DE2837769C2

DE2837769C2 - Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration biologischer Substanzen in Mehrkomponenten-Systemen

Info

Publication number: DE2837769C2
Application number: DE2837769A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Prof. Dr.-Ing. 7080 Aalen Müller
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-08-30
Filing date: 1978-08-30
Publication date: 1983-09-29
Also published as: DE2837769A1

Description

— die Zwischenschicht gegenüber der zu bestimmenden Substanz inert ist,

— die Zwischenschicht entfernbar und nach wenigstens einer Messung durch eine neue Zwischenschicht ersetzbar ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zwischenschicht aus einer hochbrechenden Flüssigkeit gebildet ist.

3. Vorachtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zwischenschicht das Reflexionselement nur dort bedeckt, wo Reflexionen tatsächlich stattfinden.

4. Einrichtung zur Herstellung einer Zwischenschicht nach den Ansprüchen 2 und 3, gekennzeichnet durch eine dünne Folie, writ der das Reflexionselement überziehbar ist, und die im Bereich der Reflexionen eine Öffnung aufweist, an welcher Stelle die Zwischenschicht aufbringbar und verteilbar isL

¹ 5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zwischenschicht gebildet ist aus einem dünnen Objektträge·, der aus einem Material besteht, dessen Brechungsindex mindestens gleich groß dem des Reflexionsele>v jnts ist, und aus einer Immersionsflüssigkeitsschicht zwischen Objektträgerund Reflexionselement.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine hochbrechende Aufdampfschicht auf dem Objektträger.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zwischenschicht aus einem hochbrechenden Kunststoff besteht.

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration biologischer Substanzen in Mehrkomponenten-Systemen auf der Grundlage der inneren Totalreflexion im ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich. Bei diesem Untersuchungsverfahren wird die Probe auf eine optisch saubere Oberfläche eines Reflexionselements aufgelegt und dieses Element wird so mit Licht beaufschlagt, daß es an der Grenzschicht der Probe zu dem Element total reflektiert wird. Dieses Verfahren ist von großem praktischem Interesse, da es Messungen mit kleinstmöglichen Probenmengen direkt im biologischen Milieu ermöglicht.

Die Spektroskopie der inneren Totalreflexion ist unter der Bezeichnung ATR (attenuated total reflection) im Infrarotspektralbereich seit 1960 bekannt. Jedoch verhinderte die starke Absorption von Wasser bisher eine allgemeine Anwendung dieser Untersuchungsmethode auch auf natürliche, d. h. nicht dehydrierte biologische Substanzen.

Durch Einsatz von intensiven Laserlichtquellen ist es gelungen, die Schwierigkeiten, die sich durch die Wasserabsorption ergeben, zu verringern.

Erst in den letzten Jahren sind hochbrechende Gläser mit ausreichender optischer Qualität erhältlich, die hinreichend wasser- und Iösungsmittelresistent sind. Auch mit solchen Gläsern können jedoch bei den bekannten ATR-Vorrichtungen die Schwierigkeiten nicht überwunden werden, die sich dadurc) ergeben,

ίο daß viele Bio-Moleküle, wie beispielsweise Proteine, zur Adsorption auf der Oberfläche des bei der Spektroskopie der inneren Totalreflexion verwendeten Reflexionselements neigen, so daß reproduzierbare Messungen außerordentlich erschwert sind.

!=; Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration biologischer Substanzen in Mehrkomponenten-Systemen mittels der Spektroskopie der inneren Totalreflexion zu schaffen, die reproduzierbare Messungen mit hoher Nachweisempfindlichkeit im sichtbaren und ultravioletten Spektralbereich ermöglicht

Diese Aufgabe wird, ausgehend von der Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 gemäß der Erfindung durch die im kennzeichnenden Teil dieses Anspruchs angeführten Merkmale gelöst.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorricbiung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die F i g. 1 bis 4 der Zeichnungen näher erläutert; es zeigt

Fig. 1 die Darstellung einer Meßanordnung zur Durchführung einer Spektroskopie der inneren Totalreflexion nach dem Stande der Technik;

Fig.2 ein erstes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung nach der Erfindung mit einer flüssigen Substanz als Zwischenschicht;

Fig.3 ein anderes Ausführungsbeispiel mit einer festen Substanz als Zwischenschif Kt;

Fig.4 ein weiteres Ausführungsbeispiel mit einer oberflächen-beschichteten fester.- Substanz als Zwischenschicht.

In den Figuren der Zeichnung ist jeweils rechts oben eine gegenüber dem übrigen Zeichnungsmaßstab stark vergrößerte Darstellung des Grenzbereichs zwischen dem Reflexionselement und der Probe an der Stelle, an welcher die Totalreflexion erfolgt, wiedergegeben.

Weiterhin sind in der Zeichnung die auf den Spektralbereich der Meßstrahlung bezogenen optisehen Brechungszahlen π für die verschiedenen Medien, die der für die Spektroskopie verwendete Meßlichtstrahl vom Eintritt in das Reflexionselement bis zum Austritt aus diesem durchläuft, angegeben. Die Indices stimmen mit den Bezugsziffern überein, mit denen das jeweilige Element, dem die mit diesem Index versehene Brechungszahl zugeordnet ist, versehen wurde.

Zum besseren Verständnis der Erfindung sei zunächst anhand der F i g. 1 kurz eine übliche Meßanordnung zur Durchführung einer Spektroskopie der inneren Totalreflexion nach dem Stand der Technik erläutert. Diese Meßanordnung weist eine Lichtquelle auf, die ein möglichst gut kollimiertes Lichtbündel erzeugt. Dieses Lichtbündel durchsetzt die Eintrittsfläche eines Reflexionselements 1 und wird dann bei geeigneter Wahl des Einfallswinkels Φ im Inneren des Reflexionselements 1 an der Grenzfläche zwischen diesem Reflexionselement und einer darauf vorgesehenen Probe 2 totalreflektiert, wobei die Anzahl der Reflexionen von der Geometrie

des Reflexionselements abhängt und dem jeweiligen Meßproblem angepaßt sein sollte. Die Auswahl einer geeigneten Form des Reflexionselements 1 erfolgt nach an sich bekannten Kriterien, wie sie beispielsweise in dem Buch »Internal Reflection Spectroscopy« von N.J. Harrick beschrieben sind, das im Verlag John Wiley & Sons Ine, New York 1967 erschienen ist Die bei der Totalreflexion des Lichtbündels im optisch dünneren Medium, d. h. der Probe 2 auftretende quergedämpfte Lichtwelle wird von der Probensubstanz beeinflußt Damit ändert sich die spektrale Zusammensetzung des eingestrahlten Lichtbündels entsprechend den Absorptionseigenschaften der Probe 2, so daß man beim Austritt aus dem Reflexionseiement 1 ein Lichtbündel erhält, dessen spektraie Zusammensetzung im Vergleich zu dem eingestrahlten Lichtbündel für die Probe 2 charakteristisch ist. Diese Änderung wird als Absorptionsspektrum mittels eines Spektralapparats und eines Detektors ermittelt, von dort einem Verstärker zugeführt und beispielsweise mittels eines Schreibers aufgezeichnet.

Im ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich liegt die Eindringtiefe der quergedämpften Li^htwelle in die Probe 2 im Bereich von 0,05 bis 0,5 μπι. Da die Feldstärke dieser Lichtquelle mit zunehmender Eindringtiefe exponentiell abfällt, ist die Erzeugung und Wiederherstellung einer sauberen und reproduzierbaren Grenzfläche von grundlegender Bedeutung für die erreichbare Meßgenauigkeit.

I m Ausführungsbeispiel der F i g. 2 sind, ebenso wie in den F i g. 3 und 4, die Lichtquelle, die Spektralapparatur, der Detektor, der Verstärker und das Aufzeichnungsgerät aus Gründen einer vereinfachten Darstellung weggelassen.

Bei dem Ausführungsbeispiel der Fig. 2 ist eine flüssige Zwischenschicht 3 zwischen dem Reflexionselement t und der Probe 2 vorgesehen. Damit man eine gleichmäßige und dünne flüssige Zwischenschicht erhält, wird auf das Reflexionselement 1 zunächst als Hilfsmittel eine Maske 4 aufgelegt, die aus einer dünnen Folie unc¹ einer darin vorgesehenen mittigen Öffnung besteht. In diese Öffnung wird eine geringe Menge an flüssiger, für die Meßstrahlung hochbrechender Substanz eingebracht, und der Überschuß an flüssiger Substanz wird mit einem Messer, einem Spatel od. dgl. abgestrichen, so daß man eine flüssige Zwischenschicht 3 erhält, welche die gleiche Dicke wie die Folie 4 hat. Auf diese Weise ist es durch Verwendung sehr dünner Folien 4 möglich, äußerst dünne Schichtdicken der flüssigen Zwischenschicht 3 bei gleichzeitig gleichmäßiger Dicke dieser Zwischenschicht zu erzielen, wie es wünschenswert ist. Zum Schluß wird die Probe 2 über die flüsjige Zwischenschicht 3 geschichtet. Im linken unteren Teil der Fig. 2 ist die Probe nicht dargestellt, sondern nur eine Aufsicht auf das Reflexionselement 1 und die Folie 4 mit der öffnung gezeigt.

Die hochbrechende Flüssigkeit 3 muß so beschaffen sein, daß sie sich mit der Probensubstanz 6 nicht mischt und natürlich auch keine störende Verbindung mit ihr eingeht. Zur Messung im UV- und VIS-Spektralbereich kommen als hochbrechende Flüssigkeit 12 Immersionsöle, wie z.B. Br₄(CH)₂ oder Ci₀H₇Br oder auch Polymere, wie z. B. Polyvinylcarbazol und auch Harze in Frage.

Nach der Durchführung der spektroskopischen ίο Messung wird die Folie 4 abgenommen und die flüssige Zwischenschicht 3 vom Reflexionselement 1 abgewischt und/oder abgewaschen. Danach wird in der oben beschriebenen Weise mittels einer neuen Folie 4 eine neue flüssige Zwischenschicht 3 aufgebracht und auf diese Weise die nächste Probe 2 für eine spektroskopische Untersuchung vorbereitet.

In F i g. 3 ist ein Ausführungsbeispiel gezeigt, bei dem als Zwischenschicht ein aus hochbrechendem, transparentem Material bestehender Objektträger 5 zwischen der Probe 2 und dem Reflexionselement 1 angeordnet ist. Zur Herstellung eines guter, optischen Kontakts zwischen dem Reflexionseiement £ und dem Objektträger 5 ist eine Immersionsflüssigkeit 6 vorgesehen.

Im einfachsten Fall kann der Objektträger 5 aus dem gleichen Material wie das Reflexionseiement 1 bestehen. Der Objektträger 5 kann jedoch auch aus einem anderen geeigneten Material bestehen, das eine hohe Brechungszahl im Spektralbereich der Meßstrahlung besitzt, beispielsweise aus einem festen Polymer mit 3() hohem Polymerisationsgrad.

Bei dem in F i g. 4 dargestellten Ausführungsbeispiel ist der feste Objektträger 5 auf seiner der Probe 2 zugewandten Oberfläche mit einer Beschichtung 7 versehen, die beispielsweise durch Aufdampfen auf den Objektträger 5 aufgebracht wird. Diese Beschichtung ermöglicht es an der Grenzfläche zwischen der Probe 2 und dem Objektträger 5 eine noch höhere Brechungszahl zu erreichen. Zur Herstellung der Schicht 7 können beispielsweise Zns oder TiO₂ verwendet v/erdtti. •»o Die beschriebene Vorrichtung ermöglicht außer der Erzielung einer regenerierbaren Oberfläche, d. h. der Varhinderung einer unerwünschten Adsorption auf der Oberfläche des Reflexionselements bei geeigneter Auswahl der Zwischenschicht die Erzielung einer ■»< erhöhten Nachweisempfindlichkeit, indem man das Zwischenschichtmaterial so auswählt, daß bestimmte Substanzen aus der Probe an dieser Zwischenschicht adsorbiert werden.

Die Auswertung der gewonnenen Spektren erfolgt in >» der im Zusammenhang mit Fig. 1 beschriebenen Art. Für eine Vielzahl von Problemstellungen ist es nicht notwendig einen Kontinuumstrahler als Lichtquelle zu verwenden, vielmehr lassen sich auch Mehr-Linien-Strahler (Spektrallampen) verwenden, wenn es aus-5i reicht die relativen Absorptionen an mehreren Stellen im Spektrum zu messen.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration biologischer Substanzen in Mehrkomponenten-Systemen auf der Grundlage der inneren Totalreflexion im ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich, mit einem Reflexionselement, das mit einer Zwischenschicht beschichtet ist, die mit der zu bestimmenden Substanz in Kontakt steht, dadurch gekennzeichnet, daß