere Spezifikation des resultierenden biologischen Präparats bewertet. Den ersten quantitativen Angaben zufolge ist es gelungen, auf Kartoffelbrei in Petrischalen ein infektiöses Material mit

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einem Gehalt von 1,5 · 10 Konidien/g Biomasse-Trocken-

gewicht herzustellen. Von einer 100 cm großen Kultiva-

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Lions fläche konnten 14 · K) Konidien erhalten werden; pro Hektar Kartoffelfeld waren 4 kg dieses Präparats erforderlich (vgl. J. Kräl, £. Neubauer, Zool. listy V, 178, 1956). Ähnliche Resultate wurden auf einem Melassemedium, auf Zuckerrübenabsud sowie auf festen Agarmedien erzielt (vgl. N. A. Telenga, V. M. Goral, 1. c; A. A. Jevlachova, L. G. Tarasov, Biol. Method of Plant Pest Control, Riga 1968, 131; E. V. Kononova, Proc. First Joint US/USSR Conference, Kiew, 1979, 173)·. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde die Herstellung eines kommerziellen

Präparats mit einem Standardtiter von 6 ·.10 /g eingeführt (C, M. Ignoffo et al., J. Econ. Ent. 72, 562, 19 79). Für eine wirksame und wirtschaftliche Anwendung unter den Bedingungen der landwirtschaftlichen Großproduktion sind aber sämtliche bisher angewandten Verfahren nur in stark eingeschränktem Maße brauchbar; die so erhältlichen Präparate sind ferner zu teuer.

Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, ein neues, wirtschaftliches, effektives und zugleich einfaches Verfahren zur Gewinnung von Konidien entomophager Pilze wie Beauveria bassiana (BaIs.) Viii 11. anzugeben.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung der Konidien entomophager Pilze wie zB des Pilzes Beauveria bassiana (BaIs.) Vuill. beruht auf der Oberflächenkultur auf einem flüssigen Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalzen und vermeidet sämtliche Nachteile bisheriger Verfahrendes ist dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung auf einem Medium mit einem pH-Wert von 4,0 bis 6,0 und vorzugsweise 5,0 durchgeführt und dabei eine Kohlenstoffquelle, deren Assimilation langsamer verläuft als die von Glucose oder Saccharose, beispielsweise Zuckeralkohole, vorteilhaft Sorbit und/oder Mannit, in einer Konzentration von 0,5 bis 3,0 Gew.-% und vorzugsweise 1 Gew.-% und eine assimilierbare natürliche organische Stickstoffquelle wie zB Maisextrakt, Caseinhydrolysat oder Pepton in einer Konzentration von 0,8 bis 2,5 Gew.-% verwendet werden.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der Oberflächenkultivierung auf dem flüssigen Nährboden besteht darin, daß sie auf großen Flächen nach dem Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen entsprechend der ^S-PS 172 557 durchführbar ist; danach wird dir Kultivierung in einem verschließbaren, sterilen und au I <i⁽'l> I ase-nen Polster aus einer durchsichtigen Kunststoffolie, /.B aus Polyäthylenfolie, durchgeführt, das mit mindestens einer

Zuleitung zur Zufuhr von flüssigen, gasförmigen und/oder festen (suspendierten) Ingredientien versehen ist, die für die Kultur als Nährstoffe und/oder Inokulum und/oder Luft notwendig sind. Die Kultivierungspolster werden zweckmäßig auf einer waagerechten temperierbaren Unterlage inkubiert.

Als besonders vorteilhaft hat sich beim erfindungsgemäßen Verfahren erwiesen, daß mit dem flüssigen Medium im Vergleich zu bisher benutzten festen, breiartigen oder gestreuten Substraten pro Flächeneinheit eine um bis zu zwei Größenordnungen höhere Sporenbildung erzielt werden kann und pro 100-ci
konidien erhalten werden.

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werden kann und pro 100-cm -Fläche 1 · 10 reine Luft-

Die Sporenbildungsintensität hängt stark von der Wahl einer geeigneten Kohlenstoffquelle ab. Als nicht geeignet erwiesen sich die leicht assimilierbaren Hexosen (Glucose und Fructose), aber auch Saccharose, Maltose und wasserlösliche Stärke. Dies deutet auf eine hohe Aktivität der ß-D-Fructofuranosidase bzw. der Amylase und Maltase hin, die einen unbegrenzten Glycolyseverlauf ermöglicht und so das Wachstum des Pilzmycels auf Kosten der Sporenbildung fördert. Maximale Sporenbildung konnte durch Verwendung einer langsamer assimilierbaren Kohlenstoffquelle, vor allem Sorbit, erzielt werden.

Von den technisch zugänglichen Stickstoffquellen bewährten sich natürliche organische Mischungen wie Peptone, Caseinhydrolysat und Maisextrakt am besten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in gleicher Weise wie bei Beauveria bassiana auch .zur Gewinnung der Sporen anderer entomophager Pilze anwendbar, zB zur Gewinnung

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der Sporen von Paecilomyces, Verticillium und Culicinomyces.

Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahren:; besteht darin, daß es in großem Maßstab und ohne aufwendige Produktionseinrichtungen in Kultivierungspolstern aus Polyäthylen durchführbar ist, und zwar sogar auf Flächengrößen von mehreren Quadratmetern (CS-PS 172 552).. Dies ermöglicht überdies auch eine einfache Abtrennung der äußerst konidienreichen Biomasse vom restlichen Medium, das nach Beendigung der Inkubation einfach ablaufen läßt. Die verbliebene Biomasse wird dann ausgepreßt, zerkleinert und im Luftstrom getrocknet.

Die folgenden Heispiele erläutern das orf i ndunqi;q<nti,'ir'.o Verfahren.

Beispiel

Für die Kultur wurde der Stamm 3eauveria bassiana Nr. 30 aus der mykologischen Sammlung der Abt. Pathologie der Insekten des Entomologischen Instituts der Tschechoslowakischen Akademie der Wissenschaften ATerwenaet, der aus einem Imago der Gattung Chrysomelidae isoliert worden war und maximale Wirksamkeit gegen Kartoffelkäfer besitzt

Nach 14tägigem Kultivieren auf Agarmedium nach Sabouraud bei 27 C wurden die Konidien von der Oberfläche abgeschabt und mit steriler Aktivkohle vormischt. Eine so hergestellte und bei 7 bis 10 C aufbewahrte Konserve bleibt einige Jahre lang keimfähig und virulent.

Mit der Konserve wurde ein flüssiges Nährmedium folgender Zusammensetzung beimpft: 2,5 % Glucose, 2,5 % lös-

liehe Stärke, 2 % Maisextrakt, 0,2 % CaCO₃, 0,5 % NaCl, pH 5,0. Das inokulierte Medium wurde bei 27 C auf einer reziproken Schüttelmaschine 72 h lang kultiviert. Mit 25 ml dieses Inokulums wurden 2 000 ml vorher sterilisiertes und abgekühltes Sporenbildungsmedium inokuliert

und in je ein Kultivierungspolster von 0,1 m Eläche (hergestellt nach der CS-PS 172 552) übergeführt. Das zur Sporenbildung verwendete Medium enthielt 1 % Sorbit und 2,5 % Pepton (Bactopepton Spofa) ; pH 5,0.. Die Polyäthylen-Polster wurden bei 27 C 12'Tage lang waagerecht inkubiert. Vom dritten Tag ab wurden über das wachsende und konidienbildende Mycel kontinuierlich 400 ml Luft/min geblasen. Nach Abtrennung und Trocknen der Biomasse wurden

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1 -10 Luftkonidien je Polster gewonnen.

Leerseite

Claims

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München 22 - Steinsdorfstr. 10

233-32.224P-SF-Bk

P 31 12 264.7 8.7.1981

Neuer Anspruch 1

Verfahren zur Gewinnung von Konidlen entomophaijer Pilze wie Deauveria bassiana (BaIs.) Vuill. durch Oberflächenkultivierung auf einem Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen unter Zugabe von Mineralsalzen,

dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung auf einem flüssigen Nährmedium mit einem pH-Wert von 4,0 bis 6,0 durchgeführt und dabei eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, deren Assimilation langsamer verläuft als die von Glucose oder Saccharose, in einer Konzentration von 0,5 bis 3 Gew.-% und eine assimilierbare natürliche organische Stickstoffquelle in einer Konzentration von 0,8 bis 2,5 Gew.-'έ verwendet werden.

-Z.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung Beauveria bassiana (BaIs.) Vuill, verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei pH 5,0 durchgeführt wird.

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4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Zuckeralkohol verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Sorbit und/oder Mannit verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder ^Γ>, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von 1 % eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß als Stickstoffquelle Maisextrakt, Casexnhydrolysat und/oder Peptone verwendet werden.
8. Konidien entomophager Pilze, erhältlich nach dem Vorfahren von einem der Ansprüche 1 -
9. Konidien von Beauveria bassiana (Hals.) Vui Il ., crli.'i I t 1 ich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 2-7.