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BESCHflEIBUNG
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration
biologischer Substanzen auf der Grundlage der Spektroskopie der inneren Totalreflexion,
bei dem gemRB der Hauptanmeldung P 28 37 769.7-52 zum Regenerieren einer optisch
sauberen Oberfläche des Reflexionselements eine transparente, hochbrechende Substanz
als auswechselbare Zwischenschicht zwischen Reflexionselement und Probe verwendet
wird.
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Die Spektroskopie der inneren Totalreflexion ist im Infrarotspektralbereich
seit 1960 bekannt. Jedoch verhinderte die starke Absorption von Wasser bisher eine
allgemeine Anwendung dieser Untersuchungsmethode auch auf natürliche biologische
und medizinische Proben, die im allgemeinen stark wasserhaltig sind.
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Zwar ist es, wie in der deutschen Offenlegungsschrift 2 606 961 beschrieben,
durch Einsatz von intensiven Laserlichtquellen gelungen, die Schwierigkeiten, die
sich durch die Wasserabsorption ergeben, zu verringern. Jedoch konnten bisher noch
nicht die Schwierigkeiten überwunden werden, die sich dadurch ergeben, daß Biomoleküle,
wie beispielsweise Proteine, zur Adsorption auf der Oberfläche des bei der Spektroskopie
der inneren Totalreflexion verwendeten Reflexionselements neigen, so daß die Gefahr
einer Kontamination beim Probenwechsel besteht; und außerdem konnten die Schwierigkeiten
bisher nicht überwunden werden, die sich weiterhin dadurch ergaben, daß viele der
im Infrarotspektralbereich verwendeten Reflexionselemente toxisch und/oder wasserlöslich
sind.
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Diese vorerwähnten Schwierigkeiten werden bei einem Verfahren der
eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß zur Untersuchung von Probensubstanzen,
insbesondere von Stoffwechselprodukten und Biomolekülen, eine für Infrarotstrahlung
transparente und hochbrechende Substanz als auswechselbare Zwischenschicht verwendet
und eine spektroskopische Untersuchung der inneren Totalreflexion im Infrarotspektralbereich
durchgeführt wird.
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Das bedeutet, daß die vorerwähnten Schwierigkeiten, die sich aus der
Oberflächen Adsorption sowie der Toxizität und/oder Wasserlöslichkeit der im Infrarotspektralbereich
verwendeten Refbxionsiemente ergeben,dadurch überwunden werden, daß reversible und
nichttoxische Oberflächen bzw. Zwischenschichten zwischen der im Infrarotspektralbereich
zu untersuchenden Probe und dem Reflexionselement verwendet werden.
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Im einzelnen kann zum Regenerieren der optisch sauberen Oberfläche
eine flüssige, für Infrarotstrahlung hochbrechende Substanz als Zwischenschicht
verwendet werden, was insbesondere den Vorteil hat, daß man ohne große Schwierigkeiten
sehr dünne Zwischenschichten erzielen kann, denn es ist erwünscht, daß die Schichtdicke
der Zwischenschicht äußerst gering ist. Außerdem kann eine flüssige Zwischenschicht,
nachdem die spektroskopische Untersuchung beendet ist, leicht, zum Beispiel durch
Abwischen oder Abwaschen, entfernt werden.
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Damit die Zwischenschicht möglichst sehr dünn und dabei doch in hohem
Maße in ihrer Dicke gleichmäßig wird, ist es zu bevorzugen, zur Erlangung einer
gleichmäßigen, dünnen Zwischenschicht eine dünne Folie mit Öffnung zu benutzen,
die auf das Reflexionselement so aufgelegt wird, daß die Reflexionsstellen im Bereich
der Öffnung liegen, daß weiterhin die flüssige Substanz in diese Öffnung eingebracht
und darin gleichmäßig verteilt wird.
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Als auswechselbare Zwischenschicht kann aber auch ein dünner Objektträger
verwendet werden, der aus einem für Infrarotstrahlung gleich stark wie oder stärker
als das Reflexionselement brechendernMaterial besteht und in optischem Kontakt mit
dem Reflexionselement angeordnet wird. Eine solche aus festem Material bestehende
Zwischenschicht hat den Vorteil, daß sie eine noch stärkere Barriere als eine FlUssigkeit
zwischen dem Reflexionselement und der Probe bildet, da Diffusionsvorgänge in dieser
Zwischenschicht bei den in Frage kommenden Temperaturen praktisch nicht stattfinden.
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Ein solcher Objektträger kann zudem mit einer, vorzugsweise daraufgedampften
oder chemisch aufgebrachten, Beschichtung aus für Infrarotstrahlung hochbrechendem
Material versehen sein, wodurch es ermöglicht wird, unterschiedliche Grenzflächen
zwischen der Probe und der Zwischenschicht einerseits sowie dem Reflexionselement
und der Zwischenschicht andererseits zu erhalten, also diese Grenzflächen bei einer
insgesamt einstückigen Zwischenschicht unterschiedlichen Erfordernissen der Probe
einerseits und des Reflexionselements andererseits anzupassen.
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Weitere Merkmale der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Figuren 1
bis 4 der Zeichnung anhand einiger besonders bevorzugter Ausführungsbeispiele näher
erläutert; es zeigen: Fig. 1 eine Darstellung einer Meßanordnung zur Durchführung
einer Spektroskopie der inneren Totalreflexion nach dem Stande der Technik; Fig.
2 eine Anordnung eines Reflexionselements und einer zu untersuchenden Probe mit
einem ersten Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäß vorgesehenen
Zwischenschicht; Fig. 3 eine Anordnung eines Reflexionselements und einer Probe
mit einem zweiten Ausführungsbeispiel einer nach der Erfindung vorgesehenen Zwischenschicht;
und Fig. 4 ebenfalls eine Anordnung eines Reflexionselements und einer Probe, zwischen
denen ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäß angeordneten Zwischenschicht
vorgesehen ist.
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In den Figuren der Zeichnung ist jeweils rechts oben eine gegenüber
dem übrigen Zeichnungsmaßstab stark vergrößerte Darstellung des Grenzbereichs zwischen
dem Reflexionselement und der Probe an der Stelle, an welcher die Totalreflexion
erfolgt, wiedergegeben.
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Weiterhin sind in der Zeichnung die auf den Infrarotspektralbereich
bezogenen optischen Brechungszahlen n1 bis n7 für die verschiedenen Medien, die
der für die Spektroskopie verwendete Infrarotlichtstrahl vom Eintritt in das Reflexionselement
bis zum Austiittaus diesem durck3äuft, angegeben, Die Indices stimmen mit den Bezugsziffern
überein, mit denen das jeweilige Element, dem die mit diesem Index versehene Brechungszahl
zugeordnet ist, versehen wurde.
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Zum besseren Verständnis der Erfindung sei zunächst anhand der Fig.
1 kurz eine übliche Meßanordnung zur Durchführung einer Spektroskopie der inneren
Totalreflexion nach dem Stand der Technik erläutert. Diese Meßanordnung weist eine
Lichtquelle L auf, die so ausgebildet ist, daß sie ein möglichst gut kollimiertes
Lichtbündel B erzeugt. Dieses Lichtbündel B durchsetzt die Eintrittsfläche E eines
Reflexionselements
1 und wird dann bei geeigneter Wahl des Einfallswinkels
@ im Inneren des Reflexionselements 1 an der Grenzfläche zwischen diesem
Reflexionselement und einer darauf vorgesehenen Probe 2 totalreflektiert, wobei
die Anzahl der Reflexionen von der Geometrie des Reflexionselements abhängt und
im jeweiligen Meßproblem angepaßt sein sollte. Die Auswahl einer geeigneten Form
des Reflexionselements 1 erfolgt nach an sich bekannten Kriterien, wie sie beispielsweise
in dem Buch "Internal Reflection Spectroscopy" von N. J. Harrick beschrieben sind,
das im Verlag John Wiley & Sons Inc., New York 1967 erschienen ist. Die Totalreflexion
erfolgt, genauer gesagt, in der zu untersuchenden Probe 2, da deren Brechungszahl
n2 geringer als die Brechungszahl des Reflexionselements n1 ist. Bei dieser Totalreflexion
tritt eine quergedämpfte Lichtquelle auf,in der sbh diepektrale Zusammensetzung
des eingestrahlten Lichtbündels B entsprechend den Absorptionseigenschaften der
Probe 2 ändert, so daß man beim Austritt aus dem Reflexionselement 1 ein Lichtbündel
B' erhält, dessen spektrale Zusammensetzung im Vergleich zu dem LichtbUndel B für
die Probe 2 charakteristisch ist. Diese Änderung des Absorptionsspektrums wird mittels
des Spektralapparats S und des Detektors D ermittelt und in einem dem Detektor D
über einen Verstärker V nachgeschalteten Aufzeichnungsgerät A, beispielsweise einem
Schreiber, aufgezeichnet.
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Nun sei auf Fig. 2 Bezug genommen, in der ein erstes Ausführungsbeispiel
der Erfindung dargestellt ist, wobei, ebenso wie in den Fig. 3 und 4, die Lichtquelle
L, die Spektralapparatur S, der Detektor D, der Verstärker V und das Aufzeichnungsgert
A aus Gründen einer vereinfachten Darstellung weggelassen sind.
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Bei dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 2 wird eine flüssige Zwischenschicht
3 zwischen dem Reflexionselement 1 und der Probe 2 vorgesehen. Damit man eine gleichmäßige
und dünne
flüssige Zwischenschicht 3 erhält, wird auf das Reflexionselement
1 zunächst als Hilfsmittel eine Maske aufgelegt, die aus einer dünnen Folie 4 und
einer darin vorgesehenen mittigen Öffnung 8 besteht. In die Öffnung 8 wird eine
geringe Menge an flüssiger, für Infrarotstrahlung hochbrechender Substanz eingebracht,
beispielsweise mittels einer Bürette , mit einem Glasstäbchen, durch Auftropfen
o.dgl., und der Überschuß an flüssiger Substanz, der gewissermaßen über den oberen
Rand der Öffnung 8 hinausragt, wird mit einem Messer, einem Spatel o.dgl. abgestrichen,
so daß man eine flüssige Zwischenschicht 3 erhält, welche die gleiche Dicke wie
die Folie 4 hat. Auf diese Weise ist es durch Verwendung sehr dünner Folien 4 möglich,
äußerst dünne Schichtdicken der flüssigen Zwischenschicht 3 bei gleichzeitig gleichmäßiger
Dicke dieser Zwischenschicht zu erzielen, wie es wünschenswert ist. Zum Schlußwird
die Probe 2 über die flüssige Zwischenschicht 3 geschichtet (im linken unteren Teil
der Fig. 2 ist die Probe nicht dargestellt sondern nur eine Aufsicht auf das Reflexionselement
1 und die Folie 4 mit der Öffnung 8 gezeigt), und zwar so, daß natUrlich die Probe
2 nicht über den äußeren Rand 9 der Folie 4 hinausgeht. Dieser äußere Rand 9 kann
gegenüber der übrigen Fläche der Folie 4 erhöht ausgebildet sein, um die Gefahr
zu vermindern, daß ein Teil der Probe über diesen Rand hinausläuft und direkt auf
die Oberfläche des Reflexionselements 1 gelangen kann.
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Im Infrarotspektralbereich bis 7,5 P ist als flüssige Substanz für
die Zwischenschicht 3 insbesondere Polytrifluoräthylenöl verwendbar, dessen Durchlässigkeit
im Bereich von 2,5 bis 7,5 k zwischen 90 und 98 96 liegt und das eine Bre-20 chungszahl
nD von 1,94 hat. Eine weitere flüssige Substanz für die Zwischenschicht 3, die zur
Anwendung im Infrarotspektralbereich von 1 bis 3,3 /u sowie 3,9 bis 6,5 P und
7,5
bis 40 P geeignet ist, ist Paraffinöl, dessen optische Durchlässigkeit in den erwähnten
Wellenlängenbereichen im wesentlichen oberhalb von 90 % liegt und dessen Brechungs-20
zahl nD° zwischen 1,480 bis 1,484 beträgt.
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Die flüssige Substanz für die Zwischenschicht 3 darf sich mit der
Probe 2 nicht mischen und mit dieser auch keine störende chemische Verbindung eingehen,
so daß sie je nach Art der Probe 2 ausgewählt wird, wenn das erforderlich ist.
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Nach der Durchführung der spektroskopischen Messung wird die Folie
4 abgenommen und die flüssige Zwischenschicht 3 vom Reflexionselement 1 abgewischt
und/oder abgewaschen, wonach in der oben beschriebenen Weise mittels einer neuen
Folie 4 eine neue flüssige Zwischenschicht 3 aufgebracht und auf diese Weise die
nächste Probe 2 für eine spektroskopische Untersuchung vorbereitet werden kann.
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In Fig. 3 ist ein Ausführungsbeispiel veranschaulicht, bei dem als
Zwischensbhicht ein aus Festkörpermaterial bestehender Objektträger 5 zwischen der
Probe 2 und dem Reflexionselement 1 angeordnet ist, wobei außerdem noch zur Herstellung
eines guten optischen Kontaks zwischen letzterem und dem Objektträger 5 eine Immersionsflüssigkeit
6 vorgesehen ist.
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Wenn es nur darauf ankommt, eine Oberflächenkontamination zu vermeiden,
im übrigen aber im speziellen Fall keine Unverträglichkeit zwischen dem Material
des Reflexionselements 1 und der Substanz der Probe 2 besteht, kann der Objektträger
5 aus dem gleichen Material wie das Reflexionselement 1 bestehen. Der Objektträger
5 kann jedoch auch aus einem anderen geeigneten Material bestehen, das eine hohe
Brechungszahl im Infrarotspektralbereich besitzt.
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SchließlXch ist in Fig. 4 ein Ausführungsbeispiel der Erfindung gezeigt,
das sich von dem Ausführungsbeispiel nach Fig.
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3 dadurch unterscheidet, daß auf der der Probe 2 zugewandten Seite
des Objektträgers 5 eine Beschichtung 7 vorgesehen ist, die beispielsweise durch
Aufdampfen oder auf chemischem Wege auf den Objektträger 5 aufgebracht wird. Diese
Beschichtung ermöglicht es unter anderem, an der Grenzfläche zwischen der Probe
2 und dem Objektträger 5 eine noch höhere Brechungszahl zu erreichen oder bei verhältnismäßig
freier Auswahl des Materials des Objektträgers 5 ein für die jeweilige Art der gerade
benutzten Probensubstanz besonders geeignetes Material an der Grenzfläche zwischen
der Probe 2 und dem Objektträger 5 vorzusehen.
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Als Objektträger 5 oder Beschichtung 7 können beispielsweise Germanium,
Silizium,oder Selen verwendet werden; weitere Substanzen, die als Objektträger 5
oder Beschichtung 7 vorgesehen werden können, sind: NaN03, Calcit, Quarz, LiF, MgF2,
CaF2, SrF2, PbF2, T-12, NaF, BaF2, KF, CsF, NaCl, NaBr, KCl, NaJ, KBr, CsCl, AgCl,
TlCl, KRS-6, AgBr, KJ, TlBr, CsBr, KRS-5, CsJ. Auch ist es möglich, als Objektträger
5 oder als Beschichtung 7 ein für Infrarotstrahlung transparentes und hochbrechendes
Polymer zu verwenden, wobei insbesondere für den Fingerprintbereich als Polymer
ein Copolymer aus Polyäthylen und Polypropylen geeignet ist, und zwar vorzugsweise
ein solches mit einem Verhältnis von 97:3 zwischen Polyäthylen und Polypropylen.
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Es ist wichtig, daß in allen Fällen der vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele
zwischen den optischen Brechungszahlen n1 des Reflexionselements 1, n2 der Probe
2, n3 der flüssigen Zwischenschicht 3, n5 des Objektträgers 5, n6 der Immersionsflüssigkeit
6 und n7 der Beschichtung 7 des Objektträgers die Beziehungen eingehalten werden,
die in den Fig. 2 bis 4 angegeben sind.
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Als Objktträger 5 oder Beschichtung 7 kann auch mit gro-Bem Vorteil
Chalcogenidglas verwendet werden; seine Durchlässigkeit liegt im Infrarotbereich
von etwa 1,5 bis etwa 15/um im wesentlichen oberhalb von 50 bis 606, denn auch solche
Durchlässigkeitswerte sind durchaus noch vorteilhaft.
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Das beschriebene Verfahren ermöglicht außer der Erzielung einer regenerierbaren
Oberfläche, d.h. der Verhinderung einer unerwünschten Adsorption auf der Oberfläche
des Reflexionselements und außer der Verhinderung eines unerwünschten Einflusses
des Reflexionselements auf die Probe infolge seiner Toxizität und/oder Wasserlöslichkeit
bei geeigneter Auswahl der Zwischenschicht die Erzielung einer erhöhten Nachweisempfindlichkeit,
indem man das Zwischenschichtmaterial so auswählt, daß bestimmte Substanzen aus
der Probe an dieser Zwischenschicht adsorbiert werden.
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Ende der Beschreibung.