DE2917730C2 - Immunobiotherapeutic medicinal preparation for infections of the respiratory tract and process for its manufacture - Google Patents
Immunobiotherapeutic medicinal preparation for infections of the respiratory tract and process for its manufactureInfo
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Description
2. Verfahren zur Herstellung des Arzneipraparates nach Anspruch 1 durch Kultivieren, Inkubieren, Ernten, Suspendieren und Lysieren der Bakterienstämme und Vermischen der Lysate zu einem Konzentrat, das durch Filtrieren sterilisiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man jeden der angegebenen Stämme in einem Gnindmedium kultiviert., das je Liter Wasser 22,5 g Fleischextrakt, 7β g Hefeextrakt, 2,5 g Natriumchlorid, 0,5 g Natriumacetat, 2,0 g Natriummonohydrogenphosphat, 2,0 ml 70gewichtsprozentige Natriumlactatlösung, 2,0 ml 70gewichtsprozentige Natriumlactatlösung, 2,0 ml 50gewichtsprozentige Ammoniumlactatlösung, 3,0 mg Aneurin, 3,0 mg Nikotinsäure und 3,0 g Glukose enthält, wobei diese Werte um ±5% schwanken können.2. A method for producing the medicinal preparation according to claim 1 by cultivating, incubating, harvesting, suspending and lysing the bacterial strains and mixing the lysates to form a concentrate which is sterilized by filtration, characterized in that each of the specified strains is cultivated in a Gnindmedium. , which contains 22.5 g meat extract, 7 β g yeast extract, 2.5 g sodium chloride, 0.5 g sodium acetate, 2.0 g sodium monohydrogen phosphate, 2.0 ml 70 weight percent sodium lactate solution, 2.0 ml 70 weight percent sodium lactate solution, 2, Contains 0 ml of 50 weight percent ammonium lactate solution, 3.0 mg of aneurine, 3.0 mg of nicotinic acid and 3.0 g of glucose, although these values can fluctuate by ± 5%.
Die Erfindung betrifft ein immunobiotherapeutisches Arzneipräparat gegen Infektionen der Atemwege, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirkstoff ein Bakterienlysat der folgenden Stämme enthält:The invention relates to an immunobiotherapeutic medicinal preparation against infections of the respiratory tract, the is characterized in that it contains as active ingredient a bacterial lysate of the following strains:
Staphylococcus aureus Streptococcus viridans Neisseria catarrhalis Hemophilus influenzae Serotyp b Diplococcus pneumoniae Serotypen 1,2,3 und 47 Klebsiella pneumoniae Klebsiella ozaenae Streptococcus pyogenes Serogruppe A Neisseria catarrhalisStaphylococcus aureus Streptococcus viridans Neisseria catarrhalis Hemophilus influenzae serotype b Diplococcus pneumoniae serotypes 1,2,3 and 47 Klebsiella pneumoniae Klebsiella ozaenae Streptococcus pyogenes serogroup A Neisseria catarrhalis
1-049,1-050,1-051,1-052,1-053,1-054 1-046,1-047,1-048 1-0451-049.1-050.1-051.1-052.1-053.1-054 1-046.1-047.1-048 1-045
NCTC 8467 NCTC 7465,7466,7978 10319NCTC 8467 NCTC 7465,7466,7978 10319
NCTC 204,5056 NCTC 5050 NCTC 8191 NCTC 3622,3625NCTC 204,5056 NCTC 5050 NCTC 8191 NCTC 3622,3625
Die NCTC-Stämme sind bei der »National Collection of Type Cultures« London, hinterlegt, die I-Stämme wurden am 14. März 1978 bei der »Collection nationale de culture de microorganismes, Institut Pasteur«, Paris, hinterlegt.The NCTC strains are deposited with the "National Collection of Type Cultures" London, the I strains were found on March 14, 1978 at the "Collection nationale de culture de microorganismes, Institut Pasteur", Paris, deposited.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des immunobiotherapeutischen Arzneipräparats der vorstehend gekennzeichneten Art durch Kultivieren, Inkubieren, Ernten, Suspendieren und Lysieren der Bakterienstämme und Vermischen der Lysate zu einem Konzentrat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man jeden der angegebenen Stämme in einem Grundmedium kultiviert, das je Liter Wasser 22,5 ψ Fleischextrakt, 7,5 g Hefeextrakt, 2,5 g Natriumchlorid, 0,5 g Natriumacetat, 2,0 g Natriummonohydrogenphospnat, 2,0 ml einer 70gewichtsprozentigen Natriumlactatlösung, 2,0 ml einer 50gewichtsprozentigen Ammoniumlactatlösung, 3,0 mg Aneurin, 3,0 mg Nicotinsäure und 3,0 g Glukose enthält, wobei diese Werte um ±5% schwanken können.The invention further relates to a method for producing the immunobiotherapeutic medicinal preparation of the type characterized above by culturing, incubating, harvesting, suspending and lysing the bacterial strains and mixing the lysates to form a concentrate, which is characterized in that each of the specified strains is cultivated in a basic medium , the per liter of water 22.5 ψ meat extract, 7.5 g yeast extract, 2.5 g sodium chloride, 0.5 g sodium acetate, 2.0 g sodium monohydrogen phosphate, 2.0 ml of a 70 weight percent sodium lactate solution, 2.0 ml of a 50 weight percent ammonium lactate solution , 3.0 mg aneurine, 3.0 mg nicotinic acid and 3.0 g glucose, although these values can fluctuate by ± 5%.
Das Kulturmedium wird entweder im Autoklaven oder durch Filtrieren sterilisiert.The culture medium is sterilized either in an autoclave or by filtration.
Die Bakterienkulturen werden in an sich bekannter Weise bei Bedingungen durchgeführt, die am besten der Vermehrung der Keime angepaßt sind:The bacterial cultures are carried out in a manner known per se under conditions that are best of the Propagation of the germs are adapted:
Der Stamm Hemophilus influenzae wird vorzugsweise im Fermentor bebrütet, wobei dem Grundmedium 2% eines Bäckerhefeextrakts und 0,5% eines Extrakts »Fildes« zugegeben wird.The strain Hemophilus influenzae is preferably incubated in the fermentor, with 2% of the basic medium a baker's yeast extract and 0.5% of an extract "Fildes" is added.
Die Bebrütung erfolgt bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 37°C unter Belüftung und Bewegung während 8 bis 14 Stunden.Incubation takes place at a pH of 7.0 and a temperature of 37 ° C with aeration and Exercise for 8 to 14 hours.
Die Kultur der Pneumokokken erfolgt vorzugsweise im Fermentor, wobei dem Grundmedium 0,3% Glukose und 0,5% Pferdeserum zugesetzt werden. Auch hier wird bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 37°C unter Belüftung und Bewegung während 8 bis 14 Stunden bebrütet.The pneumococci are preferably cultivated in the fermentor, with 0.3% glucose as the basic medium and 0.5% horse serum are added. Here, too, is at a pH of 7.0 and a temperature of Incubated at 37 ° C with ventilation and agitation for 8 to 14 hours.
Auch die Streptokokken werden vorzugsweise im Fermentor unter den oben angegebenen Bedingungen kultiviert. Dem Grundmedium werden 03% Glukose zugesetzt.The streptococci are also preferably in the fermentor under the conditions specified above cultivated. 03% glucose is added to the basic medium.
Die Klebsiella-Stämme werden vorzugsweise auf festem Medium in Roux-Flaschen bei 37°C während 48 Stunden bebrütet. Dem Grundmedium werden 0,2% Gelatine und 2,4% Agar zugesetzt.The Klebsiella strains are preferably grown on solid medium in Roux bottles at 37 ° C for 48 Hours incubated. 0.2% gelatin and 2.4% agar are added to the basic medium.
Auch die Staphylokokken und die Neisseria-Stämme werden vorzugsweise auf festem Medium unter den für die Klebsiella-Stämme angegebenen Bedingungen kultiviert.Also the Staphylococci and the Neisseria strains are preferably on solid medium among the for the Klebsiella strains are cultivated under specified conditions.
Am Ende der Inkubationszeit wird in den flüssigen Kulturen die Zellzahl für jeden Stamm entweder durchAt the end of the incubation period, the cell number for each strain in the liquid cultures is determined by either
Trübungsmessungen oder mikroskopisch bestimmt. Die Kulturen werden abzentrifugiert, in physiologischer Lösung suspendiert, erneut gezählt und dann einer alkalischen Lyse (pH 9 bis 10) bei eineir Temperatur von 20 bis 400C unterworfen. Als Lysemittel werden z.B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, primäre, sekundäre und tertiäre Amine verwendet. Die Lyse erfolgt während 1 bis 5 Tage unter mikroskopischer Kontrolle.Turbidity measurements or determined microscopically. The cultures are centrifuged, suspended in physiological solution and then counted again (9 pH to 10) subjected to alkaline lysis at eineir temperature of 20 to 40 0 C. Sodium hydroxide, potassium hydroxide, primary, secondary and tertiary amines, for example, are used as lysing agents. The lysis is carried out under microscopic control for 1 to 5 days.
Die festen Kulturen werden in an sich bekannter Weise abgeerntet- Die Zellzahl wird für jeden Stamm bestimmt, die Suspensionen werden dann wie oben beschrieben einer alkalischen Lyse unterworfen.The solid cultures are harvested in a manner known per se. The cell number is determined for each strain determined, the suspensions are then subjected to an alkaline lysis as described above.
Das Lysatvolumen jedes Bakterienstammes wird anhand der Zellzahlen bestimmt Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Arzneipräparats werden diese Lysate in entsprechenden Mengen vermischL Die Keimzahlen der verwendeten Stämme können innerhalb gewisser Grenzen schwanken, die Tagesdosis für einen Erwachsenen beträgt etwa 1 bis 50 Milliarden Keime.The lysate volume of each bacterial strain is determined based on the number of cells With the medicinal preparation according to the invention, these lysates are mixed in appropriate amounts of the strains used can vary within certain limits, the daily dose for an adult is about 1 to 50 billion germs.
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Wirkstoffes kann man wie folgt zusammenfassen:The preparation of the active ingredient according to the invention can be summarized as follows:
Beimpfen der BakterienstämmeInoculating the bacterial strains
Inkubation, Ernten der Keime, Konzentration, SuspensionIncubation, harvesting the germs, concentration, suspension
Bestimmung der Zellzahlen Lyse, Vermischen der Lysate zu einem KonzentratDetermination of the cell count. Lysis, mixing of the lysates to a concentrate
Zentrifugieren und Filtrieren dieses KonzentratsCentrifuge and filter this concentrate
Sterilisieren durch Filtrieren.Sterilize by filtering.
Das erfindungsgemäße Arzneipraparat wird vorzugsweise oral verabreicht in Form von Tabletten, Kapseln oder Granulat, die das Lysat in Iyophilisierter Form enthalten, oder als Trinkampullen in Einzeldosen, als Sirup oder Tropfen. Man kann das erfindungsgemäße Arzneipräparat aber auch in Form von Aerosolen oder Tropfen über die Nase einführen oder parenteral verabreichen.The medicament according to the invention is preferably administered orally in the form of tablets, capsules or granules containing the lysate in lyophilized form, or as single-dose drinking ampoules, as a syrup or drops. However, the medicinal preparation according to the invention can also be used in the form of aerosols or drops Introduce through the nose or administer parenterally.
Die Tagesdosis für einen Erwachsenen wird vorzugsweise auf einmal genommen und enthält eine Gesamtmenge an Lysat entsprechend etwa 1 bis 50 Milliarden Keime. 2- The daily dose for an adult is preferably taken all at once and contains a total amount of lysate corresponding to about 1 to 50 billion germs. 2-
Die Dosis für Kinder entspricht der halben Erwachsenendosis.The dose for children is half the adult dose.
Pharmakologische VersuchePharmacological experiments
Ein Iyophilisierf.?s Bakterienlysat, das auf eine Dosis von 6 Milliarden Keime jedes in Anspruch 1 aufgeführten Stammes titriert worden ist, wird oral Balb/c-Mäusen in einem Fünftel der menschlichen Dosis während 10 Tagen verabreicht (Gruppen von je 24 Mäusen). 5 bis 10 Tage nach Ende der Verabreichung werden die Mäuse infiziert. Bei einer intraperitonealen Infektion mit Klebsiella pneumoniae 5 Tage nach Ende der Behandlung erhält man eine statistisch signifikante Schutzwirkung. Sogar bei Infizierung 20 Tage nach der Behandlung kann man noch eine Verzögerung der Sterblichkeit beobachten. Das immunobiotherapeutische Lysat verursacht auch eine nicht spezifische Stimulierung der Abwehrmechanismen, die sich in einer Verzögerung der Sterblichkeit bei Tieren, die durch Aerosol mit Grippevirus infiziert worden sind, bemerkbar macht.A lyophilizer for bacterial lysate which has been titrated to a dose of 6 billion germs of each strain listed in claim 1 is administered orally to Balb / c mice in a fifth of the human dose for 10 days (groups of 24 mice each) . The mice are infected 5 to 10 days after the end of the administration. In the case of an intraperitoneal infection with Klebsiella pneumoniae 5 days after the end of the treatment, a statistically significant protective effect is obtained. Even if infected 20 days after treatment, a delay in mortality can still be observed. The immunobiotherapeutic lysate also causes a non-specific stimulation of defense mechanisms which manifests itself in a delay in mortality in animals aerosolized with influenza virus.
Bei den mit erfindungsgemäßem Arzneipraparat behandelten und dann mit Klebsiella pneumonia infizierten Mäusen wurden die peritonealen Macrophagen biochemisch und morphologisch untersucht. 5 und 25 Tage nach Ende der Behandlung ist die Zahl und das Volumen der Zellen deutlich erhöht. Auch die Phosphatase und die /i-Galactosidase sind im Vergleich zu Kontrollen erhöht.In those treated with the medicament according to the invention and then infected with Klebsiella pneumonia The peritoneal macrophages in mice were examined biochemically and morphologically. 5 and 25 days after At the end of the treatment, the number and volume of cells is significantly increased. Also the phosphatase and the / i-galactosidase are increased compared to controls.
Der oralen Verabreichung des Lysats an die Maus folgt eine Erhöhung der Immunglobuline A in der Spülflüssigkeit der Atemwege, die durch die Fällungsreaktion mit dem entsprechenden auf Vi6 verdünnten Antiserum nachweisbar ist. Wegen der geringen Menge der Immunglobuline A im Sekret und in Anbetracht der beträchtlichen Erhöhung dieser Immunglobuline unter dem Einfluß des Lysats kann man vermuten, daß die Erhöhung der Gesamtimmunglobuline fast ausschließlich auf der Erhöhung der Immunglobuline A beruht.Oral administration of the lysate to the mouse is followed by an increase in immunoglobulins A in the rinsing fluid of the respiratory tract, which can be detected by the precipitation reaction with the corresponding antiserum diluted to Vi 6. Because of the small amount of immunoglobulins A in the secretion and in view of the considerable increase in these immunoglobulins under the influence of the lysate, it can be assumed that the increase in total immunoglobulins is almost exclusively due to the increase in immunoglobulins A.
Klinische VersucheClinical trials
12 gesunden Versuchspersonen wird während 10 Tagen täglich eine Kapsel des erfindungsgemäßen Arznei-Präparats, die den Wirkstoff entsprechend 6 Milliarden Keime jfdes Stammes enthält, verabreicht. Die während 3 und mehr Monaten verfolgten Versuche zeigen eine statistisch signifikante Erhöhung der Menge an Sekretlmmunglobuline A im Speichel und der Immunglobuline A im Serum. Dieses Ergebnis entspricht der aktuellen Vorstellung über die Mechanismen der Immunantwort.12 healthy test subjects are given a capsule of the medicinal product according to the invention daily for 10 days, which contains the active ingredient corresponding to 6 billion germs of each strain. The during Experiments followed for 3 months and more show a statistically significant increase in the amount of secretion immunoglobulins A in saliva and immunoglobulins A in serum. This result corresponds to the current one Presentation of the mechanisms of the immune response.
Die oben beschriebene Kapsel des erfindungsgemäßen Arzneipräparats wurde von 7 Ärzten bei der chronisehen Bronchitis und bei Infektionen des Hals-Nasen-Ohrenbereichs, z. B. der Sinusitis, eingesetzt und die heilende sowie prophylaktische Wirkung abgeschätzt. Das Arzneipraparat wurde im allgemeinen während 10 Tagen jedes Monats während mehrerer Monate, im allgemeinen während der Wintermonate, verabreicht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefaßt.The above-described capsule of the medicinal preparation according to the invention was used by 7 doctors at the chronisehen Bronchitis and ear, nose and throat infections, e.g. B. Sinusitis, used and the healing and prophylactic effects estimated. The medication was generally used for 10 Administered days of each month for several months, generally during the winter months. the The results are summarized in the table.
Wirkung Anzahl der Fälle gut mittel keineEffect number of cases good medium none
heilend 242 146 72 24healing 242 146 72 24
% 100 603 29,8 9,9% 100 603 29.8 9.9
prophylaktisch 131 94 12 25prophylactic 131 94 12 25
% 100 71.8 9.1 19.1% 100 71.8 9.1 19.1
Das erfindungsgemäße Arzneipräparat wird vor allem bei akuter und chronischer Bronchitis, Angina, Mandelentzündungen, Kehlkopfentzündungen, Rachenentzöndungen, Rhinitis, Sinusitis, Otitis, bei Infektionen, die gegenüber der üblichen Antibiotikum-Therapie resistent sind, sowie bei bakteriellen Komplikationen bei Virusinfektionen des Atemsystems, insbesondere bei Kindern und älteren Personen, empfohlen.The medicinal preparation according to the invention is mainly used in acute and chronic bronchitis, angina, tonsillitis, Laryngitis, sore throat, rhinitis, sinusitis, otitis, in infections that are opposite resistant to usual antibiotic therapy, as well as bacterial complications from viral infections of the breathing system, especially in children and the elderly.
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