DE2943190A1

DE2943190A1 - Verfahren zur gewinnung von hochreinen nichtdenaturierten proteinen

Info

Publication number: DE2943190A1
Application number: DE19792943190
Authority: DE
Inventors: Bernard Mirabel
Original assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Current assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Priority date: 1978-10-27
Filing date: 1979-10-25
Publication date: 1980-04-30
Also published as: FR2439791B1; FR2439791A1; BE879679A; DE2943190C2; JPS5737307B2; NL7907901A; JPS5585365A

Description

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Rhone Poulenc

Beschreibung

Verfahren zur Gewinnung von hochreinen nichtdenaturierten Proteinen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von pflanzlichen Proteinen.

* Aus den FR-OSen 75 26 530 und 76 22 985 ist bekannt, daß Proteine tierischer Herkunft mit Hilfe von Kationen- und/oder Anionenaustauscherharzen gereinigt werden können, die durch mineralische Trägerstoffe bedingte physikalische Eigenschaften aufweisen, die eine technische Anwendung dieser Austauscherharze ermöglichen. Die erhaltenen Proteine sind rein und können ohne Nachteil für die menschliche Ernährung Verwendung finden; sie sind aber von ihrem Ursprung her relativ teuer.

Pflanzen, die sehr reichlich und zu relativ niedrigen Gestehungskosten produziert werden, enthalten beträchtliche Mengen an zum Teil genießbaren bzw. verzehrbaren Proteinen, die interessante biologische Aktivität und funktioneH-e Eigenschaften aufweisen können; jedoch bleibt die technische Herstellung dieser Proteine im nicht-denaturierten Reinzustand stark begrenzt. Die Verwendung der genießbaren Proteine für die Ernährung 1st auf die Tierfütterung beschränkt, weil sie bisher nicht in ausreichend reinem Zustand gewonnen werden konnten, um sie für die menschliche Ernährung einzusetzen : Nicht vernachlässigbare Mengen an Verunreinigungen oder Begleitstoffen wie Cellulose, Kohlenhydrate, andere für den

*) bzw. DE-OS 26 38 764

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Menschen nicht genießbare oder verdaubare Proteine, nicht für die Ernährung geeignete und giftige Stoffe sind mit ihnen kombiniert.

Verschiedene chemische physikalische oder fermentative Verfahren wurden bereits erprobt, um diese Begleitstoffe zu entfernen, aber die angewandten, häufig langwierigen und kostspieligen Arbeitsweisen, die in manehen Fällen auf Reaktionen beruhen, welche die Proteine denaturieren, haben nicht zur Lösung des Problems geführt.

Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren besteht darin, daß man eine Proteinlösung mit mindestens einem Ionenaustauscherharz oder mit Kieselsäure oder Tonerde in Berührung bringt, das die eine Korngröße von 4/um bis 5 mm » eine spezifische

2 /
Oberfläche von 5 bis 15Om /g, einen Porendurchmesser von 25 bis 250 nm, ein Porenvolumen von 0,4 bis 2 ml/g und eine Austauscherkapazität unter 2 m Äqu./g aufweist, worauf man die Proteine adsorbiert und sie eluiert; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche behandelt werden soll, ein wässriger Proteinextrakt pflanzlicher Herkunft ist.

Die erfindungsgemäß zu behandelnden Proteinenextrakte pflanzlicher Herkunft können ausgehend von bestimmten Pflanzen oder Pflanzenteilen erhalten werden, insbesondere ausgehend von:

a) den grünen Teilen der Pflanzen wie Blätter von Zuckerrüben, Spinat, Luzerne, welche die angestrebten Proteine und die Begleitstoffe welche entfernt werden sollen, beispielsweise Cellulose, Chlorophylle, Xanthophylle, PoIyphenole und anderes mehr enthalten,

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b) Körner oder Samen wie Samen von Ölpflanzen, beispielsweise Raps, Sonnenblumen, Flachs, Soja, Erdnüsse; die Samen oder Kerne von Legumionosen wie Erbsen, Bohnen (grüne und gelbe), linsen, Saubohnen, kleine Saubohnen; Getreidekörner wie Weizen , Mais, Gerste, Hafer, Roggen; Körner, die die gesuchten Proteine sowie Begleitstoffe_y die entfernt werden sollen wie Cellulose, Polysacharide, Aschen, Schwefelverbindungen und Gerbstoffe enthalten. Im Falle der für die menschliche Ernährung angestrebten Proteine müssen vor allem Haemagglutinine, Antigenfaktoren, Inhibitoren der proteolytischen Aktivität bestimmter Verdauungsenzyme, wenig oder garnicht verdaubare Zucker und andere Geschmacksstoffe entfernt werden;

c) Knollen wie Kartoffeln, die die angestrebten Proteine sowie als Begleitstoffe,welche entfernt werden sollen, Cellulose, Stärke und anderes mehr enthalten.

Die Menge und die Beschaffenheit der Proteine in den Pflanzen hängt von der jeweiligen Pflanzenart und den Behandlungen ab, die der Abtrennung der Proteine voraus gegangen sind, beispielsweise der Extraktion des Öls aus den Ölpflanzen oder der Gewinnung von Stärke aus den Kartoffeln.

Um den wässrigen Proteinextrakt zu erhalten, werden die Pflanzen mit fesser oder mit einer wässrigen alkalischen oder sauren Lösung bei einer Temperatur von 0 bis 10O⁰C, vorzugsweise von 10 bis 7O⁰C während einer Zeitspanne von weniger als 12 Stunden behandelt. Im Falle vom Blättern, Leguminosensamen und Getreidekörnern wird das Pflanzenmaterial in Gegenwart von Wasser oder der alkalischen oder sauren wässrigen Lösung zerkleinert bzw. vermählen. Im Falle der Samen von Ölpflanzen wird der nach dem Auspressen des Öls erhaltene Ölkuchen in Wasser oder der wässrigen alkalischen oder sauren Lösung dispergiert. Im Falle von Kartoffeln ist der wässrige Proteinextrakt der Rückstand oder Rest aus der Extraktion der Stärke.

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Ionenaustauscher im Sinne der Beschreibung sind Kieselsäuren, Tonerden, Anionenaustauscherharze, und Kationenaustauscherharze, die die weiter oben angegebenen physikalischen Merkmale aufweisen, welche wesentlich sind für die Durchführung des Verfahrens. Es sind in der Tat der weite Bereich der Korngrößenverteilung, die kugelige Form des Kornes und seine Porosität, die sioh nicht verändert, gleichgültig welche Ionenstärke oder welcher ph-Wert des Mediums vorherrscht, die mechanischen Eigenschaften, die Widerstandsfähigkeit gegenüber chemischem oder biologischen Abbau und die Wärmebeständigkeit, die die technische Anwendung dieser Produkte ermöglichen.

Die Anionen- und Kationenaustauscherharze bestehen aus einem anorganischen Trägermaterial wie Tonerde oder Kieselsäure, das mit einem Film aus einem vernetzten Polymerisat in einer Menge von weniger als 20 mg/m überzogen ist; der Polymerisatfilm trägt oder enthält Anionen- oder Kationenaustauschergruppen; die Anionenaustauschergruppen sind tertiäre Aminogruppen oder quaternäre Ammoniumsalzgruppen der allgemeinen Formel -N(R) oder -N^⁺'-(R),x'~, in der R gleiche oder verschiedene Alkylgruppen oder Hydroxyalkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und X für ein anorganisches oder organisches Anion steht, beispielsweise für Chlorid, Sufat, Nitrat, Phoshat oder Citrat; die Kationenaustauschergruppen sind Carbonsäuregruppen oder Sulfonsäuregruppen der allgemeinen Formel -COOH oder -SO-zH.

Die vernetzten Polymerisate, die die Oberfläche der Träger für die Anionen- oder Kationenaustauscherharze überziehen, sind ansich bekannte Produkte, die ausgehend von folgenden Monomeren erhalten werden: Epoxyverbindungen, die mit Polyami nen als Katalysator vernetzen ; Formaldehyd, der durch Polykondensation mit Harnstoff, Melamin, Polyaminen oder Phenolen vernetzt; Vinylmonomere wie Vinylpyridin, styrol und seine Derivate, die mit polyfunktionellen Monomeren wie Diacrylsäureestern oder DimethaerylsäureesiErn von Mono- oder PoIyalkylenglykolen, Divinylbenzol, Vinyltrialkoxysilanen, Vinyltrihalogensilanen, bis-Methylenacrylamid in Gegenwart eines Initiators oder von UV-Strahlen vernetzen.

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Die Beschichtung des mineralischen Trägermaterials mit dem vernetzten Polymerisat erfolgt durch Imprägnieren des Trägers mit einer Lösung des oder der Monomeren und gegebenenfalls des Initiators in einem Lösungsmittel, das dann verdampft wird, worauf die Monomeren mit Hilfe bekannter Verfahren vernetzt werden. Ein besonders geeignetes Verfahren zum Überziehen der Trägermaterialien ist in den FR-OSen 75 26530 und 76 22 985 beschrieben.

Die Auswahl des Ionenaustauscherharzes für das erfindungsgemäße Verfahren hängt von den Proteinen ab, die gereinigt werden sollen, das heißt von ihrem isoelektrischen Punkt und von dem pH-Wert der Reaktion.

Der wässrige Proteinextrakt wird mit einem oder mehreren Ionenaustauscherharzen bei einer Temperatur von 0-70⁰C bei einer Ionenstärke und einem pHrWert in Berührung gebracht, die mit den Proteinen verträglich sind. Darauf werden die gesuchten Proteine und/oder gewisse Begleitstoff 6jdie entfernt werden sollen, an dem oder den Harzen oder an der Tonerde oder Kieselsäure adsorbiert.

Je nach den Eigenschaften des Proteinextraktes wie pH-Wert und Ionenstärke können entweder alle gewünschten Proteine an einem Austauscherharz adsorbiert werden oder es wird selektiv ein Teil der Proteine auf einem Harz und ein anderer Teil der Proteine auf einem oder mehreren anderen Harzen adsorbiert.

Je Gramm Gesamtmenge Proteine, die gereinigt werden sollen, werden erfindungsgemäß 5 bis 30 Gramm Ionenaustauscherharz bzw. Tonerde oder Kieselsäure eingesetzt.

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Die Trennung der adsorbierten Proteine erfolgt durch Eluieren entweder mit einer Lösung höherer Ionenstärke oder mit einer Lösung die einen anderen pH-Wert aufweist als bei der Adsorbtion, beispielsweise mit einer Lösung von saurem pH-Wert für starke Anionenaustauscherharze und mit basischem pH-Wert für starke Kationenaustauscherharze , oder mit saurem oder basischem pH-Wert für Kieselsäure, Tonerden oder die schwachen Anionenaustauscherharze oder schwachen Kationenaustauscherharze. Durch aufeinanderfolgendes Eluieren des gleichen Austauschermaterials mit sauren oder basischen Lösungen unterschiedlicher Konsentration können zwei Proteine oder Proteine und Begleitstoffe, die auf dem gleichen Austauschermaterial adsorbiert sind, getrennt werden.

Die Lösung mit saurem pH-Wert ist eine Lösung von Mineralsäuren oder von organischen Säuren, beispielsweise Salzsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Milchsäure; die Lösung mit basischem pH-Wert ist eine Lösung von Alkalihydroxiden,beispielsweise Ammoniumhydroxiden, Natronlauge und Kalilauge.

Die Trennung und Reinigung der Proteine aus den wässrigen Proteinextrakten können mit gleich guten Ergebnissen diskontinuierlich oder halbkontinuierlich in einer Kolonne oder kontinuierlich mit hintereinander geschalteten Kolonnen ausgeführt werden. Die kontinuierliche Arbeitsweise ist besonders geeignet für die Gewinnung der Proteine im technischen Maßstab, da die Ionenaustauscherharze bzw. das Austauschermaterial ein leichtes Füllen der Kolonnen, einen großen Durchsatz und leichtes Eluieren ermöglicht.

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Sie erhaltenen Proteinlösungen enthalten nur noch spurenweise Begleitstoffe. Sie können als solche verwendet werden oder es können die Proteine mit Hilfe beliebig bekannter Arbeitsweisen, vorallem durch Zerstäuben oder Gefriertrocknen getrocknet werden.

Die getrockneten Proteine fallen als weiße oder hellbeigefarbene Pulver an und weisen einen hohen Reinheitsgrad von allgemein über 80%, meistens über 90% auf sowie einen neutralen Geschmack und Geruch. Sie sind nichtdenaturiert.

Die erfindungsgemäß gewonnenen Proteinlösungen und Proteinpulver können entweder auf Grund ihrer biologischen Aktivität verwendet werden wie die Proteine, die proteolytische Aktivität hemmen oder Enzyme, oder sie können auf Grund ihrer funktioneilen Eigenschaften auf technischem Gebiet eingesetzt werden wie in der Papierindustrie; im Falle der genießbaren oder verzehrbaren Proteine können sie für Tierfutteroder auch in der menschlichen Ernährung Verwendung finden.

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung

Beispiel 1

Proteine von Luzerne

50 g frisch gepflückte Luzerne wurden mit 100 ml Wasser vermengt und das Ganze 3 Minuten bei Raumtemperatur vermählen. Nach Filtrieren im Vakum wurde die erhaltene Lösung im Wasserbad während 5 Minuten auf 55°C erwärmt um die Proteine der Chloroplasten, die entfernt werden sollen, in der Wärme zu koalguieren. Dann wurde 20 Minuten mit 3000 Upm zentrifugiert und eine braune Lösung der erwünschten Cytoplasma-Proteine erhalten, die ebenfalls Cellulose, Polyphenole sowie Spuren von ChloroplastrProteinen enthielt.

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Au

Der Feststoffgebalt oder Trockenextrakt der Lösung betrug 25 mg/ml. Der Trockenextrakt enthielt 31 Gew.-^ Proteine. Der Proteinanteil wurde aus dem durch Mikroanalyse ermittelten Stickstoffanteil errechnet.

Es wurde, ein Anionenaustauscherharz verwendet bestehend aus Kieselsäure mit einer Korngrößenverteilung von 100

ρ bis 200 /unfeiner spezifischen Oberfläche von 24 m /g,■ einem mittleren Porendurchmesser von 120 nm und einem Poren volumen von 0,97 ml/g, die mit 3,2 mg/m eines Copolymerisates aus Styrol und Vinyltriäthoxysilan, das -N*·"*"' (CH,)₅ Cl^ ""'Gruppe η trug und folgende Merkmale auf wies, überzogen war:

C	4,8	Gew.-^.
Cl	1,9	Gew. -$
N	0,8	Gew.-^
Austauscherkapazität	0,45	mÄqu./g

10 Gramm dieses Harzes wurden in eine 2,5 cm weite Säule gepackt. Dann wurde das Harz gewaschen indem man 80 ml 0,1 η HCl und dann 150 ml Wasser perkolieren ließ. 80 ml des erhaltenen Proteinextraktes ließ man mit einer Geschwindigkeit von 130 ml/h perkolieren; dann wurde das Harz mit 50 ml Wasser gewaschen.

Die adsorbierten Proteine wurden darauf eluiert, indem man 100 ml 0,01 η HCl mit einer Geschwindigkeit von 130 ml je Stunde perkolieren ließ. Die aus der Säule ausfließende Lösung wurde lyophilisijsrt ;man erhielt 0,55 g eines weißen Pulversidas 91 Gew.-^ Cytoplasma-Proteine der Luzerne enthielt, die nichtdenaturiert waren und für die menschliche Ernährung eingesetzt werden konnten.

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Die Harz packungen der Säule wurde dann regeneriert, indem man 80 ml 0,1 η Salzsäure durchlaufen ließ, wodurch die Polyphenole in Form einer gelben Lösung eluiert wurden; anschließend wurde mit 150 ml Wasser gewaschen. Die Säule war dann bereit für einen anderen Arbeitsgang.

Beispiel 2
Raps - Proteine

Es wurde von einem Raps-Ölkuchen ausgegangen, der naoh Auspressen des Öles erhalten worden war und folgende Merkmale bzw. Zusammensetzung aufwies.

Trockenstoff 94,6 Gew.-^
Proteine 41 Gew.-#

Cellulose 8,17 Gew. -#

Lipide 7,5 Gew.-#

Asche 7,6 Gew.-^

Schwefelverbindungen \10 Gew.-^

5 kg Ölkuchen und 100 1 Wasser wurden 2 Stunden bei 25⁰C miteinander verrührt. Nach dem Dekantieren wurde der flüssige Anteil auf pH 7,7 eingestellt durch Zugabe von 1n Natrolauge und dann filtriert. Der erhaltene Proteinextrakt war eine gelbe, klare Lösung mit einem Feststoffgehalt bzw. Trockenextrakt von 11 g/l, dessen Proteingehalt 25 Gew.-^6 und dessen Gehalt an Thioglukosiden 6,6 Gew.-^ ausmachte.

Eine 8 cm weite Säule wurde mit 800 g Kieselsäure-Kügelchen mit Korngrößenverteilung 100 - 300 /um, spezifischer Ober-

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fläche 27 m /g, Porendurchmesser 118 nm, Porenvolumen 0,4 ml/g und Austauscherkapazität 5 mÄqu./g gepackt.

Nachdem die Kieselsäure mit 5 1 Wasser gewaschen worden war, wurden 10 1 Proteinextrakt im Verlauf einer Stunde perkoliert; darauf wurde die Kieselsäure mit 51 Wasser gewaschen. Die an der Kieselsäure adsorbierten Produkte wurden mit 6 1 0,1n Salzsäure eluiert.

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Durch Zerstäuben der aus der Säule ausfließenden Lösungen wurden 26 g eines beigefarbenen, geruchlosen Pulvers erhalten, das 97 % nichtdenaturierte Proteine enthielt, deren Gehalt an Thioglukosiden weniger als 0,2 % ausmachte und die für die menschliche Ernährung verwendet werden konnten.

Der beschriebene Arbeitsgang wurde 4 mal nacheinander mit der gleichen Säule wiederholt. Die Ergebnisse waren die gleichen wie beim ersten Arbeitsgang.

Beispiel 3
Soja - Proteine

Es wurde ein handelsübliches Sojamehl verwendet, das nach der Extraktion des Öls erhalten worden war und als feines, cremeweißes Pulver mit einem Proteingehalt von 52,4 Gew.-^ vorlag.

5g Mehl wurden mit 125 ml Wasser eine Stunde bei Raumtemperatur verrührt.

Nach dem Filtrieren erhielt man den gewünschten Proteinextrakt in Form einer Lösung mit folgenden Merkmalen:

pH-Wert	6,6	Gew.
Trockenextrakt	1,65	Gew.
Proteingehalt	59,31	mg
Antitrypsin-Aktivität	0,76

des Trockenextraktes

Die Antitrypsinaktivität ist die Trypsinmenge, deren Aktivität durch 1 ml Proteinextrakt gehemmt wird. Das eingesetzte Trypsin wies eine Aktivität von 12 000 BAEE-Einheiten auf; die BAEE-Einheit stellt eine Veränderung der optischen Dichte bei 253 nm von 0,001 je Minute dar, wenn Trypsin auf N-Benzyl-L-aiginin-äthylester (BAEE) bei pH 7,6 und 25°C einwirkt.

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Es wurde einmal die gleiche Kieselsäure wie im Beispiel 2 und zum anderen ein Anionenaustauscherharz eingesetzt. Das Austauscherharz bestand aus Kieselsäure mit einer Korngrößenverteilung von 100 bis 200 /Um, spezifisoher Oberfläche 24 m /g, Porendurchmesser 140 nm und Porenvolumen 1 ml/g, die mit 3,3

mg/m eines Styrol-Vinyltriäthoxysilan Copolymerisat überzogen war, das funktioneile -N-(C₂Hc)₂ Gruppen trug und folgende Merkmale aufwies:

C 4,8 Gew.-#

N 0,9 Gew.-#

Austauscherkapazität 0,5 mÄqu./g

10 g Kieselsäure gemäß Beispiel 2 wurden in eine erste Säule mit Durchmesser 2,5 cm gegeben und 5 g Anionenaustauscherharz in eine zweite Säule mit einem Durchmesser von ebenfalls 2,5 cm.

Nachdem die beiden Säulen hintereinander geschaltet worden waren, wurden Kieselsäure und Harz mit 60 ml Wasser gewaschen. 50 ml Proteinextrakt wurden dann mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h nacheinander durch beide Säulen perkoliert. Die aus der zweiten Säule ausfließende Lösung enthielt keine Proteine mehr.

Die Kieselsäure und das Austauscherharz in den Säulen wurden dann mit 100 ml Wasser vom pH-Wert 6,6 gewaschen. Die an der Kieselsäure adsorbierten Proteine wurden durch Perkolieren von 45 ml 0,1 η Ammoniaklösung eluiert. Nach Verjagen des Ammoniaks durch Einengen im Vakum und Trocknen mittels Iiyophilisieren erhielt man 395 mg eines weißen Pulvere, dae 92 Gew.-^ nichtdenaturierte Proteine enthielt und keinerlei Antitrypsinaktivität aufwies und für die menschliche Ernährung eingesetzt werden konnte.

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Sie auf dem Harz adsorbierten Proteine wurden durch Perkolieren von 45 ml 0,1 η Ammoniaklösung eluiert. Nach Verjagen des Ammoniaks durch Einengen im Vakum und Trocknen mittels lyophilisieren erhielt man 130 mg eines hell beigefarbenen Pulvers, das 85 % nichtdenaturierte Proteine enthielt.

1 mg dieses Pulvers hindert die Aktivität von 0,45 mg Trypsin.

Die erfindungsgemäß abgetrennten und gewonnenen Proteine bestanden βomit im wesentlichen aus Proteinen^welche Trypsin hemmen und die aufgrund ihrer biologischen Aktivität Verwendung finden können.

Beispiel 4
Soja-Proteine

Es wurde mit einem Kationenaustauscherharz gearbeitet bestehend aus Kieselsäure mit Korngrößenverteilung 100 - 200

/Um, spezifischer Oberfläche 23 m /g, mittlerem Porendurch-/ P

messer 116 nm und Porenvolumen 0,97 ml/g, die mit 3,1 mg/m eines Copolymerisate aus Styrol und Vinyl triäthoxysilan überzogen war,das funktionelle-SO-zH Gruppen trug und folgende Merkmale aufwies:

C 4,2 Gew.-#

S 1,3 Gew.-#

Austauscherkapazität 0,41 mÄqu/g

10 g Harz wurden in einei2,5 cm weite Säule gegeben und mit 60 ml Wasser gewaschen.

50 ml gleicher Proteinextrakt wie im Beispiel 3 wurden im Verlauf von 30 Minuten perkoliert. Das Harz wurde dann mit 100 ml Wasser pH-Wert 6,6 gewaschen.

Die am Harz adsorbierten Proteine wurden durch perko-lieren von 45 ml einer 0,1 η Ammoniaklösung eluiert. Nach verjagen des Ammoniaks durch Einengen im Vakum und Gefriertrocknen erhielt man 450 mg eines weißen Pulvers,daB 80 Gew.-# Proteine enthielt und keinerlei Antitrypsinaktivität aufwies und

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das zur menschlichen Ernährung verwendet werden konnte.

Die In Lösung verbliebenen Trypsin-hemmenden Proteine wurden nicht gewonnen,' hierzu muß die Lösung mit einen Anlonenaustauscherharz behandelt werden.

Dieses Beispiel zeigt, daß durch Einsatz eines Kationenaustauscherharzes die zur Ernährung geeigneten Soja-Proteine von den Irypsln-hemmenden Proteine getrennt warden können; aber die erhaltenen Proteine sind nicht ganz so rein wie die mit Kieselsäure nach Beispiel 3 gewonnenen Proteine.

Es kommt also darauf an, das man Im jeden Falle das beste Austauschermaterial auswählt, wenn hochreine Proteine angestrebt werden.

Beispiel 5

Kartoffel-Proteine

Es wurden die nach Extraktion der Stärke erhaltenen "Roten Wässer¹.· eingesetzt, die folgende Eigenschaften oder Merkmale aufwiesen:

pH-Wert 6

Trockenextrakt 45 g/l

Proteingehalt 21 Gew.-^ des Trockenex traktes

In eine . 5 cm weite erste Säule A wurden 85Og Kieselsäure-Kügelchen gepackt mit Korngrößenverteilung 100 - 200 /Um, spezifischer Oberfläche 28 m /g, Porendurchmesser 140 nm, Porenvolumen 1,02 ml/g und Austauscherkapazität 4,5 /UAqu/g. In eine 5 cm weite zweite Kolonne B wurden 850 g Anlonenaustauscherharz gepackt bestehend aus Kieselsäure mit Korn-

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Ai

größenverteilung 100-200 /Um, spezifischer Oberfläche 25 m²/g, Forendurchmesser 128 nm, Porenvolumen 1 ml/g, die mit 2,9 mg/m eines Gopolymerisates aus Styrol und VinyltriSthoxysilan überzogen war, das funktionelle Gruppen -N-(CpHc)₂ und folgende Merkmale aufwies:

C	6,	2	Gew.-%
N	ο,	5	Gew. -$>
	0,	34	mÄqu/g

Austauscherkapazität

Nachdem die beiden Säulen hintereinander geschaltet worden waren, wurden Kieselsäure und Harz mit 5 1 Wasser gewaschen. Darauf wurden 8 1 "rote Wässer" im Verlauf einer Stunde nacheinander durch die Säulen perkoliert. Die aus der zweiten Säule ausfließende Lösung enthielt 321 g Trockenextrakt und der Proteingehalt machte 2,6 Gew.-^ des Trockenextraktes aus.

Kieselsäure und Austauscherharz in beiden Säulen wurden dann mit 5 1 Wasser gewaschen.

Die an der Kieselsäure adsorbierten Proteine wurden durch Perkolieren von 4,7 1 einer 0,1 η Ammoniaklösung eluiert. Nach Verjagen des Ammoniaks durch Einengen im Vakum und Gefriertrocknen erhielt man 56 g eines beigefarbenen Pulvers, das 93 Gew.-tf> nichtdenaturierte Proteine enthielt. Die am Austauscherharz adsorbierten Proteine wurden durch Perkolieren von 5»2 1 0,1 η Salzsäure eluiert. Durch Zerstäubungstrocknen der aus der Säule ausfließenden Lösung erhielt man 49 g eines beigefarbenen Pulvers, das 91 Gew.-96 nichtdenaturierte . Proteine enthielt.

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Claims

DIPL.-CHF.M. DK. E. VKEIHBKK VON FZCHlIANN PROFESSIONAL KEFKESENTATIVES BEFORE THB EUROPEAN PATENT OFFICE DK.-ING. DIETER BEHKENS UANDATAIRES AGRiES PRES l'oFPICE EUKOPEBN DBS BKEVBTS DIFL.-ING.; DIPL.-VIRTSCH.-ING. RUPERT GOBT! D-8000 MÜNCHEN 90 IA-52 773 SCHWEIGERSTRASSE 2 Rhone Poulenc telefon: (089) «β 10 ji TBLEGRAtIM: PROTECTPATENT TB LBX: {14070 Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von nichtdenaturierten Proteinen mit einer Reinheit von über 80 %, bei dem eine Proteinlösung mit mindestens einem Ionenaustauscherharz oder mit einer Zieselsäure oder Tonerde mit einer Korngröße von 4 /Um bis 5 mm, einer spezifischen Oberfläche von 5 bis 15Om /g, einem Porendurchmesser von 25 bis 250 nm, einem Porenvolumen von 0,4 bis 2 ml/g und einer Austauscherkapazität unter 2 EÄqu./g in Berührung gebracht wird, und die Proteine adsorbiert und dann eluiert werden dadurch gekennzeichnet, daß man einen wässrigen Proteinextrakt pflanzlicher Herkunft behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch, gekennzeichnet, daß der wässrige Proteinextrakt erhalten worden ist durch Behandlung von Grünteilen von Pflanzen, Ölpflanzensamen, Leguminosen oder Getreide oder Knollen oder der Reste dieser Pflanzen, nachdem daraus andere Elemente oder Stoffe mit Wasser oder wässrig-alkalischen oder sauren Lösungen bei einer Temperatur von O bis 10O⁰C während einer Zeitspanne von weniger als 12 Stunden extrahiert worden sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch, gekennzeichnet, daß man Anionenaustauscherharze und Kationenaustauscherharze verwendet, die aus Tonerde oder Kieselsäure als mineralischem Trägermaterial überzogen mit weniger als 20 mg/m eines vernetzten Polymerisatfilms bestehen, der tertiäre Aminogruppen oder quaternäre Amonlumgruppenals Aniouenaustauschergruppen oder Kationenaustaaschergruppen in Form von Säuregruppen aufweist.

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ORIGINAL INSPECTED

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4·. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch, g ekennzeichnet, daß man den wässrigen Proteinextrakt und das Ionenaustauschermaterial oder die Kieselsäure oder Tonerde bei einer Ionenstärke und einem pH-Wert.die mit den Proteinen verträglich sind, sowie bei einer Temperatur von 0 bis 7O⁰G in Berührung bringt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch, g ekennzeichnet, daß man 5 bis 30 Gramm Ionenaustauscherharz oder Kieselsäure oder Tonerde je Gramm Gesamtproteine, die gereinigt werden sollen, einsetzt.

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