DE2928384A1

DE2928384A1 - Disulfidderivate

Info

Publication number: DE2928384A1
Application number: DE19792928384
Authority: DE
Inventors: Tadashiro Fujii; Kikuo Kotani; Nobuaki Nakagawa
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-07-13
Filing date: 1979-07-13
Publication date: 1980-02-07
Also published as: GB2029825B; FR2430943A1; FR2430943B1; GB2029825A; DE2928384C2

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue Disulfidderivate mit einer S-S-Austauschreaktivität der allgemeinen Formel:

(I)

worin R₁ für 2-Benzothiazolyl oder 2-Pyridyl-N-oxid steht, R₂ für eine Alkylengruppe steht, die gegebenenfalls eine freie oder geschützte funktioneile Gruppe aufweist, R^ für eine Carboxylrestgruppe einer Aminosäure oder eines niedrigen Polypeptide steht, R₄ für eine Carboxylgruppe, ihr reaktives Derivat oder eine geschützte Carboxyl- oder Imidatgruppe steht und η den Wert 0 oder 1 hat.

Die neuen Disulfidderivate sind nützliche Reagentien mit einer S-S-Austauschreaktivität, wobei das reaktive Derivat der Carboxylgruppe als ein Einführungsmittel für eine Thiolgruppe verwendet werden kann.

Disulfidderivate mit einer S-S-Austauschreaktivität für Verbindungen mit einer Thiolgruppe sind bereits bekannt und sie werden für die kovalente Chromatographie eingesetzt ("Biochem. J.", Ijg, 573 bis 584 (1973); "Affinity Chromatography-practice and application", Seiten 64 und 65 (1976) K.K. Kodanshaj "Farmacia", 14(1), 47 bis 52 (1978)). Einige der Disulfidderivate werden aufgrund der S-S-Austauschreaktivität als Vernetzungsmittel für die Reaktion zwischen einem Protein mit einer Thiolgruppe und einem Protein mit einer Aminogruppe verwendet ("Biochem. ", 1.7.(8), 1499 bis 1506 (1978)).

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Die S-S-Austauschreaktion der bekannten Disulfidderivate ist jedoch ziemlich langsam und erfordert einen langen Zeitraum. Diese Verbindungen sind daher nicht vorteilhaft.

Eb wurde nun gefunden, daß neue Disulfidderivate der Formel:

o-R₃-^_n-R₄ (ι)

in der R₁, IL,, R,, R₄ und η die oben angegebenen Bedeutungen haben, nützliche Verbindungen sind, bei denen im Falle, daß R₁ für eine 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl-N-oxidgruppe steht und R₂ für eine Alkylengruppe steht, die S-S-Austauschreaktion 3- bis 10-mal so schnell abläuft als im Falle der bekannten Verbindungen.

Gegenstand der Erfindung sind daher neue Disulfidderivate der allgemeinen Formel:

O-R₅-^-R₄ CD

in der R₁, Rp, R*, R₄ und η die oben angegebenen Bedeutungen haben.

Bei der Dlsulfidverbindung der Formel I (nachstehend als Disulfidderivat I abgekürzt) steht R₂ für eine geradkettige oder verzweigtkettlge Alkylengruppe, die gegebenenfalls eine freie oder geschützte funktioneile Gruppe trägt, wobei die funktionelle Gruppe beispielsweise eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe ist, und R₅ steht für eine Abstandsgruppe, die die S-S-Austauschreaktivität nicht nachteilig beeinflußt, z.B. für eine Carboxylrestgruppe einer Aminosäure oder für ein niedriges Polypeptid. Beispiele für Aminosäuren sind bekannte α-Aminosäuren und ω-Aminosäuren. Beispiele

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für niedrige Polypeptide sind Peptide, die durch 2 bis 5 Aminosäuren gebildet worden sind. Rr steht für eine Carboxylgruppe oder ihr funktionelles Derivat, z.B. einen aktiven Ester oder ein Säurehalogenid, oder für eine geschützte Carboxyl- oder Imidatgruppe, und η hat den Wert 0 oder 1.

Beispiele für erfindungsgemäße Disulfidderivate sind in Tabelle I zusammengestellt. Da bei dem Disulfidderivat I die Gruppe IL eine Benzothiazolylgruppe oder Pyridyl-N-oxidgruppe ist und die Gruppe R₂ eine Alkylengruppe ist, ist die S-S-Austauschreaktivität extrem günstig.

Tabelle I

R₁-S

-S-R

-CH₂-

-CH₂-CH₂-

-CH-

CH_? -CH₂-CH-

CH,

NH,

.1.

I I

CH₃NH₂ -CH-

CHpCOOH -CFF-CH₂-

COOH -CH₂-CH-

NHCOCH₂

C
COOH

-NHCH₂ (CH₂) 5 CH₂-

-NE-CH₂-

-NhCH₂COKHCH₂-

-NHCH₂CONKCh-CH,

-COOH

-COO-N

-COOCH

-COQg

-COEr NILCi?

-C-OCH,

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Beispiele der Synthese von Disulfidderivaten I werden nachstehend angegeben:

[H]

HS-R —t-CO-R.-)-R_c [III]

^- 3 η 5

R₁-S-S-R -(-CO-R -*— R {IV]

12 3 η 5

[I]

Darin bedeutet R₅ die gleiche Gruppe wie R^ oder eine Gruppe, die in eine Imidatgruppe umgewandelt werden kann. R₁, R₂, R₇, R^ und η haben die oben angegebenen Bedeutungen.

Beispiele für Verbindungen R₁-S-S-R₁ der Formel II sind 2,2'-Dithiobis-(benzothiazol) und 2,2«-Dithiobis-(pyridin-N-öxid).

Beispiele für Verbindungen HS^-^^O-R^-^pp^ der Formel III sind Thiolcarbonsäure oder ihr Carbonsäurederivat, -die.bzw. das sich mit der Verbindung der obigen Formel II umsetzt, z.B. einem funktionellen Derivat oder einem Schutzderivat eines aktiven Esters oder eines Säurehalogenids, und eine Verbindung mit einer Nitrilgruppe, die in eine Imidatgruppe umgewandelt werden kann, wie z.B. ein Thiolnitril. Beispiele sind Thioglykolsäure, ß-Mercaptopropionsäure, Thiomilchsäure (a-Mercaptopropionsäure), Thloäpfelsäure, Cystein, Penicillamin, Glutathion, das Kondensationsprodukt von filier cap topropionsäure und ε-Aminocapronsäure und ß-Mercaptopropionitril oder sein Carbonsäurederivat. Bei den obigen Verbindungen kann die funktioneile Gruppe in einem Molekül, z.B. eine Amino- oder Carboxylgruppe, erforderlichenfalls

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durch Salzbildung unter Verwendung einer organischen oder anorganischen Säure oder Base geschützt sein oder sie kann durch eine bekannte Schutzgruppe geschützt sein. Diese Schutzgruppen sind in der Peptidsynthese bekannt und sie können durch bekannte Methoden, beispielsweise eine Hydrolyse, saure Zersetzung, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse, leicht entfernt werden.

Beispiele für Schutzgruppen für die Aminogruppe sind Acylgruppen, wie eine Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulf onyl-, p-Toluolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl- oder 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppe, Aralkylgruppen, z.B. eine Benzyl-, Diphenylmethyl- oder Triphenylmethylgruppe (wobei diese Gruppen gegebenenfalls durch eine niedrige Alkoxygruppe, z.B. eine o-Methoxy- oder p-Methoxygruppe, substituiert sein können), Benzyloxycarbonylgruppen, wie z.B. eine Benzyloxycarbonyl-, o-Brombenzyloxycarbonyl-, o- oder p-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, p-Fhenylazo-benzyloxycarbonyl- oder p- (p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, aliphatische Qxycarbonylgruppen, wie z.B. eine Cyclopentyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl- oder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe, und Aralkyloxycarbonylgruppen, wie z.B. eine 2-Phenylisopropoxycarbonyl-, 2-Tolylisopropoxycarbonyl- oder 2-p-Diphenylisopropoxycarbonylgruppe. Die Aminogruppe kann auch durch Enaminbildung durch Umsetzung mit einem 1,3-Diketon, wie Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt sein. Die Carboxylgruppe kann durch Amidbildung, Hydrazidbildung oder Veresterung geschützt sein. Die Amidgruppe ist beispielsweise durch eine 3,4-Dimethoxybenzyl-, Bis-(p-methoxyphenyl)-methyl- oder ähnliche Gruppe substituiert. Die Hydrazidgruppe ist beispielsweise durch eine Benzyloxycarbonyl-,

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TrichlorSthyloxycarbonyl-, Trifluoracetyl-, t-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder 2-p-Diphenylisopropoxycarbonylgruppe substituiert. Die Estergruppe ist beispielsweise durch Alkenol, wie Methanol, Äthanol, t-Butanol oder Cyanomethylalkohol, Aralkanol, wie Benzylalkohol, p-Brombenzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,4,6-Trimethy!benzylalkohol, Benzhydrylalkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brombenzoylmethylalkohol oder p-Chlorbenzoylmethylalkohol, ein Phenol, wie 2,4,6-Trichlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol oder p-Methansulfonylphenol, oder ein Thiophenol, wie Thiophenol, Thiocresol oder p-Nitrothiophenol, substituiert.

Die Hydroxylgruppe kann durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Beispiele für Veresterungsgruppen sind niedrige Alkanoylgruppen, wie beispielsweise eine Acetylgruppe, Aroylgruppen, wie beispielsweise eine Benzoylgruppe, oder eine Gruppe, die sich von einer Benzyloxycarbonyl- oder Äthyloxycarbonylgruppe herleitet. Beispiele für Verätherungsgruppen sind z.B. eine Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder t-Butylgruppe. Weitere bevorzugte Beispiele für Schutzgruppen für eine Ifydroxylgruppe sind 2,2,2-Trifluor-1-t-butyloxycarbonylaminoäthyl- und 2,2,2-Trifluor-i-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen. Die Hydroxylgruppe braucht nicht immer geschützt zu sein. Als Beispiele für Schutzgruppen von Iminogruppen können Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Adamantyloxycarbonyl-, 2,2,2-Trifluor-1-t-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor-i-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen genannt werden. Die Iminogruppe braucht nicht immer geschützt zu sein.

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Thiolcarbonsäuren, die das Kondensationsprodukt von Aminosäuren oder niedriger Peptide von 2 bis 4 Aminosäuren sein können, können in der Weise hergestellt werden, daß man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter endständiger Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien a-Aminogruppe und einer geschützten endständigen Carboxylgruppe umsetzt oder indem man eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer aktivierten a-Aminogruppe und einer geschützten endständigen Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder ein Peptid mit einer freien endständigen Carboxylgruppe und einer geschützten a-Aminogruppe umsetzt.

Eine Verbindung der Formel:

R₁-S-S-R₁ (II) wird mit einer Verbindung der Formeis

-R₃-4j-R₅ (III)

gewöhnlich in einem Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, umge setzt.

Zu dem Lösungsmittel wird jede Verbindung im äquimolaren Verhältnis zugesetzt und bei 10 bis 70°C, vorzugsweise bei 70⁰C, 10 min bis 5 h lang, vorzugsweise 2 bis 3 h lang, umgesetzt.

Nach der Reaktion wird das Produkt der Formel:

R₁-S-S-R₂-(-CO-R₃-^-R₅ (IV)

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⁹ 292838A

auf übliche Weise, beispielsweise durch Abkühlen und Extraktion, erhalten.

In dem Produkt bleibt die Carboxylgruppe so, wie sie ist, zurück oder eine Carboxyl- oder Nitrilgruppe wird in herkömmlicher Weise in das reaktive Derivat der Carboxylgruppe oder in eine geschützte Carboxylgruppe umgewandelt und weiterhin wird eine Nitrilgruppe in eine Imidatgruppe umgewandelt, wodurch das Produkt der Formel I erhalten wird.

Beispiele für reaktive Derivate der Carboxylgruppe sind herkömmliche Derivate, wie das Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid, ein aktiver Ester oder ein Säurehalogenid, z.B. ein Cyanomethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, p-Methansulfenylester, Thiodylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester oder N-Hydroxypiperidinester. Weitere reaktive Derivate können erhalten werden, indem man ein Carbodiimid, ein N,N¹-Carbonyldiimidazol oder eineIsoxazoliumverbindung, beispielsweise ein Woodward-Reagens, verwendet.

In Tabelle II sind verschiedene Beispiele für erfindungsgemäße Disulfidverbindungen, verglichen mit 3-(Pyridin-2'-yldithio)-propionsäure, zusammengestellt. Die S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit wurde durch Umsetzung mit Dithiothritol, enthaltend 1mM EDTA in O,2M-Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), als eine Verbindung mit Thiolgruppe gemessen. Danach wurde die erhöhte Absorption bei der maximalen Absorptionswellenlänge gemessen, um das Molverhältnis der S-S-Austauschreaktion pro min zu bestimmen.

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Aus der Tabelle ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen Disulfidderivate eine höhere S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit haben.

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Tabelle II

R₁-S-S-R₂

CQ

feo

•Η «Η

-CH₂-CH₂-

-CH-

CH.

-CH₂ -CH₂-

-CH₂-CH₂-

-CH₂ »Ch-

NH.

Uh,

-C-CH-CH₃ ¹IvH₂

-CH-CH₂COOH

-CH·CH,-

.1

UOH

-f-CO RA-

-CONHCH₂ (CH₂) a CH₂-

—COOH

-COOH

-CH,

-CH₂-CH₂'

-CH₂ »CH-NH,

CH.

-C -CH-

CH.

NH.

-COOH

Ver- ·
gleicl

-CH₂-CH₂- -COOH

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- 1;

Fortsetzung Tabelle II

	gemessene	gemessene WeI l°n.l spnff	Reaktions* M)I ^_irj
		' 3 IO ns
	ι,	ti	37. 4
	"-	*'·'■■ Il*	35.7
	Il	it	34.3
	"	Il	35. 6
	Il	It	35.0
	Il	Ii	36. 2
	\ VsK	3 3 3 nn	93 . 6
		//	V3. D
		//	9 0.3
		*	91 . 6
	343 nm	8. 7 •

ι ^s ~ ^ε - Austauschgreschwindig-]

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Die Disulfidderivate I sind nützliche Verbindungen als Einführungsmittel für eine Thiolgruppe und als Vernetzungsmittel. So wird z.B. das Disulfidderivat I mit einer Verbindung mit einer reaktiven Wasserstoffgruppe als Aminverbindung in einem Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol, Chlorofonr., Aceton, Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Kondensationsreagenses umgesetzt, um eine Ester-, Amidino- oder Amidbindung durch Umsetzung der reaktiven Gruppe R. des Disulfidderivats mit der Hydroxylgruppe oder Aminogruppe in einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe oder einer Aminverbindung zu bilden. Danach wird die Disulfidbindung der Verbindung hydrolysiert, um cie Thiolgruppe in die Verbindung mit der Hydroxylgruppe oder in die Aminverbindung einzuführen. Die obige Verbindung mit einer Ester- oder Amidbindung wird auch mit einer Verbindung mit einer Thiolgruppe in Gegenwart eines wäßrigen Mediums bei einem pH-Wert von 7 bis 8 umgesetzt, um die S-S-Austauschreaktion herbeizuführen, wodurch die Verbindung mit der Thiolgruppe und die Verbindung mit der Hydroxylgruppe oder die Aminverbindung vernetzt werden.

Beispiele für Verbindungen mit einer Hydroxylgruppe oder Aminverbindungen sind Insulin, Albumin, Wachstumshormon, Calcitonin, Prolactin, ACTH, PTH, Glucagon, Gastriesin, Secretin, JT-Globulin oder Immunkomponenten, wie z.B. IgG, IgM, IgA, sekundäre Antikörper, Östrogene, ATP, Catecholamin, Tri3odthyronin, Antigene von Antibiotika oder Hypnotika, Antikörper, sekundäre Antikörper und Haptene, oder Oxidoreduktasen, wie Peroxidase, Catalase, Cholesterinoxidase, Glycerinaldehydrogenase oder Cholinoxidase, Hydrolase, wie alkalische Phosphatase, Glucoamylase, Phospholipase D, ß-Galactosidase oder Lysozym oder andere Transferase, Lyase, Isomerase, Polysaccharide, wie Cellulose, aminierte Cellulose, Agarose, Dextrin, Dextran oder ihre wasserunlöslichen

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Träger oder wasserunlösliche Träger mit Hydroxyl- oder Aminogruppen, wie aminiertes Polyamid, Polyacrylnitril oder Silan. Die Träger schließen auch entweder bekannte Verbindungen oder neue Verbindungen ein, die erfindungsgemäß als Träger eingesetzt werden können. Beispiele für neue Verbindungen mit Aminogruppen sind i-aminopropylierte Polyamide, Aminoderivate von Polyacrylnitrilpolymeren oder Polymere der Polyacrylnitrilgruppe. ^-aminopropylierte Polyamide werden hergestellt, indem man einen Polyamidträger, wie 6,6-Nylon und 6-Nylon, in Γ-Aminopropyltriäthoxysilan 3 h lang auf 100⁰C erhitzt, um teilweise Γ-Aminopropylgruppen in die Amidgruppen der Polyamidverbindung einzuführen. Die Aminoderivate der Polyacrylnitrilpolymeren oder der Polymeren der Polyacrylnitrilgruppe können in der Weise hergestellt werden, daß man ein Polyacrylnitrilpolymeres oder ein Polymeres der Polyacrylnitrilgruppe in Gegenwart von Lithiumaluminiumhydrid in einem Medium, wie Diäthyläther, Dioxan oder Tetrahydrofuran, 1 bis 48 h lang am Rückfluß erhitzt, um Aminogruppen mit teilweise reduzierten Nitrilgruppen zu bilden.

Beispiele für Verbindungen mit einer Thiolgruppe sind z.B. Enzyme, wie Peroxidase, Catalase, ß-Galactosidase oder alkalische Phosphatase oder Haptene, oder Verbindungen, in die eine Thiolgruppe durch S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid ("Arch. Biochm. Biophys.", £6, 605 bis 612 (1962)) eingeführt worden ist, oder eine Verbindung, in die eine Thiolgruppe eingeführt worden ist, die eine Hydroxylgruppe aufweist, hergestellt durch Hydrolyse des Disulfidderivats I oder einer Aminverbindung.

Die S-S-Austauschreaktion wird, wie oben erläutert, in der Weise durchgeführt, daß man die obigen Verbindungen beliebig in herkömmlicher Weise in einem wäßrigen Medium, wie einem

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Puffer mit pH 7 bis 8, bei Raumtemperatur miteinander kombiniert. Das Reaktionsprodukt wird durch herkömmliche Trenn- und Reinigungsverfahren, beispielsweise durch Aussalzen, Phasenabtrennung, Extraktion, Dialyse oder Adsorptionschromatographie, gewonnen. Die auf diese Weise hergestellte Verbindung ist eine vorteilhafte und nützliche Verbindung für immobilisierte Enzyme, die Vernetzung von Enzymen mit wasserunlöslichen Trägern, für immobilisierte Antigene oder Antikörper, für die Vernetzung von Antigenen oder Antikörpern mit wasserunlöslichen Trägern, für antigene Haptene, für die Vernetzung von Protein und Hapteh oder als Enzymimmunr. Assaykomponente oder für die Vernetzung von Enzym- und Immunkomponenten.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1

Zu 2,2^f~Dithiobis-(benzothiazol) (13,2 g) wird Benzol (400 ml; und 3-Mercaptopropionat (6 g) gegeben und das Gemisch wird bei 70⁰C 3 h lang unter Rühren umgesetzt. Danach wird das Reaktionsgemisch in einem Eisbad abgekühlt, um rohe Kristalle (13,8 g) auszufällen, die aus Benzol umkristallisiert werden. Es werden 3-(Benzothiazol-2^l-yl-dithio)-propionatkristalle (12 g) erhalten.

^S-S-

CH₂-CH₂-COOH V pp

Ämax: 272 nm(Methanol) Rf: 0,33 (TLC, Silicagel, Benzol : Äthylacetat =1 : 2)

Beispiel 2

2,2'-Dithiobis-(pyridin-N-oxid) (4,3 g) wird zu Chloroform

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(200 ml) und 3-Mercaptopropionat (3g) gegeben und das Gemisch wird bei 70°C 3 h lang umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt und rohe Kristalle kommen zur Ausfällung. Sie werden aus Chloroform umkristallisiert, wodurch Kristalle von 3-(Pyridin-N-oxid-2^l-yl-dithio)-propionat (4,1 g) erhalten werden.

QS-E-CH₂-CH₂-COOH :
Pp 126 bis 218⁰C

⁰ Amax: 270 nm (Methanol

Rf: 0,66 (TLC), Silicagel, Butanol : Essigsäure : Wasser = 4:1:1).

Beispiel 3

Zu dem 3-(Benzothlazol-2^l-yl-dithio)-propionat (3 g) in Äthylacetat (20 ml) wird N-Hydroxysuccinimid (1 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (1,7 g) gegeben und das Gemisch wird 3 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird mit Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen, um nicht-umgesetzte freie Säure zu entfernen. Die Äthylacetatschicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird aus heißem Petroläther umkristallisiert, wodurch Kristalle von 3-(Benzothiazol-2^I-yl-dithio)-propionat-succinimidester (2,4 g) erhalten werden.

CH₂-CH₂-COO^I: fP 114 bis 115°C,

^{2 2} _0<^J ter Wert 121 bis 123⁰C

/\max; 270 nm (pH 7,5, wäßriges Dimethylformamid) 0,53 (TLC, Silicagel, Benzol : Äthylacetat =3 : 1).

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Beispiel 4

Ein Gemisch von 3- (Benzo thiazol-2'-yl-dithio )-propionat (3g), erhalten nach dem Herstellungsverfahren gemäß Beispiel 1, und p-Nitrophenol (1,2 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (2,1 g), gelöst in Äthylacetat (20 ml), wird 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das weitere Vorgehen erfolgt wie im Beispiel 3, wodurch 3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionat-p-nitrophenylester (1,85 g) in Form von Kristallen erhalten wird.

Pp 113 bis 114°C Xmax: 279 nm (pH 7,5, wäßriges Dimethylformamid) Rf: 0,84 (TLC, Silicagel, Benzol : Äthylacetat = 5:1)

Beispiel 5

3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionat (3 g), gelöst in Thionylchlorid (10 ml), wird 2 h lang bei 25°C umgesetzt, wonach Thionylchlorid im Vakuum entfernt wird, wodurch 3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionylChlorid als ölige Substanz erhalten wird.

CH₂-CH₂COCl

Λ-max «= 272 nm (Methanol)
Rf =0,25 (TLC, Benzol)

Beispiele 6 und 7

3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionatsuccinimidester (1,3 g),

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hergestellt gemäß Beispiel 3, und ε-Aminocapronsäure (0,6 g) werden zu Tetrahydrofuran (50 ml) gegeben und das Gemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht umgesetzt. Das Tetrahydrofuran wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird danach in heißem Isopropanol aufgelöst und abgekühlt, wodurch Kristalle von 6-N-[3-(Benzothiazol-2»-yl-dithio)-propionyl]-aminohexansäure (0,8 g) erhalten werden.

S-S-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-(CH₂)₃-CH₂-COOH

λmax β 272 nm (in Methanol)

Rf β 0,07 (TLC, Silicagel, Benzol : Äthylacetat =1:2)

Die obengenannte Verbindung (500 mg), N-Hydroxysuccinimid (200 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (340 mg), gelöst in Tetrahydrofuran (10 ml), werden 3 h lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Tetrahydrofuran wird abdestilliert. Der Rückstand wird in heißem Petroläther aufgelöst und abgekühlt, wodurch Kristalle von 6-N-[3-(Benzothiazol-2«-yl-dithio)-propionylj-aminohexanat-succinimidester (430 mg) erhalten werden.

~^(CH2^}3"^CH2 ^C0°^N

λmax: 271 nm

Rf: 0,42 (TLC, Silicagel, Benzol : Äthylacetat =3:1)

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Beispiele 8. 9 und 10

3- (Pyridin-N-oxid-2 · -yl-dithio)-propionat, hergestellt gemäß Beispiel 2, wird zur Herstellung des Succinimidesters, des p-Nitrophenylesters und des Säurechlorids davon nach den Methoden der Beispiele 3,4 bzw. 5 verwendet.

Succinimidester:

0-

S-S-CH₂-CH₂-COO-N

λ max: 260 mn (Methanol)

Rf: 0,25 (TLC, Silicagel, Benzol : Äthylacetat » 3: .1)

p-Nitrophenyles ter:

λmax: 391 nm (Methanol Rf: 0,82 (TLC, Silicagel, Benzol

Äthylacetat = 3 : 1)

Säurechlorid:

CJ- S-S-CH,-

₂ CH₂ -C

: 270 nm (Methanol)
Rf: 0,15 (TLC, Silicagel, Benzol : Äthylacetat = 3 : Ό

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Beispiel 11

2_t2^l-Dithiobis-(benzothiazol) (1,1 g) und 3-Mercaptopropionitril, gelöst in Benzol (50 ml), werden bei 70⁰C 3 h lang tinter Rühren umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird in einem Eis/Wasser-Bad abgekühlt, wodurch rohe Kristalle erhalten werden, die aus Benzol umkristallisiert werden, wodurch 3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionitril (750 mg) erhalten wird. 700 mg davon werden zu einer Methanollösung (50 ml), die HCl (19 g) enthält, gegeben und das Gemisch wird bei 5°C über Nacht umgesetzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert, wodurch ein rohes Pulver erhalten wird, das mit Benzol gewaschen wird, wodurch Methyl-3-(benzothiazol-2'-yldithio)-propionimidat-hydrochlorId (720 mg) erhalten wird.

Amax = 272 nm (Methanol)

Rf = 0,05 (TLC, Silicagel, Benzol : Äthylacetat =1:2)

Beispiele 12 bis 35

2,2^f-Dithiobis-(benzothiazol) oder 2,2«-Dithiobis-(pyridin-N-oxid), wie oben hergestellt, werden zusammen mit Thioglycolsäure, Thlomilchsäure, Cystein, Thioäpfelsäure, Penicillamin, N-(2-Mercaptopropionyl)-glycin oder Glutathion
bei den gleichen Reaktionsbedingungen wie oben eingesetzt
und es werden die folgenden Verbindungen erhalten. In den
Beispielen werden die Rf-Werte für Silicagel-Dünnschichtchromatographie angegeben.

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JT >-S-S-CH₂CO0H

N'

« 272 nm (Methanol) Rf » 0,36 (Benzol : Methanol. - 1:2) S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit: 35,6 p.Mol/min

CH₃

Xmax: 272 nm Rf: 0,38 (Benzol : Methanol =1 : 2)

Amax: 271 nm (Methanol) Rf: 0,08 (Benzol : Methanol =1:2)

0,60 (obere Schicht; Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 ί 1 ! 5)

j OH_ZCOOH

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max: 271 nm (Methanol) Rf: 0,15 (Benzol : Äthylacetat =1:2)

CH₁NH₂.

Amax: 271 nm (pH 7,5, Phosphatpuffer) Rf: 0,60 (Butanol : Essigsäure : Wasser =4:1 : obere Schicht)

CH₃

-S-C—CH-COOH H

Amax: 271 nm (Methanol)

Rf: 0,30 (obere Schicht; Butanol : Essisäuge : Wasser =4:1:5) S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit: 35,5 η Mol/min

CHj

CH₃ NH

Amax: 271 nm, 418 nm (Methanol

Rf: 0,23 (obere Schicht; Butanol : Essigsäure : Was ser =4:1 f 5)

9Ό9886/0Β77

271 nm ( Methanol) Rf: 0,48 (Benzol : Äthylacetat W 3 : 1)

5-S-CH-CO-NH-CH₉-(CH₉) .,-CH₉-CODH CW₃

λ max: 271 nm (Methanol)

Rfx 0,12 (Benzol s Äthylacetat «3:1)

S-S-Austauschreaktionsgeschwlndlgkeit: 35,0 jx Mol/min

λ max: 278 nm

Rf: 0,80 (Benzol : Äthylacetat =3:1)

CH₃

Amax: 271 nm (Methanol)

Rfx 0,15 (Benzol : Äthylacetat - 3: 1) S-S-Austaxischreaktionsgeschwindigkeit: 36,6 ii Mol/min

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I :j >-S-S-CH-CONHCH₂COO-N j ^ ^N CH.

λ max: 271 run (Methanol)

Rf: 0,80 (Benzol : Äthylacetat

ζΚ^-$~$-ίΗ- CONHCHzCOKH CCHz),

CH;

Xmax: 271 run (Methanol) Rf: 0,10 (Benzol : Äthylacetat «3:1) S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit: 35,7 η Mol/min

CH₃

CH₃ NH₂-HCJl

λπιβχ: 271 run (Methanol)

Rf: 0,05 (Benzol : Äthylacetat «3:1)

ay S-S- CH₂-CH-CONHcH₂COOH *Ν I

NHCOCHzCHz CH-COOH

909 8 8 6/0677

^max: 272 nm (Methanol)

Rf: 0,31 (obere Schicht; Butanol : Essigsäure ; Wasser «=4:1:5) S-S-Austauschreaktlonsgeschwindigkeit: 35,2 u Mol/min

Xmax: 270 nm (Methanol)

Rf; 0,7 (obere Schicht; Butanol : Essigsäure : Wasser = 4:1:1) S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit: 92,8 uMol/min

⁽²⁸⁾ η

νΛδ-S-CH-COOH 4-

CHj

Amax: 270 nm (Methanol) Rf: 0,66 (Butanol : Essigsäure : Wasser =4:1:1,

obere Schicht) S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit: 93,2 uMol/min

S- S-CH- COO—(/ y-N O₁ CH₃

: 310 nm (Methanol) Rf: 0,82 (Benzol : Äthylacetat =3:1)

909886/0677

-S-S-CHCONHCHiCCH,),

!- ■· I 0 CH₃

λmax: 271 nm (Methanol) Rf: 0,41 (Butanol : Essigsäure : Wasser »4:1:1) S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit: 92,6 η Mol/min

S-S-CHt-CHCOOH I

Λ max; 271 mn (Methanol) Rf: Oj.25 (Butanol : Essigsäure : Wasser «=4:1:1)

4/

CH₂COOH

Xmax: 270 nm (Methanol) Rf: 0,32 (Butanol : Essigsäure : Wasser »4:1:1) S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit: 90,1 uMol/min

I NHCOCH₅LGHiCHCOOH

KHz

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: 270 nm

Rf: 0,20 (Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 1:1) S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit: 91,5 η Mol/min

S-S-C-C
O- CH, OCH₃

λmax: 270 nm

Rf: 0,41 (Butanol : Essigsäure : Wasser= 4:1 : 1)

Λ max: 270 nm
Rf: 0>25 (Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 1 : 1)

Referenzbeispiel 1

Zu Rinderinsulin (0,6 mg), gelöst in 0,1M-Veronalpuffer (pH 7,5, 10 ml), wird Dimethylformamidlösung (1 ml) von 3-(Benzothiazol-2-yl-di-üiio)-propionat-succinimidester (3,1 mg) gegeben. Es wird 4 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt, um das Produkt auszufällen. Dieses wird 10 min lang bei 3000 Upm zentrifugiert, wodurch das Insulinderivat erhalten wird, in das die 3-(Benzothiazol-2¹-yl-dithio)-propionitrilgruppe eingeführt worden ist.

§09886/0677

Das Insuiinderivat wird mit Citratpuffer (pH 5) gewaschen und in 0,1M-Phosphatpuffer (10 ml, pH 7,5) aufgelöst.

Zu der Lösung (0,1 ml) wird ß-Galactosidase (5 mg), gelöst in Ehosphatpuffer (pH 7,5, 5 ml), gegeben und es wird bei Raumtemperatur 1 h lang umgesetzt. Danach wird das Reaktionsgemisch auf eine Säule von Sephadex G-100 (Warenzeichen, 1 χ 80 cm) aufgegeben und es wird mit 0,01M-Ehosphatpuffer (pH 7,5), enthaltend 0,15M-NaCl, eluiert. Es werden jeweils Fraktionen mit 4 ml gesammelt. Die Fraktionen Nr. 7 und 8 werden gesammelt, um die vernetzte Verbindung von Insulin und ß-Galactosidase zu erhalten.

Zu 0,02 bis 10 ng Rinderinsulin in Reagensgläsern wird die vernetzte Verbindung von Insulin und ß-Galactosidase, wie oben erhalten, und Antirinderinsulinserum gegeben. Es wird bei 5⁰C über Nacht inkubiert und es wird weiter über Nacht bei 5⁰C unter Zugabe von Kaninchenanti-Meerschweinchen-IgG-Serum als sekundärer Antikörper inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird 10 min bei 3000 Upm zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird bei 44°C 20 min lang durch ß-Galactosidasekolorimetrie unter Zugabe von 200 «1 o-Nitrophenylgalactosid (5 mg/ml, 0,1 # Rinderserumalbumin, 10 mM Mercaptoäthanol in 0,1 M-Eho sphatpuff er, pH 6,7) inkubiert. Danach wird die Reaktion durch Zugabe von Glycinpuffer (pH 10,5, 0,1M, 25 ml) abgebrochen und das Gemisch wird kolorimetrisch bei 420 nm analysiert, um die ß-Galactosidaseaktivität zu bestimmen. Es wird ein Enzymimmunoassay von Insulin unter Verwendung der vernetzten Insulin-ß-Galactosidase-Verbindung, Antiinsulinserum und sekundärem Antikörper durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 dargestellt. Es wird eine gute lineare Beziehung erhalten.

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Referenzbeispiel 2

Das Rinderinsulin im Referenzbeispiel 1 wird dtirch Meerschweinchen-Antirinderserum, das mit 3-(Benzothiazol-2¹-yl-dithio)-propionat-succinimidester umgesetzt worden ist, ersetzt, wodurch die vernetzte Meerschweinchen-Antirinder-Insulin-ß-Galactosidase-Verbindung erhalten wird,

Referenzbeispiel 5

Zu ß-Galactosidase (5 mg) in 0,1M-Veronalpuffer (5 ml, pH 7,5) wird 3-(Benzothiazol-2^l-yl-dithio)-propionat-succinimidester (3,1 mg) in Dimethylformamid (1 ml) gegeben. Es wird bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt, wodurch 3-(benzothiazol^'-yl-dithio^propionierte ß-Galactosidase erhalten wird, zu der danach eine wäßrige Lösung (pH 9,0), eingestellt durch Zugabe von 0,1 N-Natriumcarbonat, gegeben wird, und das Gemisch wird 2 h lang stehen gelassen. Die S-S-Bindung wird hydrolysiert, wodurch ß-thiopropionierte ß-Galactosidase erhalten wird (20 Moleküle ß-Thiopropionylgruppe wurden in das ß-Galactosidasemolekül eingeführt).

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eerse

ite

Claims

KRAUS & VVEISERT

PATENTANWÄLTE

D R. WALTER KRAUS DIPLOM CH EM I KER · D R.-IN G. ANN EKÄTE WEIS ERT DIPUNS. FACHRICHTUNG CHEWiE IRMGARDSTRASSE 15 · Q-BOOO MÜNCHEN 71 · TELEFON O8S/79 7O 7T-79 7O 78 ' TELEX O5-212156 kpatn

TELEGRAMM KRAUSPATENT

2230 WK/rm

TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA Tagata / Japan

Disulfidderivate

P at e nt a η s ν r u c h Disulfidderivate der allgemeinen Formel:

R₁-S-S-R₂-HiO-R₃-^n-R₄ (D

in der R₁ für eine 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl-N-oxidgruppe steht, R₂ für eine Alkylengruppe steht, die gegebenenfalls eine freie oder geschützte funktionelle Gruppe hat, R, für eine Carboxylrestgruppe einer Aminosäure oder eines niedrigen Polypeptide steht, R₄ für eine Carboxylgruppe, ein reaktives Derivat davon oder eine geschützte Carboxyl- oder Imidatgruppe steht und η den Wert 0 oder 1 hat.

§09886/067?