DE2928384C2

DE2928384C2 -

Info

Publication number: DE2928384C2
Application number: DE19792928384
Authority: DE
Inventors: Tadashiro Mishima Shizuoka Jp Fujii; Nobuaki Nakagawa; Kikuo Shizuoka Jp Kotani
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-07-13
Filing date: 1979-07-13
Publication date: 1989-01-05
Also published as: GB2029825B; FR2430943A1; FR2430943B1; GB2029825A; DE2928384A1

Description

Die Erfindung betrifft bestimmte neue Disulfidderivate der im Patentanspruch angegebenen allgemeinen Formel.

Die neuen Disulfidderivate sind nützliche Reagentien mit einer S-S-Austauschreaktivität, wobei das reaktive Derivat der Carboxylgruppe als ein Einführungsmittel für eine Thiolgruppe verwendet werden kann.

Disulfidderivate mit einer S-S-Austauschreaktivität für Verbindungen mit einer Thiolgruppe sind bereits bekannt, und sie werden für die kovalente Chromatographie eingesetzt ("Biochem. J.", 133, 573 bis 584 (1973): "Affinity Chromatography-practice and application", Seiten 64 und 65 (1976) K. K. Kodansha; "Farmacia", 14(1), 47 bis 52 (1978)). Einige der Disulfidderivate werden aufgrund der S-S-Austauschreaktivität als Vernetzungsmittel für die Reaktion zwischen einem Protein mit einer Thiolgruppe und einem Protein mit einer Aminogruppe verwendet ("Biochem.", 17(8), 1499 bis 1506 (1978)).

Ein Verfahren zur Synthese asymmetrischer Disulfide des Cysteins, die in der Peptidchemie genützt werden können, ist auch aus der DD-PS 1 13 530 bekannt. In dieser Druckschrift wird unter anderem die Herstellung von S-(Benz thiazolyl-(2)-mercapto)-cystein beschrieben.

Aus Chem. Abstract 73 (1970) 105380j und Chem. Abstract 71 (1969) 91245p sind bereits substituierte Thiazol-2-disulfide und substituierte Pyridindisulfide mit einer S-S-Austauschreaktivität bekannt.

Die S-S-Austauschreaktivität der bekannten Disulfidderivate ist jedoch ziemlich langsam und erfordert einen langen Zeitraum. Diese Verbindungen sind daher nicht vorteilhaft.

Es wurde nun gefunden, daß neue Disulfidderivate der For mel:

R₁-S-S-CH₂-CH₂-R₄

in der R₁ für den 2-Benzothiazolyl- oder den 2-Pyridyl-N- oxidrest steht und R₄ für die Carboxylgruppe, ein reaktives Derviat davon oder eine Imidatgruppe steht, nützliche Verbindungen sind, bei denen die S-S-Austauschreaktion zwei- bis zehnmal so schnell abläuft als im Falle von bekannten Verbindungen.

Beispiele der Synthese von Disulfidderivaten der Formel (I) werden nachstehend angegeben:

Darin bedeutet R₅ die gleiche Gruppe wie R₄ oder eine Gruppe, die in eine Imidatgruppe umgewandelt werden kann. R₁ und R₄ haben die oben angegebenen Bedeutungen.

Die Verbindungen R₁-S-S-R₁ der Formel (II) sind 2,2′-Di thiobis-(benzothiazol) und 2,2′-Dithiobis-(pyridin-N- oxid).

Die Verbindungen HS-CH₂-CH₂-R₅ der Formel (III) sind β-Mercaptopropionsäure oder ihre Carbonsäurederivate, die sich mit den Verbindungen der obigen Formel (II) umsetzen, z. B. einem funktionellen Derivat oder einem Schutzderivat eines aktiven Esters oder eines Säurehalogenids, und β-Mercaptopropionitril, welches in ein Imidat umgewandelt werden kann.

Eine Verbindung der Formel:

R₁-S-S-R₁ (II)

wird mit einer Verbindung der Formel:

HS-CH₂-CH₂-R₅ (III)

gewöhnlich in einem Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Aceton, Benzol, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, umgesetzt.

Zu dem Lösungsmittel wird jede Verbindung im äquimolaren Verhältnis zugesetzt und bei 10 bis 70°C, vorzugsweise bei 70°C 10 Minuten bis 5 Stunden lang, vorzugsweise 2 bis 3 Stunden lang, umgesetzt.

Nach der Reaktion wird das Produkt der Formel:

R₁-S-S-CH₂-CH₂-R₅ (IV)

auf übliche Weise, beispielsweise durch Abkühlen und Extraktion, erhalten.

In dem Produkt bleibt die Carboxylgruppe, so wie sie ist, zurück, oder eine Carboxyl- oder Nitrilgruppe wird in herkömmlicher Weise in das reaktive Derivat der Carboxylgruppe oder in eine geschützte Carboxylgruppe umgewandelt, und weiterhin wird eine Nitrilgruppe in eine Imidatgruppe umgewandelt, wodurch das Produkt der Formel (I) erhalten wird.

Beispiele für reaktive Derivate der Carboxylgruppe sind herkömmliche Derivate, wie das Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid, ein aktiver Ester oder ein Säurehalogenid, z. B. ein Cyanomethylester, Thiophenylester, p-Nitro thiophenylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester oder N-Hydroxypiperidinester. Weitere reaktive Derivate können erhalten werden, indem man ein Carbodiimid, ein N,N′-Carb onyldiimidazol oder eine Isoxazoliumverbindung, beispielsweise ein Woodward-Reagens, verwendet.

In Tabelle I sind verschiedene Beispiele für erfindungsgemäße Disulfidverbindungen, verglichen mit 3-(Pyridin- 2′-yl-dithio)-propionsäure und mit dem aus der DD-PS 1 13 530 bekannten S-(Benzthiazolyl-(2)-mercapto)-cystein, zusammengestellt. Die S-S-Austauschreaktionsgeschwindigkeit wurde durch Umsetzung mit Dithiothritol, enthaltend 1 mM EDTA in 0,2 M-Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), als eine Verbindung mit Thiolgruppe gemessen. Danach wurde die erhöhte Absorption bei der maximalen Absorptionswellenlänge gemessen, um das Molverhältnis der S-S-Austauschreaktion pro Minute zu bestimmen.

Aus der Tabelle ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen Disulfidderivate eine höhere S-S-Austauschreaktionsge schwindigkeit haben.

Tabelle I

(Fortsetzung)

Die Disulfidderivate der Formel (I) sind nützliche Verbindungen als Einführungsmittel für eine Thiolgruppe und als Vernetzungsmittel. So wird z. B. ein Disulfidderivat der Formel (I) mit einer Verbindung mit einer reaktiven Wasserstoffgruppe als Aminverbindung in einem Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol, Chloroform, Aceton, Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Kondensationsreagenzes umgesetzt, um eine Ester-, Amidino- oder Amidbindung durch Umsetzung der reaktiven Gruppe R₄ des Disulfidderivats mit der Hydroxylgruppe oder Aminogruppe in einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe oder einer Aminverbindung zu bilden. Danach wird die Disulfidbindung der Verbindung hydrolysiert, um die Thiolgruppe in die Verbindung mit der Hydroxylgruppe oder in die Aminverbindung einzuführen. Die obige Verbindung mit einer Ester- oder Amidbindung wird auch mit einer Verbindung mit einer Thiolgruppe in Gegenwart eines wäßrigen Mediums bei einem pH-Wert von 7 bis 8 umgesetzt, um die S-S-Austauschreaktion herbeizuführen, wodurch die Verbindung mit der Thiolgruppe und die Verbindung mit der Hydroxylgruppe oder die Aminverbindung vernetzt werden.

Beispiele für Verbindungen mit einer Hydroxylgruppe oder Aminverbindungen sind Insulin, Albumin, Wachstumshormon, Calcitonin, Prolactin, ACTH, PTH, Glucagon, Gastricsin, Secretin, γ-Globulin oder Immunkomponenten, wie z. B. IgG, IgM, IgA, sekundäre Antikörper, Östrogene, ATP, Catecholamin, Trÿodthyronin, Antigene von Antibiotika oder Hypnotika, Antikörper, sekundäre Antikörper und Haptene, oder Oxidoreduktasen, wie Peroxidase, Catalase, Cholesterin oxidase, Glycerinaldehyd-Dehydrogenase oder Cholinoxidase, Hydrolase, wie alkalische Phosphatase, Glucoamylase, Phos pholipase D, b-Galactosidase oder Lysozym oder andere Transferasen, Lyasen, Isomerasen, Polysaccharide, wie Cellulose, aminierte Cellulose, Agarose, Dextrin, Dextran oder ihre wasserunlöslichen Träger oder wasserunlösliche Träger mit Hydroxyl- oder Aminogruppen, wie aminiertes Polyamid, Polyacrylnitril oder Silan. Beispiele für Träger mit Aminogruppen sind γ-aminopropylierte Polyamide, Aminoderivate von Polyacrylnitrilpolymeren oder Polymere der Polyacrylnitrilgruppe. γ-aminopropylierte Polyamide werden hergestellt, indem man einen Polyamidträger, wie 6,6-Nylon und 6-Nylon, in γ-Aminopropyltri ethoxysilan 3 Stunden lang auf 100°C erhitzt, um teilweise γ-Aminopropylgruppen in die Amidgruppen der Poly amidverbindung einzuführen. Die Aminoderivate der Polyacrylnitrilpolymeren oder der Polymeren der Polyacrylnitrilgruppe können in der Weise hergestellt werden, daß man ein Polyacrylnitrilpolymeres oder ein Polymeres der Polyacrylnitrilgruppe in Gegenwart von Lithiumaluminiumhydrid in einem Medium, wie Diethylether, Dioxan oder Tetrahydrofuran, 1 bis 48 Stunden lang am Rückfluß erhitzt, um Aminogruppen mit teilweise reduzierten Nitrilgruppen zu bilden.

Beispiele für Verbindungen mit einer Thiolgruppe sind z. B. Enzyme, wie Peroxidase, Catalase, β-Galactosidase oder alkalische Phosphatase oder Haptene, oder Verbindungen, in die eine Thiolgruppe durch S-Acetylmercaptobernstein säureanhydrid ("Arch. Biochem. Biophys.", 96, 605 bis 612 (1962)) eingeführt worden ist.

Die S-S-Austauschreaktion wird, wie oben erläutert, in der Weise durchgeführt, daß man die obigen Verbindungen beliebig in herkömmlicher Weise in einem wäßrigen Medium, wie einem Puffer mit pH 7 bis 8, bei Raumtemperatur miteinander kombiniert. Das Reaktionsprodukt wird durch her kömmliche Trenn- und Reinigungsverfahren, beispielsweise durch Aussalzen, Phasenabtrennung, Extraktion, Dialyse oder Adsorptionschromatographie, gewonnen. Die auf diese Weise hergestellte Verbindung ist eine vorteilhafte und nützliche Verbindung für immobilisierte Enzyme, für die Vernetzung von Enzymen mit wasserunlöslichen Trägern, für immobilisierte Antigene oder Antikörper, für die Vernetzung von Antigenen oder Antikörpern mit wasserunlöslichen Trägern, für antigene Haptene, für die Vernetzung von Protein und Hapten oder als Enzymimmunassaykomponente oder für die Vernetzung von Enzym- und Immun komponenten.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Zu 2,2′-Dithiobis-(benzothiazol) (13,2 g) wird Benzol (400 ml) und 3-Mercaptopropionat (6 g) gegeben, und das Gemisch wird bei 70°C 3 Stunden lang unter Rühren umgesetzt. Danach wird das Reaktionsgemisch in einem Eisbad abgekühlt, um rohe Kristalle (13,8 g) auszufällen, die aus Benzol umkristallisiert werden. Es werden 3-(Benzo thiazol-2′-yl-dithio)-propionatkristalle (12 g) erhalten.

Fp. 162 bis 164°C
λ _max: 272 nm (Methanol)
Rf: 0,33 (TLC, Silicagel, Benzol : Ethylacetat = 1 : 2).

Beispiel 2

2,2′-Dithiobis-(pyridin-N-oxid) (4,3 g) wird zu Chloroform (200 ml) und 3-Mercaptopropionat (3 g) gegeben, und das Gemisch wird bei 70°C 3 Stunden lang umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt, und rohe Kristalle kommen zur Ausfällung. Sie werden aus Chloroform umkristallisiert, wodurch Kristalle von 3-(Pyridin-N-oxid-2′yl- dithio)-propionat (4,1 g) erhalten werden.

Fp. 126 bis 218°C
g _max: 270 nm (Methanol)
Rf: 0,66 (TLC, Silicagel, Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 1 : 1).

Beispiel 3

Zu dem 3-(Benzothiazol-2′-yl-dithio)-propionat (3 g) in Ethylacetat (20 ml) wird N-Hydroxysuccinimid (1 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (1,7 g) gegeben, und das Gemisch wird 3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, und das Filtrat wird mit Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen, um nichtumgesetzte freie Säure zu entfernen. Die Ethylacetatschicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird aus heißem Petrolether umkristallisiert, wodurch Kristalle von 3-(Benzothiazol-2′-yl-dithio)-propionat succinimidester (2,4 g) erhalten werden.

Fp. 114 bis 115°C, korrigierter Wert 121 bis 123°C
λ _max: 270 nm (pH 7,5, 10% wäßriges Dimethylformamid)
Rf: 0,53 (TLC, Silicagel, Benzol : Ethylacetat = 3 : 1).

Beispiel 4

Ein Gemisch von 3-(Benzothiazol-2′-yl-dithio)-propionat (3 g), erhalten nach dem Herstellungsverfahren gemäß Beispiel 1, und p-Nitrophenol (1,2 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (2,1 g), gelöst in Ethylacetat (20 ml), wird 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das weitere Vorgehen erfolgt wie im Beispiel 3, wodurch 3-(Benzothia zol-2′-yl-dithio)-propionat-p-nitrophenylester (1,85 g) in Form von Kristallen erhalten wird.

Fp. 113 bis 114°C
λ _max: 279 nm (pH 7,5, 10% wäßriges Dimethylformamid)
Rf: 0,84 (TLC, Silicagel, Benzol : Ethylacetat = 5 : 1).

Beispiel 5

3-(Benzothiazol-2′-yl-dithio)-propionat (3 g), gelöst in Thionylchlorid (10 ml), wird 2 Stunden lang bei 25°C um gesetzt, wonach Thionylchlorid im Vakuum entfernt wird, wodurch 3-(Benzothiazol-2′-yl-dithio)-propionylchlorid als ölige Substanz erhalten wird.

λ _max: 272 nm (Methanol)
Rf: 0,25 (TLC, Benzol).

Beispiel 6, 7 und 8

3-(Pyridin-N-oxid-2′-yl-dithio)-propionat, hergestellt gemäß Beispiel 2, wird zur Herstellung des Succinimidesters, des p-Nitrophenylesters und des Säurechlorids davon nach den Methoden der Beispiele 3, 4 bzw. 5 verwen det.

Succinimidester:

λ _max: 260 nm (Methanol)
Rf: 0,25 (TLC, Silicagel, Benzol : Ethylacetat = 3 : 1).

p-Nitrophenylester:

λ _max: 391 nm (Methanol)
Rf: 0,82 (TLC, Silicagel, Benzol : Ethylacetat = 3 : 1).

Säurechlorid:

λ _max: 270 nm (Methanol)
Rf: 0,15 (TLC, Silicagel, Benzol : Ethylacetat = 3 : 1).

Beispiel 9

2,2′-Dithiobis-(benzothiazol) (1,1 g) und 3-Mercaptopro pionitril, gelöst in Benzol (50 ml), werden bei 70°C 3 Stunden lang unter Rühren umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird in einem Eis/Wasser-Bad abgekühlt, wodurch rohe Kristalle erhalten werden, die aus Benzol umkristallisiert werden, wodurch 3-(Benzothiazol-2′-yl-dithio)- propionitril (750 mg) erhalten wird. 700 mg davon werden zu einer Methanollösung (50 ml), die HCl (19 g) enthält, gegeben, und das Gemisch wird bei 5°C über Nacht umgesetzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert, wodurch ein rohes Pulver erhalten wird, das mit Benzol gewaschen wird, wodurch Methyl-3-(benzothiazol-2′-yl-di thio)-propionimidat-hydrochlorid (720 mg) erhalten wird.

g _max: 272 nm (Methanol)
Rf: 0,05 (TLC, Silicagel, Benzol : Ethylacetat = 1 : 2).

Referenzbeispiel 1

Zu Rinderinsulin (0,6 mg), gelöst in 0,1 M-Veronalpuffer (pH 7,5, 10 ml), wird Dimethylformamidlösung (1 ml) von 3-(Benzothiazol-2′-yl-dithio)-propionat-succinimidester (3,1 mg) gegeben. Es wird 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch auf einen ph-Wert von 5,0 eingestellt, um das Produkt auszufällen. Dieses wird 10 Minuten lang bei 3000 UpM zentrifugiert, wodurch das Insulinderivat erhalten wird, in das die 3-(Benzothiazol-2′-yl-dithio)-propionylgruppe eingeführt worden ist.

Das Insulinderivat wird mit Citratpuffer (pH 5) gewaschen und in 0,1 M-Phosphatpuffer (10 ml, pH 7,5) aufgelöst.

Zu der Lösung (0,1 ml) wird β-Galactosidase (5 mg), gelöst in Phosphatpuffer (pH 7,5, 5 ml), gegeben, und es wird bei Raumtemperatur 1 Stunde lang umgesetzt. Danach wird das Reaktionsgemisch auf eine Säule von Sephadex G-100 (Warenzeichen, 1×80 cm) aufgegeben, und es wird mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 7,5), enthaltend 0,15 M-NaCl, eluiert. Es werden jeweils Fraktionen mit 4 ml gesammelt. Die Fraktionen Nr. 7 und 8 werden gesammelt, um die vernetzte Verbindung von Insulin und β-Galactosidase zu er halten.

Zu 0,02 bis 10 ng Rinderinsulin in Reagenzgläsern wird die vernetzte Verbindung von Insulin und β-Galactosidase, wie oben erhalten, und Antirinderinsulinserium gegeben. Es wird bei 5°C über Nacht inkubiert, und es wird weiter über Nacht bei 5°C unter Zugabe von Kaninchen-anti-Meer schweinchen-IgG-Serum als sekundärer Antikörper inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird 10 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird bei 44°C 20 Minuten lang durch β-Galactosidasekolorimetrie unter Zugabe von 200 µl o-Nitrophenylgalactosid (5 mg/ml, 0,1% Rinderserumalbumin, 10 mM Mercaptoethanol in 0,1 M-Phosphat puffer, pH 6,7) inkubiert. Danach wird die Reaktion durch Zugabe von Glycinpuffer (pH 10,5, 0,1 M, 25 ml) abgebrochen, und das Gemisch wird kolorimetrisch bei 420 nm analysiert, um die β-Galactosidaseaktivität zu bestimmen. Es wird ein Enzymimmunoassay von Insulin unter Verwendung der vernetzten Insulin-β-Galactosidase-Verbindung, Antiinsulinserum und sekundärem Antikörper durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Figur dargestellt. Es wird eine gute lineare Beziehung erhalten.

Referenzbeispiel 2

Das Rinderinsulin im Referenzbeispiel 1 wird durch Meer schweinchen-Antirinderserum, das mit 3-(Benzothiazol-2′- yl-dithio)-propionat-succinimidester umgesetzt worden ist, ersetzt, wodurch die vernetzte Meerschweinchen-Anti rinder-Insulin-β-Galactosidase-Verbindung erhalten wird.

Referenzbeispiel 3

Zu β-Galactosidase (5 mg) in 0,1 M-Veronalpuffer (5 ml, pH 7,5) wird 3-(Benzothiazol-2′-yl-dithio)-propionat- succinimidester (3,1 mg) in Dimethylformamid (1 ml) gegeben. Es wird bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt, wodurch 3-(benzothiazol-2′-yl-dithio)-propionierte β-Galactosidase erhalten wird, zu der danach eine wäßrige Lösung (pH 9,0), eingestellt durch Zugabe von 0,1 N-Natriumcarbonat, gegeben wird, und das Gemisch wird 2 Stunden lang stehengelassen. Die S-S-Bindung wird hydrolysiert, wodurch b-thiopropionierte β-Galactosidase erhalten wird (20 Moleküle β-Thiolpropionylgruppe wurden in das β-Ga lactosidasemolekül eingeführt).

Claims

Disulfidderivate der allgemeinen Formel: R₁-S-S-CH₂-CH₂-R₄in der R₁ für den 2-Benzothiazolyl- oder den 2-Pyridyl- N-oxidrest steht und R₄ für die Carboxylgruppe, ein reaktives Derviat davon oder eine Imidatgruppe steht.