DE2837769A1

DE2837769A1 - Verfahren zur bestimmung der konzentration biologischer substanzen in mehrkomponentensystemen auf der grundlage der spektroskopie der inneren totalreflexion im ultravioletten und sichtbaren spektralbereich

Info

Publication number: DE2837769A1
Application number: DE19782837769
Authority: DE
Inventors: Gerhard Prof Dr Ing Mueller
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-08-30
Filing date: 1978-08-30
Publication date: 1980-03-06
Also published as: DE2837769C2

Description

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER KONZENTItATION BIOLOGISCHER SUBSTANZEN
IN MEHRKOMPONENTENSYSTEMEN AUF DER GRUNDLAGE DER SPEKTHOSKOPIE DER INNEREN lOTALREBLEXION IM "ULTRAVIOLETTEN" UND 1,SICHTBAREN" SPEKTRAIBEREICH Die Erfindung betrifft ein Verfahren auf der Grundlage der Spektroskopie der inneren Totalreflexion zur Bestimmung der Konzentration biologischer Substanzen in Mehrkomponentensystemen duch Ausweitling des Absorptionsspektrums im ultravioletten (UV) und sichtbaren (VIS) Spektralbereich. Ein derartiges Verfahren ist von großem praktischen Interesse, denn es erlaubt Messungen mit geringsten Probenmengen direkt im biologischen Milieu.
Nach dem Stand der Technik ist die Methode der inneren Reflexionsspektroskopie ein für den infraroten Spektralbereich unter dem Namen ATR(attenuated total reflection) - Spektroskopie seit längerer Zeit eingeführtes Verfahren /1/. Jedoch war eine Anwendung auf nicht dehydrierte biologische Substanzen praktisch unmöglich, da im IR die Absorption des Wassers stark hinderlich ist.
Einer hinwendung dieser Methode im UV - VIS Spektralbereich stand entgegen, daß erst in den letzten Jahren wasser- und lösungsmittelresistente, hochbrechende Gläser mit ausreichender optischer Qualität erhältlich sind. Aber damit allein ist ein wirtschaftlicher Einsatz des Verfahrens noch nicht gegeben, denn durch Adsorption der Biomoleküle an den Oberflächen sind reproduzierbare Messungen außerordentlich erschwert.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe ZU Grunde, die bestehenden Mängel und Erschernisse eines solchen Verfahrens zu beheben und damit überhaupt erst eine wirtschaftliche Nutzung zu ermöglichen.
Erfindungsgemäß wird dies gelöst durch die Verwendung einer entweder flüssigen oder festen oder elastischen reversiblen Oberflächenbeschichtung, wie im folgenden ausgeführt.
Eine Prinzipskizze eines Meßaufbaus für innere Reflexionsspektroskopie ist in Figur 1 aargestellt. Von einer Lichtquelle ausgehend wird ein möglichst gut kollimiertes Lichtbündel erzeugt.
Das Licht durchsetzt dann senkrecht die Eintrittsfläche des Reflexionselementes (1), und wird dann bei geeigneter Wahl des Einfallswinkels G im Inneren des Reflexionselementes (1) total reflektiert. ( Die Anzahl der Reflexionen hängt von der Geometrie des Reflexionselementes ab und sollte dem jeweiligen Meßproblem angepasst sein. Die Auswahl der geeigneten Form eines Reflexionselemerrteserfolgt nach analogen Gesichtspunkten wie im Infraroten Spektralbereich /1/). Die bei Totalreflexion im optisch dünneren Medium -das ist die zu untersuchende Substanz- (2) auftretende quergedämpfte Lichtwelle wird nun von diesem Medium beeinflusst und damit ändert sich die spektrale Zusammensetzung des eingestrahlten Lichtes. kiese Änderung wird als Absorptionsspettrum dann wie üblich registriert, also z.B. mit Spektrometer, Photodetektor, Verstärker und Schreiber, und anschließend geeignet ausgewertet.
Im UV - VIS Spektralbereich liegt die Eindringtiefe der quergedämften Lichtwelle in einem Bereich von etwa 0,05 bis 0,5 und da weiterhin die Feldstärke der Lichtwelle mit zunehmender Eindringtiefe exponentiell abfällt, ist die Erzeugung und Wiederherstellung sauberer und reproduzierbarer Oberflächen von grundlegender Bedeutung.
Erfingunsgemäß wird dies durch Aufbringen einer auswechselbaren Oberflächenschicht erreicht. Da die Eindringtiefe von dem Unterschied des Brechungsindexes (BI) n der Probe (2) und des Reflexionselementes (RE) (1) abhängt ist ein möglichst hoher BI des RE (1) und somit auch der Oberflächenbeschichtungen (3,5,6,7) notwendig.
Hierfür kommen eine Reihe von Substanzen in Frage und zwar sowohl feste wie flüssige. Demufolge gibt es auch mehrere verschiedene Möglichkeiten eine reversible Oberflächenschicht herbeizuführen.
1) FlüSSigbescflichtg (s.a. Figur 2) Auf die Oberfläche des RE (1) wird eine Maske mit zentraler Öffnung (4) aufgelegt. In die Öffnung wird eine geringe Menge der hochbrechenden Plüssigkeit (3) getropft und mit einem Spatel oder ähnlich glatt gezogen, sodaß vermittels der Haftung durch Rand spannung eine Flüssigkeitsschicht in gleicher Dicke, wie die der umgebenden Maske erreicht wird. Die Schichtdicke sollte äußerst gering sein. Sodann wird die Probe (2) überschichtet.
(Daran anschließend kann das ATR-Spektrum gemessen werden).
Man muß daher von der hochbrechenden Flüssigkeit (3) fordern, daß sie sich nicht mit der Probe mischen oder eine störende chemische Verbindung eingehen darf.
Nach der Messung werden Maske (4) und hochbrechende blüssigkeit (3) vom RE (1) abgewischt; eine neue Maske wird aufgelegt, mit der Flüssigkeit gefüllt .. usw.
Als hochbrechende Flüssigkeiten kommen in Prage: a) Immersionsöle wie z.B. Br4(CH)2 od. C*H7Br etc.
b) Polymere wie Polyvinylcarbazol etc.
c) Harze 2) Feste Beschichtung (s.a. Figur 3 und 4) a) einfache Schicht (E'ig. 3) Ein dünner transparenter Objetbrägei5aus einem hachbrechendem Material wird mittels einer geeigneten Immersionsflüssigkeit (6) in optischen Kontakt mit der Oberfläche des RE (1) gebracht. Im einfachsten i'all besteht das Plättchen (5) aus dem gleichen Material wie das RE (1).
Es kann jedoch auch aus einem anderen geeigneten Material mit hohem BI sein - z.B. aus einem Polymer, das einen wesentlich höheren als unter 1b geforderten Polymerisationsgrad hat und somit fest ist. -b) Mehrfachschicht (Fig. 4) Um an der Grenzfläche zur Probe (2) einen noch höheren BI zu erreichen, kann man das unter 2a erwähnte Plättchen (5) auch noch mit einer hochbrechenden Aufdampfschicht (7) versehen (z.B. ZnS oder TiO2). Das Plättchen (5) selbst ist dann wieder vermittels einer Immersionsflüssigkeit (6) im optischen Kontakt mit dem RE(1).
Bei beiden Methoden 2a und 2b sind die Objektträger (5) ähnlich wie unter 1 Einwegartikel.
Neben dem Vorteil einer regenerierbaren Oberfläche hat das beschriebene Verfahren einen weiteren Vorzug. Bei geeigneter Aus wahl der Beschichtung ist es möglich die Adsorption bestimmter Substanzen aus der Probe zu prpvozieren und somit eine erhöhte Nachweisempfindlichkeit zu erreichen.
Die Auswertung der so gewonnenen Spektren kann dann nach dem Stand der Technik erfolgen. Es sei daraufhingewesen, daß es für eine Vielzahl von Problemstellungen nicht notwendig ist einen Kontinuumsstrahler als Lichtquelle zu verwenden, sondern daß mit Vorteil Xehr-Linien-Strahler (Spektrallampen) Verwendung finden können; dann nämlich, wenn es ausreicht die relativen Absorptionen an mehreren Stellen im Spektrum ZU messen.
Literatur: /1/ N.J. Harrick Internal Reflektion Spectroscopy New York, 1967, Verlag John Wiley & Sons, Inc.

Claims

Patentansprüche: '1):Verfahren zur Bestimmung der Konzentration biologischer "- Substanzen in Mehrkomponenten-Systemen aul der Grundlage der Spektroskopie der inneren Totalreflexion im "ultravioletten" und "sichtbaren" Spektralbereich d a durch gek e n n z e ich ne t, d a B zum Regenerieren einer optisch sauberen Oberfläche des Reflexionselementes eine transparente, hochbrechende Substanz als auswechselbare Zwischenschicht zwischen Reflexionselement (1) und Probe (2) verwendet wird.
2) Verfahren nach 1 d a dur c h g e k e n n z e i c h n e t, d aß zur Regeneration der optisch sauberen Oberfläche eine flüssige hochbrechende Zwischenschicht (3) verwendet wird.
3) Verfahren nach 1 und 2 d a dur c h g e k e n n z e i c h n e t, d aß zur Erlangung einer gleichmäßigen, dünnen schicht (3) eine dünne folie mit Öffnung (4) benutzt wird, die auf das Reflexionselement (1) so aufgelegt ist, daß die Reflexionsatelien im Bereich der Öffnung Liegen, und daß weiterhin die 'lüssigkeit ()) in diese Öffnung eingebracht und gleichmäßig verteilt ist.
4) Verfahren nach 1 da durch g e k e n n x e i c h n e t, daß sich das Reflexionselement (1) in optischem Kontakt (6) mit einem dünnen Objektträger (5) aus dem gleichen oder höher brechendem Material befindet.
5) Verfahren nach 1 und 4 d a dur c h g e k e n n z e i c h n e t, d aß der Objektträger (5) mit einer Äufdampfschicht (7) aus hochbrechendem Material versehen ist.
6) Verfahren nach 1 bis 5 d a du r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß als reversible Oberflächenbeschichtung ((3) bzw. (4)) beziehungsweise Schicht (5) ein hochbrechender Kunststoff verwendet ist.
7) Verfahren nach 1 bis 6 da d u r c h gek e n n z e ich ne t, d a ß die Schichten bzw. Beschichtungen für jede Messung erneuert werden.