DE2930794A1 - Verfahren zur herstellung von mikroorganismen mit konstitutiver acylase zur spaltung oder synthese von beta - lactamantibiotika - Google Patents

Description

• Es ist bekannt,dass zur Herstellung von 6- Aminopenicillansäure (6- APS) und von 7- Aminocephalosporansäure (7-ACS) aus 13- Lactamantibiotika Acylasen,welche die Säureamid-Bindung spalten,verwendet werden können.
• 6- APS und 7- ACS werden zur Synthese von verbesserten,semisynthetischen ß- Lactamantibiotika eingesetzt.
• Acylasen wurden in Basidiomyceten,Schicomyceten und Actinomyceten gefunden,die vorzugsweise Penicillin V zu 6- APS spalten und in Bakterien,welche vorzugsweise Penicillin G zu 6- APS und Cephalosporine zu 7- ACS spalten.
• Ausserdem können derartige Acylasen in Umkehrung der Reaktion zur Synthese von 13- Lactamantibiotika verwendet werden.
• Der Stand der Technik zur Verbesserung der Leistungsfahigkeit von Mikroorganismen mittels " genetic engineering " ergibt sich aus den nachstehend aufgeführten Druckschriften.
• Nach Collins J. und Hohn B.(1978) Proc.
• Natl.Acad.Sci.USA,75,4242-4246 und Collins J.
• und Bruning J.(1978) gene 4,85-107 und Collins J. und Hohn B.(1979) Hoppe Seyler's Z.f.Physiol.Chem.360,244 und Patentanmeldung P 28 14 039.8 ist der Begriff des Cosmids p JC 720 und p JC 79 und Cosmidhybrids und der in vitro Verpackung bekannt.
• Plasmide mit hoher Kopierzahl, Col. £ 1, p M3 9, p SC 101, Rsc 11 und ihre Derivate sind aus Tiannis K.N., Cohen S.N. Cabello F.C.
• (1978) Progr. Molec.Subcell.Biol.6,1-58 und aus Collins J. Microbiol. Inourcal.(1977) 78, 121-170 bekannt.
• Die Gewinnung von Plasmiden ist nach Ceewell und Helinsky (1970),Biochem.9,4428-4440 beschrieben.
• Die Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen ist dem Fachmann bekannt nach Roberts GRS Crit.Rev.Biochem. (1976) 4,123-154 und gene (1978) 4,183-193.
• Die Kopplung von gespaltenen DNA- Fragmenten ist aus Collins J. (l.c.) bekannt.
• Es ist nun Aufgabe der Erfindung,mit Hilfe des "genetic eng neering" Mikroorganismen mit konstitutiver Acylase herzustellen zur Spaltung oder Synthese von ß- Lactamantibiotika.
• Das Verfahren der Erfindung ist in Patentanspruch 1 definiert und in den Unteransprüchen ausgestaltet.
• Das Verfahren der Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
• Beispiel 1.
• Die Herstellung von Gesamt- DNA einer Genbank von Escherichia coli ATOC 11 105 mit dem Cosmid p JC 720 wurde nach J.Collins und B.Hohn inProc.Natl.Acad.Sci.USA (1978) 75, 4242-4246 durchgeführt.Nach Replica-Plattierung auf Vollmedien-Agarplatte wurde mit 5 ml Weich-Agar überschichtet,der 0,5 ml einer Ubernachtkultur von Seratia marcescens in 100 ml Uberschichtungsmedium enthält und 3 g/l Penicillin G.Wachstumsinhibitorenzonen entstehen nach Bebrütet bei 37°G über Nacht bei Bildung von 6- APS. In über 10 000 Klonen wurde ein einziger Klon erhalten.
• Die Penicillin-Acylase-Aktivität war in gleicher Höhe wie der Ausgangsstamm und induzierbar.
• Die isolierte DNA von diesem Klon wurde mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Pst I bzw. Hind III gespalten,das Plasmid p BR 322 ebenfalls und die DNA- Fragmente in vitro mit Lipase gekoppelt und in den ß- Laktamase-freien Escherichia coli 5 K durch Transformation eingeführt und mit 20 pg/ ml Tetracyclin heratisselektioniert.
• Mit dem vorher beschriebenen Wachstumsinhibitionstest wurde ein Escherichia coli 5 K mit dem Plasmid p HM 6 bzw.
• p HM 7 isoliert.
• In diese beiden Hybridstämme E. coli 5 K (p HM 6) bzw. (p EM 7) wurden wie folgt quantitiativ die Acylase-Aktivität mit Penicillin G als Substrat bestimmt: 100 mg Bakterienfeuchtmasse und 200 mg Penicillin G wurden in 4 ml 0,9 ffi NaCl-Lösung bei 450C suspendiert und bei pH 7,8 mit 0,1 M NaOR mit einem Autotitrator die Freisetzung von Phenylessigsäure bestimmt.
• Die spezifische Acylase- Aktivität wird definiert: 1 U = 1,i Mol 6 APA/ min.g Balterienfeuchtmasse.
• Die erhaltenen Werte sind folgende: Stanm spezifische Aktivität U bei 45°C nicht induziert induziert + ATCC 11105 5,6 32 E.coli 5 K 1,8 E.coli 5 K (p HM 6) 72 90 E.coli 5 K (p HM 7) - 57 + = mit Phenylessigsäure induziert.
• Beispiel 2.
• Aus dem im Beispiel 1 hergestellten Hybridstamm E.coli 5 K (p HM 6) wurde die Plasmid-DNA p TIM 6 isoliert und 5ng 1 min mit UV- Licht 260 nm im Abstand von 25 cm bestrahlt und der E.coli 5 K mit der mutagenisierten Plasmid-DNA transformiert und wie im Beispiel 1 selektioniert und isoliert.
• Das so erhaltene Plasmid heisst p liM 12.
• Die spezifische Acylase-Aktivität beträgt bei 450C 240 U im nicht induzierten Zustand.
• Die relative Substratspezifität für E.coli 5 K (p BEI 12) ist folgende: Stand der Technik Verfahren der Erfindung Stämme: E.coli ATCC 11105 Bovista- E.coli 5 K induziert plumbea (p HM 12) nicht indu- nicht induziert ziert Substrate 5 Gew, bei 450C Penicillin G 13 Spuren 100 Ampicillin 5,1 - 60 Penicillin V 1,6 3 10 Cephalosporin C - 3 Die Stabilität von E.coli 5 K (p HM 12) wurde wie folgt überprüft: Von einer 50 ml Übernachtkultur von E.coli 5 K (p ERI 12),im Vollmedium bei 300C gezüchtet, wurden auf 20 g Tetracylin- Platten in einer Verdünnung von 10-5 bis 10-10 ausplattiert und mit dem Wachstumsinhibitionstest nach Beispiel 1 auf Acylase- Aktivität überprüft.
• Von 1000 Kolonien konnte keine Acylase-negative Kolonie nachgewiesen werden.
• Bei 40C gelagerte Bakterien-Feuchtmasse von E.coli 5 K (p HM 12) zeigte sich nach 15 Tagen noch die Ausgangs aktivität.
• Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Mikroorganismen bieten gegenüber den Mikroorganismen nach dem Stand der Technik folgende Vorteile: Die Enzymsynthese ist konstitutiv und benötigt keinen Induktor und unterliegt in Gegenwart von Lactose und Fruktose keiner Metabolitdepression,was die Wirtschaftlichkeit der Gewinnung des Biokatalysators erheblich verbessert.
• Die spezifische Aktivität der Acylase zur Spaltung von 13- Laktamantibiotika ist mindestens 15- fach gegenüber einem induziertem Ausgangsstamm erhöht.
• Das Gen ist für die Acylase etwa 5000 -fach angereichert und kann in vivo und in vitro durch spezifische und unspezifische Mutagenese so verändert werden,dass einerseits eine höhere spezifische Aktivität und andererseits eine veränderte Substratspezifität resultiert.
• Durch die erhönte spezifische Aktivität der Acylase ist die Umkehrung der Reaktion, d.h.die Synthese von B-Laktamantibiotika mit höherer Effiienz gegeben.
• Das Gen für die Acylase ist leicht übertragbar aud B-Laktamase-freie dirtsorganismen.

Claims (8)

1. Patent ansprüche l.Verfahren zur erstellung von Mikroorganismen mit konstitutiver Acylase zur Spaltung oder Synthese von ß- Lactamantibiotika, dadurch gekennzeichnet,dass von der Gesamt-DNA eines Acylase-produzierenden Mikro organismus das DNA- Fragment für die Acylase herausgeschnitten und auf Plasmide mit hoher opienzahl in vitro gekoppelt wird und in einen ß- Lactamase- freien prokaryotischen Wirtsstamm eingeführt,selektiv isoliert und gegebenenfalls in vivo oder in vitro mutagenisiert und damit ein Prokaryont mit stabiler,hoher onstitutiver Acylase- Aktivität und gegebenenfalls mit modifizierter Substratspezifität hergestellt wird.
2. 2.Verfahren nach Anspruch Dadurch gekennzeichnet, dass zur Gewinnung eines Acylase-Gen-enthaltenden DNA- Fragmentes von einer Genbank, die durch Cosmide aus der Gesamt-DNA eines Prokaryonten hergestellt ist, ausgegangen wird.
3. 3.Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,dass als Cosmide p JC 720, p JC 79 und deren Derivate verwendet werden.
4. 4.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,dass als Plasmide mit hoher Kopienzahl Col E 1, p MB 9, p SC 101, Rsc 11 und ihre Derivate verwendet werden.
5. 5.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,dass als ß -Lactamase-freier prokaryotischer Wirtsstamm ein Organismus aus der Gattung Enterobacteriaceae verwendet wird.
6. 6.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,dass die Einführung des in vitro an ein Plasmid gekoppelten DNA- Fragmentes für die Acylase mittels Transformation in den Wirtsstamm erfolgt.
7. 7.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,dass ein danach hergestellter Prokaryont mit stabiler, hoher konstitutiver Acylase- Aktivität oder das daraus isolierte Enzym als Biokatalysator zur Rerstellung von 6- Aminopenicillansäure (6- APS) aus Penicillin G oder Penicillin V eingesetzt wird.
8. 8.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,dass ein danach hergestellter Prokaryont mit stabiler, hoher konstitutiver Acylase- Aktivität oder das daraus isolierte Enzym als Biokatalysator zur Herstellung von 7- Aminocephalosporansäure aus Cephalosporinen eingesetzt wird.

   " Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen mit konstitutiver Acylase zur Spaltung oder Synthese von 13- Lactamantibiotika "