DE19912439C2 - Killer toxins from killer yeast for pharmaceutical use - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Fermentationsprodukt sogenannter Killerhefen, das zur Behandlung bestimmter Erkrankungen, insbesondere von Durchfallerkrankungen im Veterinärbereich, besonders zur Behandlung von Durchfallerkrankungen bei Ferkeln und Kälbern, eingesetzt werden kann.The invention relates to a so-called fermentation product Killer yeast used to treat certain diseases, especially diarrheal diseases in the veterinary field, especially for the treatment of diarrhea in piglets and calves.
Es ist seit langem bekannt, daß bestimmte Hefestämme während der exponentiellen Wachstumsphase einen für andere Hefestämme toxischen Stoff in das Fermentationsmedium ausscheiden. Für derartige Hefestämme hat sich die Bezeichnung "Killerhefen" durchgesetzt, und dieser Begriff wird auch beispielsweise in "Römpp Lexikon Biotechnologie, 1992" verwendet. Killerhefen scheiden während des Fermentationsprozesses Toxine aus, bei denen es sich in der Regel um kleine, hydrophobe Proteine handelt, gegen die die Killerhefen selbst immun sind, die aber während der Fermentation Kulturhefen abtöten. Die von den Killerhefen ausgeschiedenen Toxine werden im Hinblick auf die Bezeichnung "Killerhefe" häufig auch als "Killertoxine" bezeichnet.It has long been known that certain strains of yeast during the exponential growth phase one for other yeast strains excrete toxic substance into the fermentation medium. For such yeast strains has the name "killer yeast" enforced, and this term is also used, for example, in "Römpp Lexikon Biotechnologie, 1992" used. killer yeasts excrete toxins during the fermentation process which are usually small, hydrophobic proteins acts against which the killer yeasts themselves are immune, but who kill yeasts during fermentation. The one from the Killer yeast excreted toxins with regard to Description "killer yeast" often also as "killer toxins" designated.
Das Auftreten von Killerhefen im Brauereiwesen und Möglichkeiten, die dadurch entstehenden Probleme zu lösen, sind in der Literatur vielfältig beschrieben, und es kann beispielsweise auf die Druckschrift Brauwelt, 40, 1993, 2020 verwiesen werden.The appearance of killer yeasts in the brewery and Ways to solve the problems that arise are widely described in the literature, and it can for example on the Brauwelt publication, 40, 1993, 2020 to get expelled.
Bestimmte Killertoxine wurden ebenfalls mit verschiedenen Erkrankungen, z. B. mit Enteritis, in Verbindung gebracht. Hier kann beispielsweise auf Gastroenterology, 109, 1995, 1900-1906 verwiesen werden.Certain killer toxins have also been used with different Diseases, e.g. B. associated with enteritis. Here can for example on Gastroenterology, 109, 1995, 1900-1906 to get expelled.
Die DE 36 42 050 A1 beschreibt die Strukturformel eines bestimmten Killertoxins, das aus einem Hefestamm, der zum Genus Hansenula gehört, nämlich von Hansenula mrakii IFO 0895 (FERM BP-1197), gewonnen wurde. Das dort beschriebene Killertoxin ist vom K9-Typ und soll als antimykotisches Mittel brauchbar sein. Eine Anwendung als Arzneimittel wird in dieser Druckschrift jedoch nicht beschrieben.DE 36 42 050 A1 describes the structural formula of a certain killer toxin which was obtained from a yeast strain belonging to the genus Hansenula, namely from Hansenula mrakii IFO 0895 (FERM BP-1197). The killer toxin described there is of the K 9 type and is said to be useful as an antifungal agent. An application as a drug is not described in this document.
Es gibt bereits Untersuchungen, ob Killertoxine therapeutische Anwendbarkeit besitzen. So wird in Mycopathol. 96, 1986, 103- 107 die topische Anwendung von konzentriertem Killertoxin (Hansenula anomala UCSC 25F) bei Tieren beschrieben. Hierdurch sollte die mögliche Verwendung von Killertoxinen bei Hautpilzerkrankungen getestet werden. Ferner werden neben antimykotischen auch gewisse antibiotische Eigenschaften von Killertoxinen beschrieben. Mit Killertoxinen und ihren möglichen Verwendungen beschäftigen sich beispielsweise Clinical Microbiology Reviews, Juli 1997, 386/387, Critical Reviews in Microbiology, 18 (1), 1991, 47-87, The Journal of Immunology 1996, 1880-1885, Molecular Medicine, Volume 3, Nr. 8, August 1997, 544-552, JID Concise Communications, 177, 1988, 807-811, um nur einige zu nennen. In Critical Reviews in Microbiology, 18 (1), 1991, 47-87 kommen die Autoren zu dem Schluß, daß die therapeutische Verwendung von Killertoxinen wohl allenfalls eingeschränkt möglich ist. In der Tat hat keine der bisherigen wissenschaftlichen Untersuchungen zu Killertoxinen zu einer wirksamen therapeutischen Verwendung eines Killertoxins geführt. There is already research into whether killer toxins are therapeutic Possess applicability. So in Mycopathol. 96, 1986, 103- 107 topical use of concentrated killer toxin (Hansenula anomala UCSC 25F) in animals. hereby should consider the possible use of killer toxins Skin fungal diseases are tested. Furthermore, in addition antifungal also certain antibiotic properties of Killer toxins described. With killer toxins and their possible uses are concerned, for example Clinical Microbiology Reviews, July 1997, 386/387, Critical Reviews in Microbiology, 18 (1), 1991, 47-87, The Journal of Immunology 1996, 1880-1885, Molecular Medicine, Volume 3, No. 8, August 1997, 544-552, JID Concise Communications, 177, 1988, 807-811, to name a few. In Critical Reviews in Microbiology, 18 (1), 1991, 47-87, the authors come to the Conclusion that the therapeutic use of killer toxins is only possible to a limited extent. Indeed it has none of the previous scientific studies Killer toxins for effective therapeutic use of a killer toxin.
Insbesondere bei der Aufzucht von Schweinen, aber auch in anderen Bereichen der Tiermedizin, tritt häufig das Problem von Durchfallerkrankungen auf. Solche Durchfallerkrankungen, die insbesondere von Escherichia coli-Bakterien (z. B. "EHEC"- Bakterien) hervorgerufen werden, führen z. B. bei Absetzferkeln, also bei Ferkeln, die von einer Ernährung durch Muttermilch auf andere Ernährung umgestellt werden, zu hohem Gewichtsverlust und häufig zum Tod. Auch in der Humanmedizin stellen solche Durchfallerkrankungen, insbesondere bei geschwächten Patienten und Kleinkindern, ein erhebliches Problem dar.Especially when raising pigs, but also in other areas of veterinary medicine, the problem often occurs of diarrheal diseases. Such diarrheal diseases which in particular of Escherichia coli bacteria (e.g. "EHEC" - Bacteria) are caused, z. B. at Weaned piglets, i.e. in piglets that are fed by a diet Breast milk can be switched to a different diet, too high Weight loss and often death. Also in human medicine provide such diarrheal diseases, in particular debilitated patients and young children, a significant one Problem.
Zur Behandlung von Durchfallerkrankungen bei Tieren stehen eine Reihe von Arzneimitteln zur Verfügung, und es kann beispielsweise auf Kraftfutter/Feed Magazine 9/1998, 356; Kraftfutter/Feed Magazine 4/98, 140; Kraftfutter/Feed Magazine 5/96, 200; Der Praktische Tierarzt 79, 2, 1998, 171; Collegium Veterinarium XXIV, 1993, 87 und Lohmann Information, September-Dezember 1994, Seite 5 verwiesen werden. In der Regel werden zur Behandlung solcher Durchfallerkrankungen auch aus Kostengründen Antibiotika eingesetzt, deren Einsatz in der Veterinärmedizin jedoch zunehmend auf Kritik stößt, da die Gefahr besteht, daß schädliche Bakterienstämme gegen Antibiotika resistent werden. Die Druckschrift Kraftfutter/Feed Magazine 4/98, 140 beschreibt den Einsatz von Probiotika, auch von Hefen, jedoch handelt es sich hierbei nicht um Killerhefen, und Killertoxine werden nicht erwähnt.To treat diarrhea in animals a number of medicines are available and it can for example on Kraftfutter / Feed Magazine 9/1998, 356; Concentrate / Feed Magazine 4/98, 140; Concentrate / Feed Magazine 5/96, 200; The Practical Veterinarian 79, 2, 1998, 171; Collegium Veterinarium XXIV, 1993, 87 and Lohmann Information, September-December 1994, page 5. In the They are also used to treat such diarrheal diseases Antibiotics used for cost reasons, their use in the Veterinary medicine, however, is increasingly criticized as the There is a risk that harmful bacterial strains against Antibiotics become resistant. The publication Kraftfutter / Feed Magazine 4/98, 140 describes the use of Probiotics, also from yeast, but these are not about killer yeast, and killer toxins are not mentioned.
Zur Prophylaxe und Behandlung von Durchfallerkrankungen, insbesondere in der Veterinärmedizin, werden wirksame Arzneimittel benötigt, die einfach und preiswert herstellbar sind und nicht die Gefahr bergen, daß Bakterienstämme hiergegen immun werden.For the prophylaxis and treatment of diarrheal diseases, especially in veterinary medicine, become effective Medicines needed that are easy and inexpensive to manufacture and do not pose the risk of bacterial strains become immune to it.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, das vor allem in der Veterinärmedizin zur Behandlung von Durchfallerkrankungen einsetzbar ist. Das Arzneimittel soll insbesondere bei Jungtieren und besonders bevorzugt bei neugeborenen Ferkeln und bei Absetzferkeln, aber auch bei Kälbern verwendbar sein.The invention has for its object a new To provide medicines, especially in the Veterinary medicine for the treatment of diarrhea can be used. The drug is especially intended for Young animals and particularly preferred for newborn piglets and can be used in weaners, but also in calves.
Diese Aufgabe wird aufgrund des überraschenden Befunds gelöst, daß Killertoxine, die durch Fermentation von Killerhefen entstehen, in der Tiermedizin und insbesondere bei Absetzferkeln die schweren Durchfallerkrankungen verhindern. Dies konnte insbesondere auch im Hinblick auf die entgegenstehende Offenbarung Gastroenterology, 109, 1995, 1900-1906 nicht erwartet werden.This task is solved due to the surprising finding that killer toxins by fermentation of killer yeast arise in veterinary medicine and especially in Weaners that prevent severe diarrhea. This was especially true with regard to the conflicting revelation Gastroenterology, 109, 1995, 1900-1906 are not expected.
Die Erfindung stellt daher die Verwendung eines Killertoxins, das durch Fermentation von Killerhefen erhältlich ist, zur Behandlung von Durchfallerkrankungen in der Tiermedizin und insbesondere bei neugeborenen Ferkeln, Absetzferkeln und Kälbern zur Verfügung. Die Verabreichung des Killertoxins kann als ein übliches Arzneimittel (Tabletten), aber auch über ein Futtermittel bzw. ein Futterzusatzmittel für Tiere, das das Killertoxin in einer veterinärmedizinisch wirksamen Dosis enthält, erfolgen. Wird im folgenden über ein Arzneimittel gesprochen, wird hierunter auch ein entsprechendes Futterzusatzmittel für Tiere verstanden.The invention therefore provides the use of a killer toxin, which can be obtained by fermentation of killer yeast, for Treatment of diarrheal diseases in veterinary medicine and especially in newborn piglets, weaners and Calves available. The administration of the killer toxin can as a common medicine (tablets), but also over a Feed or a feed additive for animals that the Killer toxin in a veterinary effective dose contains. The following is about a drug spoken, this is also a corresponding one Animal feed additives understood.
Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Futterzusatzmittel im Sinne eines Wachstumsförderers, insbesondere für Schweine und Ferkel, zur Verfügung, welches ein Fermentationsprodukt von Killerhefe, speziell von Hanseniaspora valbyensis, enthält.In addition, the invention provides a feed additive in Meaning of a growth promoter, especially for pigs and Piglet, which is a fermentation product from Killer yeast, especially from Hanseniaspora valbyensis, contains.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Killerhefen sind nicht besonders eingeschränkt. Es zeigt sich jedoch, daß einige Stämme von Killerhefen entweder besonders wirksame Killertoxine erzeugen oder Killertoxine in einer höheren Konzentration erzeugen als andere Stämme von Killerhefen. Solche Killerhefen sind bevorzugt. Diese sind besonders aus der Weinindustrie bekannt. Erfindungsgemäß ist daher bevorzugt, zur Herstellung der Killertoxine Hefen vom Typ Ascomycetes oder vom Typ Asporogenous zu fermentieren.The killer yeasts which can be used according to the invention are not particularly restricted. However, it turns out that some Strains of killer yeast are either particularly effective Generate killer toxins or a higher level of killer toxins Generate concentration than other strains of killer yeast. Such killer yeasts are preferred. These are special known to the wine industry. According to the invention preferred to produce the killer toxins yeast of the type To ferment Ascomycetes or Asporogenous.
Als Hefen vom Typ Ascomycetes können die folgenden Genera
genannt werden:
The following genera can be named as yeasts of the type Ascomycetes:
- - Saccharomyces (besonders bevorzugt, insbesondere Saccharomyces globosus, z. B. y 438 BKM (BKM Rußland, russische Stammsammlung))- Saccharomyces (particularly preferred, in particular Saccharomyces globosus, e.g. B. y 438 BKM (BKM Russia, russian trunk collection))
- - Saccharomycodes- Saccharomycodes
- - Zygosaccharomyces- Zygosaccharomyces
- - Schizosaccharomyces- Schizosaccharomyces
- - Kluyveromyces- Kluyveromyces
- - Hansenula- Hansenula
- - Pichia (besonders bevorzugt, insbesondere Pichia anomala, z. B. UCSC 25F und Pichia subpelliculosa z. B. NCYC 16)- Pichia (particularly preferred, in particular Pichia anomala, z. B. UCSC 25F and Pichia subpelliculosa e.g. B. NCYC 16)
- - Williopsis (besonders bevorzugt, insbesondere Williopsis mrakii z. B. NCYC 500)- Williopsis (particularly preferred, especially Williopsis mrakii z. B. NCYC 500)
- - Hanseniaspora (besonders bevorzugt, insbesondere Hanseniaspora valbyensis z. B. CBS 311)- Hanseniaspora (particularly preferred, in particular Hanseniaspora valbyensis z. B. CBS 311)
- - Endomycopsis- Endomycopsis
- - Debaromyces- Debaromyces
Als Hefen vom Typ Asporogenous können die folgenden Genera
genannt werden:
The following genera can be mentioned as yeasts of the type Asporogenous:
- - Candida- Candida
- - Cryptococcus- Cryptococcus
- - Torulopsis- Torulopsis
- - Rhodotorula- Rhodotorula
- - Trichosporon- Trichosporon
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß die folgenden Stämme:
The following strains are particularly preferred according to the invention:
- - Hanseniaspora valbyensis 13cs/6ρ-, erhältlich aus Hanseniaspora valbyensis CBS 311 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande), nach Mutation von Mitochondrien (rho- oder ρ-) mit Ethidiumbromid (30 µg/ml) [Rickwood D., B. Dujon, V. M. Darley - Usmar, Yeast Mitochondria, In: Yeast - a Practical Approach, Ed. I. Campbell J. H. Duffus, veröffentlicht in Practical Approach Series 1988, IRL Press Ltd.].- Hanseniaspora valbyensis 13cs / 6ρ - , available from Hanseniaspora valbyensis CBS 311 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Netherlands), after mutation of mitochondria (rho - or ρ - ) with ethidium bromide (30 µg / ml) [Rickwood D., B. Dujon, VM Darley - Usmar, Yeast Mitochondria, In: Yeast - a Practical Approach, Ed. I. Campbell JH Duffus, published in Practical Approach Series 1988, IRL Press Ltd.].
- - Williopsis mrakii AS/15ρ-, erhältlich aus Williopsis mrakii NCYC 500 (National Collection of Yeast Cultures, Norwich, UK), nach Mutation von Mitochondrien (rho- oder ρ-) mit Ethidiumbromidlösung (30 µg/ml) [Rickwood et al., 1988].- Williopsis mrakii AS / 15ρ - , available from Williopsis mrakii NCYC 500 (National Collection of Yeast Cultures, Norwich, UK), after mutation of mitochondria (rho - or ρ - ) with ethidium bromide solution (30 µg / ml) [Rickwood et al. , 1988].
- - Saccharomyces globosus 6/ρ+, erhältlich aus Saccharomyces globosus y 438 BKM (HO/HO, pet/pet, trp/trp, [KIL-K4], russische Stammsammlung), nach Reisolation des aktiven Killerstamms Kolonie Nr. 6.- Saccharomyces globosus 6 / ρ + , available from Saccharomyces globosus y 438 BKM (HO / HO, pet / pet, trp / trp, [KIL-K 4 ], Russian strain collection), after rice isolation of the active killer strain colony No. 6.
- - Pichia anomala 25F-5, erhältlich aus Pichia anomala UCSC 25F (Universita Cattolica del Sacro Cuore, Rom, Italien), nach Reisolation des aktiven Killerstamms, Kolonie Nr. 5.- Pichia anomala 25F-5, available from Pichia anomala UCSC 25F (Universita Cattolica del Sacro Cuore, Rome, Italy), after Rice isolation of the active killer tribe, colony No. 5.
- - Pichia subpelliculosa 16/22, erhältlich aus Pichia subpelliculosa NCYC 16 (National Collection of Yeast Cultures, Norwich, UK), nach Reisolation des aktiven Killerstamms, Kolonie Nr. 22.- Pichia subpelliculosa 16/22, available from Pichia subpelliculosa NCYC 16 (National Collection of Yeast Cultures, Norwich, UK), after rice isolation of the active Killerstamms, colony No. 22.
Der erfindungsgemäß am meisten bevorzugte Hefestamm Hanseniaspora valbyensis 13cs/6ρ- wurde bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) nach dem Budapester Vertrag hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 12718.The most preferred yeast strain according to the invention Hanseniaspora valbyensis 13cs / 6ρ - was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSM) according to the Budapest Treaty and received the deposit number 12718.
Killerhefen als solche sind bekannt und im Prinzip von allen Hinterlegungsstellen, z. B. den vorstehend genannten, erhältlich. Die kommerziell erhältlichen Killerhefestämme werden in einzelne Kolonien aufgetrennt, und die Kolonien werden bevorzugt in YPG-Agarmedium auf Killeraktivität getestet. Geeigneterweise wird die Kolonie mit der größten Killeraktivität zur Fermentation und Herstellung des Killertoxins verwendet.Killer yeasts as such are known and in principle by everyone Depositors, e.g. B. the above, available. The commercially available killer yeast strains are separated into individual colonies, and the colonies are preferred in YPG agar medium for killer activity tested. Suitably the colony will be the largest Killer activity for the fermentation and production of the Killertoxins used.
Gegebenenfalls ist es vorteilhaft, die kommerziell erhältlichen Stämme zu mutieren. Das im folgenden beschriebene Verfahren eignet sich beispielsweise zur Herstellung der besonders bevorzugten Killerhefestämme vom Typ Hanseniaspora valbyensis und Williopsis mrakii. Stämme von Hanseniaspora valbyensis und Williopsis mrakii sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von der National Collection of Yeast Cultures, Norwich, UK, Williopsis mrakii NCYC 500 und dem Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, Hanseniaspora valbyensis CBS 311.It may be advantageous to use the commercial to mutate available strains. The one described below The method is suitable, for example, for producing the particularly preferred killer yeast strains of the Hanseniaspora type valbyensis and Williopsis mrakii. Tribes from Hanseniaspora valbyensis and Williopsis mrakii are commercially available, for example from the National Collection of Yeast Cultures, Norwich, UK, Williopsis mrakii NCYC 500 and the Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Netherlands, Hanseniaspora valbyensis CBS 311.
Die Mutation der Stämme erfolgt geeigneterweise mit Ethidiumbromid, wie in der Literatur beschrieben (Rickwood et al., 1988). Die kommerziell erhältlichen Stämme werden in reichem Medium, z. B. YPG (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glukose) z. B. drei bis vier Stunden bei 30°C unter Schütteln kultiviert (Wachstum bis zur logarithmischen Phase). Danach wird dem Medium eine Ethidiumbromid-Lösung (bis zu 30 µg/ml Medium) zugegeben. Nach 15 Stunden Kultivierung in reichem Medium werden die Hefezellen auf z. B. YPG-Agar in einer Verdünnung ausgebracht, so daß einzelne Kolonien isoliert werden können. Einzelkolonien werden daraufhin parallel auf YPG-Agar und auf RHO-Agar (0,67% YNB, das heißt Yeast Nitrogen Base, mit 1% Glycerin) übertragen. Als rho- (oder ρ-), das heißt als "respiratory deficient", werden diejenigen Zellen bezeichnet, die auf RHO-Agar nicht wachsen können. Kolonien, die auf YPG-Agar wachsen, nicht aber auf RHO-Agar, werden isoliert und weiter auf Killeraktivität untersucht.The strains are suitably mutated with ethidium bromide as described in the literature (Rickwood et al., 1988). The commercially available strains are grown in a rich medium, e.g. B. YPG (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) e.g. B. cultivated for three to four hours at 30 ° C with shaking (growth to the logarithmic phase). Then an ethidium bromide solution (up to 30 µg / ml medium) is added to the medium. After 15 hours of cultivation in rich medium, the yeast cells are z. B. YPG agar applied in a dilution so that individual colonies can be isolated. Individual colonies are then transferred in parallel to YPG agar and to RHO agar (0.67% YNB, that is to say Yeast Nitrogen Base, with 1% glycerol). The cells that cannot grow on RHO agar are called rho - (or ρ - ), that is, "respiratory deficient". Colonies that grow on YPG agar but not on RHO agar are isolated and further examined for killer activity.
Die Killeraktivität kann auf an sich bekannte Art und Weise z. B. wie folgt bestimmt werden. The killer activity can be done in a manner known per se z. B. can be determined as follows.
105 Zellen/ml des Hefestammes Saccharomyces cerevisiae S-6/1 (ein Killerhefe-sensitiver Stamm, diploid, von der Universität in Prag, Department of Genetics and Microbiology Charles University, Faculty of Science CSFR - 12844 Prag 2, Vinicna 5, Tschechien) werden auf J-Medium-Agar (0,25% Hefeextrakt, 0,25% Pepton, 0,5% Glukose und Mineralsubstanzen, 50 mM Puffer Citrat/Phosphat, 2% Agar, pH 4,7) mit 0,003% Methylenblau aufgebracht. Anschließend wird in den Agar eine Vertiefung mit einem Durchmesser von 6 mm hergestellt, in die 100 µl einer Probe zugesetzt werden. Es wird einen Tag bei 28 bis 30°C inkubiert, und anschließend wird die Fläche der Hemmzone bestimmt. Gegebenenfalls kann das Verfahren mit weiteren pathogenen Stämmen, z. B. E. coli, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Salmonella goldcoast oder Pseudomonas aeruginosa, wiederholt werden. Erreicht die Hemmzone eine Fläche von 10 mm2, so entspricht dies 1 Unit (= 1 Einheit) der Killeraktivität.10 5 cells / ml of the yeast strain Saccharomyces cerevisiae S-6/1 (a killer yeast-sensitive strain, diploid, from the University of Prague, Department of Genetics and Microbiology Charles University, Faculty of Science CSFR - 12844 Prague 2, Vinicna 5, Czech Republic ) are applied to J medium agar (0.25% yeast extract, 0.25% peptone, 0.5% glucose and mineral substances, 50 mM buffer citrate / phosphate, 2% agar, pH 4.7) with 0.003% methylene blue , A well with a diameter of 6 mm is then made in the agar, into which 100 μl of a sample are added. It is incubated for one day at 28 to 30 ° C, and then the area of the zone of inhibition is determined. If necessary, the method can be used with other pathogenic strains, e.g. BE coli, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Salmonella goldcoast or Pseudomonas aeruginosa can be repeated. If the zone of inhibition reaches an area of 10 mm 2 , this corresponds to 1 unit (= 1 unit) of killer activity.
Erfindungsgemäß kann ebenfalls der Stamm Hansenula mrakii, insbesondere FERM BP-1197, verwendet werden, der in der DE 36 42 050 A1 ausführlich beschrieben wird. Das von diesem Stamm hergestellte Killertoxin (die Herstellung ist ebenfalls in der DE 36 42 050 A1 beschrieben) hat die in der DE 36 42 050 A1 beschriebene Struktur.According to the invention, the strain Hansenula mrakii, in particular FERM BP-1197 can be used, which is described in DE 36 42 050 A1 is described in detail. That from this tribe Killer toxin produced (the production is also in the DE 36 42 050 A1) has that in DE 36 42 050 A1 described structure.
In der Regel sind die in der DE 36 42 050 A1 beschriebenen Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines Killertoxins aus einem Hefestamm, zur Aufklärung der Struktur eines solchen Killertoxins und zur Bestimmung der Killeraktivität auch für die vorliegende Erfindung verwendbar. Insoweit wird daher, um Wiederholungen zu vermeiden, auf die entsprechende Offenbarung der DE 36 42 050 A1 verwiesen.As a rule, those described in DE 36 42 050 A1 Process for the production and isolation of a killer toxin from a yeast strain, to clarify the structure of such Killer toxins and for determining killer activity also for the present invention usable. To that extent, therefore, in order Avoid repetitions on the appropriate revelation referred to DE 36 42 050 A1.
Die Killerhefen können auf übliche Art und Weise fermentiert
werden, wie es insbesondere in der Brauereiindustrie seit
langem bekannt ist und angewendet wird. Für die fünf besonders
bevorzugten Killerhefestämme der vorliegenden Erfindung sind
bevorzugte Bedingungen für die Fermentation wie folgt:
The killer yeasts can be fermented in the usual way, as has long been known and used in particular in the brewery industry. For the five particularly preferred killer yeast strains of the present invention, preferred fermentation conditions are as follows:
-
- Hanseniaspora valbyensis 13cs/6ρ-:
Der Stamm wird in einem Medium kultiviert, das 5% Glukose, 2% Äpfelsäure, 0,05% Trinatriumcitrat-2-hydrat, 0,004% myo- Inosit, 0,1% Hefeextrakt und 0,1% Pepton enthält. Der pH- Wert des Mediums wird auf etwa 5,0 eingestellt. Es wird zunächst 18 Stunden unter starkem Schütteln bei 28°C kultiviert. Anschließend wird die Fermentationsbrühe ohne Schütteln weitere 20 bis 24 Stunden kultiviert.- Hanseniaspora valbyensis 13cs / 6ρ - :
The strain is cultured in a medium containing 5% glucose, 2% malic acid, 0.05% trisodium citrate 2-hydrate, 0.004% myo-inositol, 0.1% yeast extract and 0.1% peptone. The pH of the medium is adjusted to approximately 5.0. It is first cultivated for 18 hours with vigorous shaking at 28 ° C. The fermentation broth is then cultivated without shaking for a further 20 to 24 hours. -
- Williopsis mrakii AS/15ρ-:
Der Stamm wird in einem Medium kultiviert, das 0,67% YNB (Yeast Nitrogen Base) plus 2% Glukose enthält. Der pH-Wert des Mediums wird auf etwa 4,7 eingestellt. Ein weiteres geeignetes Medium enthält YPG, das heißt 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Glukose. Der pH-Wert dieses Mediums wird ebenfalls auf etwa 4,7 eingestellt. Es wird zunächst 18 Stunden unter starkem Schütteln bei 28°C kultiviert. Anschließend wird die Fermentationsbrühe unter schwachem Schütteln weitere 18 Stunden und dann ohne Schütteln weitere 24 Stunden kultiviert.- Williopsis mrakii AS / 15ρ - :
The strain is cultured in a medium containing 0.67% YNB (Yeast Nitrogen Base) plus 2% glucose. The pH of the medium is adjusted to approximately 4.7. Another suitable medium contains YPG, ie 1% yeast extract, 2% peptone and 2% glucose. The pH of this medium is also adjusted to about 4.7. It is first cultivated for 18 hours with vigorous shaking at 28 ° C. The fermentation broth is then cultivated with gentle shaking for a further 18 hours and then without shaking for a further 24 hours. -
- Saccharomyces globosus 6/ρ+:
Der Stamm wird in einem Medium kultiviert, das 0,67% YNB (Yeast Nitrogen Base), 0,5% Hefeextrakt 0,5% Pepton und 2% Glukose enthält. Der pH-Wert des Mediums wird auf etwa 5,0 eingestellt. Es wird zunächst 18 Stunden unter starkem Schütteln bei 28°C kultiviert. Anschließend wird die Fermentationsbrühe ohne Schütteln weitere 48 Stunden kultiviert.- Saccharomyces globosus 6 / ρ + :
The strain is cultured in a medium containing 0.67% YNB (Yeast Nitrogen Base), 0.5% yeast extract, 0.5% peptone and 2% glucose. The pH of the medium is adjusted to approximately 5.0. It is first cultivated for 18 hours with vigorous shaking at 28 ° C. The fermentation broth is then cultivated without shaking for a further 48 hours. -
- Pichia anomala 25F-5:
Der Stamm wird in einem Medium kultiviert, das 0,67% YNB (Yeast Nitrogen Base) und 2% Glukose enthält. Der pH-Wert des Mediums wird auf etwa 4,7 eingestellt. Ein weiteres geeignetes Medium enthält YPG, das heißt 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Glukose. Der pH-Wert dieses Mediums wird ebenfalls auf etwa 4,7 eingestellt. Es wird zunächst 18 Stunden unter starkem Schütteln bei 28°C kultiviert. Anschließend wird die Fermentationsbrühe unter schwachem Schütteln weitere 18 Stunden und dann ohne Schütteln weitere 20 bis 24 Stunden kultiviert.- Pichia anomala 25F-5:
The strain is cultured in a medium containing 0.67% YNB (Yeast Nitrogen Base) and 2% glucose. The pH of the medium is adjusted to approximately 4.7. Another suitable medium contains YPG, ie 1% yeast extract, 2% peptone and 2% glucose. The pH of this medium is also adjusted to about 4.7. It is first cultivated for 18 hours with vigorous shaking at 28 ° C. The fermentation broth is then cultivated with shaking gently for a further 18 hours and then without shaking for a further 20 to 24 hours. -
- Pichia subpelliculosa 16/22:
Der Stamm wird in einem Medium kultiviert, das 0,67% YNB (Yeast Nitrogen Base), 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Pepton und 2% Glukose enthält. Der pH-Wert des Mediums wird auf etwa 5,0 eingestellt. Es wird zunächst 18 Stunden unter starkem Schütteln bei 28°C kultiviert. Anschließend wird die Fermentationsbrühe ohne Schütteln weitere 36 Stunden kultiviert.- Pichia subpelliculosa 16/22:
The strain is cultured in a medium containing 0.67% YNB (Yeast Nitrogen Base), 0.5% yeast extract, 0.5% peptone and 2% glucose. The pH of the medium is adjusted to approximately 5.0. It is first cultivated for 18 hours with vigorous shaking at 28 ° C. The fermentation broth is then cultivated without shaking for a further 36 hours.
Das Killertoxin kann dann aus der Fermentationsbrühe gewonnen werden, beispielsweise durch chromatographische Verfahren. Ein Verfahren zur Fermentation und Isolation von Killertoxinen ist in Gastroenterology, 109, 1995, 1900-1906 beschrieben. Andere bekannte Verfahren können ebenfalls verwendet werden.The killer toxin can then be obtained from the fermentation broth be, for example by chromatographic methods. On Process for fermentation and isolation of killer toxins in Gastroenterology, 109, 1995, 1900-1906. Other known methods can also be used.
Insbesondere bei der erfindungsgemäß bevorzugten Verwendung des Killertoxins in der Tiermedizin ist die Isolierung des Toxins aus der Fermentationsbrühe jedoch aus wirtschaftlichen Gründen nicht bevorzugt. Vielmehr wird zu diesem Zweck die Fermentationsbrühe mit dem Killertoxin, gegebenenfalls nach geeigneter Aufarbeitung, eingesetzt. Besonders bevorzugt ist es, die Fermentationsbrühe beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration von den Hefezellen zu befreien und die erhaltene Lösung anschließend einer Gefriertrocknung zu unterziehen. Das erhaltene Pulver kann dann auf übliche Art und Weise z. B. zu Tabletten verpreßt werden, in Kapseln gefüllt werden oder als solches verwendet werden. In particular in the use preferred according to the invention of killer toxin in veterinary medicine is the isolation of the Toxins from the fermentation broth, however, from economic Not preferred for reasons. Rather, the Fermentation broth with the killer toxin, if necessary after suitable processing, used. Is particularly preferred it, the fermentation broth, for example by centrifugation or filtration to get rid of the yeast cells and the obtained solution then freeze-drying undergo. The powder obtained can then in the usual way and way z. B. pressed into tablets, in capsules be filled or used as such.
Bei dem bevorzugten Einsatz der Veterinärmedizin ist es am wirtschaftlichsten, den Tieren die Fermentationsbrühe vor der Mahlzeit mit Wasser gemischt zum trinken zu geben oder eine Daueraufnahme zu ermöglichen. Man kann auch Lyophilisat in Wasser auflösen und zum trinken geben. Man kann Fermentationsbrühe auch dem Flüssigfutter zugeben. Für andere Tierarten (Kleintiere) kann Killertoxin aus Lyophilisat auch mikroverkapselt und/oder zu Tabletten formuliert werden und dann der Tränke oder dem Futter zugemischt werden.With the preferred use of veterinary medicine, it is on most economical, the animals before the fermentation broth Meal mixed with water to give to drink or a To allow permanent admission. One can also in Lyophilisat Dissolve water and add to drink. One can Also add the fermentation broth to the liquid feed. For others Animal species (small animals) can also kill toxin from lyophilisate microencapsulated and / or formulated into tablets and then be added to the potions or the feed.
Die geeignetste Dosierung hängt von der Tierart, dem Alter der Tiere, der Schwere der Durchfallerkrankungen, dem Erkrankungsstadium und den speziell eingesetzten Killertoxinen ab. Die Dosierung kann von einem Veterinärmediziner geeignet bestimmt werden.The most suitable dosage depends on the animal species, the age of the Animals, the severity of diarrhea, the Stage of disease and the specially used killer toxins from. The dosage may be suitable from a veterinarian be determined.
Bei Absetzferkeln beträgt allgemein eine übliche Tagesdosis an Killertoxin etwa 100 bis 2000 Einheiten [Units], bevorzugt 200 bis 1200, stärker bevorzugt 200 bis 1000 Einheiten. Dies entspricht üblicherweise etwa 10 bis 50 ml Fermentationsbrühe pro Tier und Tag. Die übliche Dosierung zur Vorbeugung ist etwa 50 bis 1000 Einheiten. Zur Durchfallverhütung ist eine Anwendungsdauer von 10 bis 14 Tagen sinnvoll.In the case of weaned piglets, a usual daily dose is generally given Killer toxin about 100 to 2000 units, preferably 200 to 1200, more preferably 200 to 1000 units. This matches with usually about 10 to 50 ml of fermentation broth per animal and day. The usual dosage for prevention is about 50 to 1000 units. To prevent diarrhea is a period of use from 10 to 14 days makes sense.
Bei neugeborenen Ferkeln liegt die günstigste Dosierung etwas geringer, beispielsweise von 50 bis 1000 Einheiten pro Tag, bevorzugt von 100 bis 600 Units pro Tag. Die Aktivität (Einheit, Unit) wurde an pathogenischen Coli-Stämmen, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.With newborn piglets the cheapest dosage is a little bit lower, for example from 50 to 1000 units per day, preferably from 100 to 600 units per day. The activity (unit, unit) was on pathogenic coli strains as above described, determined.
Die folgenden Werte dienen als Anhaltspunkt und beziehen sich auf die Verwendung des besonders bevorzugten Killerhefestamms Hanseniaspora valbyensis 13cs/6ρ-, wie er vorstehend beschrieben wurde.The following values serve as a reference point and relate to the use of the particularly preferred killer yeast strain Hanseniaspora valbyensis 13cs / 6ρ - , as described above.
Zur Vorbeugung der Durchfallerkrankung bei Ferkeln im Absetzstadium, das heißt bei Ferkeln, die etwa 4 bis 5 Wochen alt sind und circa 12 bis 15 kg wiegen, werden pro Tier und Tag circa 0,5 l Wasser plus 20 ml Fermentationsbrühe verabreicht. Der Gehalt an Killeraktivität in der Fermentationsbrühe beträgt etwa 20 Einheiten pro ml. Damit beträgt die Gesamtdosierung pro Tier und Tag circa 400 Units Killertoxin. Als Dauer der Anwendung hat sich 2 bis 3 Wochen als günstig erwiesen.To prevent diarrhea in piglets in the Weaning stage, that is, in piglets, which lasts about 4 to 5 weeks are old and weigh approximately 12 to 15 kg, per animal and Approx. 0.5 l water plus 20 ml fermentation broth per day administered. The level of killer activity in the Fermentation broth is about 20 units per ml the total dosage per animal and day is approximately 400 units Killer toxin. The duration of use has been 2 to 3 weeks proven to be cheap.
Zur akuten Therapie bei Durchfall können neugeborenen Ferkeln, das heißt 1 bis 5 Tage alten Ferkeln, die circa 1,2 bis 1,5 kg wiegen, 1 bis 2 ml Suspension eines 10-fach Konzentrats der Fermentationsbrühe oral verabreicht werden. Dies wird bevorzugt nach 8 bis 24 Stunden wiederholt. Die Suspension enthält 100 bis 300 Units pro ml, so daß sich eine Tagesdosis pro Ferkel von 100 bis 600 Units ergibt.For acute therapy for diarrhea, newborn piglets, that is 1 to 5 day old piglets, the approximately 1.2 to 1.5 kg weigh 1 to 2 ml suspension of a 10-fold concentrate of Fermentation broth can be administered orally. this will preferably repeated after 8 to 24 hours. The suspension contains 100 to 300 units per ml, so that there is a daily dose from 100 to 600 units per piglet.
Bei 4 bis 6 Wochen alten, circa 12 bis 15 kg schweren Absetzferkeln mit Durchfall hat sich die orale Verabreichung von 2 bis 4 ml Suspension eines 10-fach Konzentrats der Fermentationsbrühe als günstig erwiesen. Die Verabreichung wird 1 bis 2 mal im Abstand von 8 bis 24 Stunden wiederholt. Damit ergibt sich eine Tagesdosis pro Tier von 200 bis 1200 Units Killertoxin.For 4 to 6 week olds, weighing approximately 12 to 15 kg Settling piglets with diarrhea have been given oral administration from 2 to 4 ml suspension of a 10-fold concentrate of Fermentation broth proved to be cheap. The administration is repeated 1 to 2 times at intervals of 8 to 24 hours. This results in a daily dose per animal of 200 to 1200 Units of killer toxin.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist allgemein gegen Durchfallerkrankungen insbesondere von Jungtieren, wie Kälbern oder Ferkeln, einsetzbar, unabhängig vom speziellen Erreger, jedoch besteht eine gewisse Erregerselektivität, von denen die Durchfallerkrankungen hervorgerufen werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz des Arzneimittels bei Durchfallerkrankungen, die durch E. coli (EHEC-Bakterien) hervorgerufen werden, da derartige Durchfallerkrankungen häufig besonders gravierend ablaufen und in der Ferkel- und Kälberaufzucht die meisten Verluste durch Todesfälle oder Kümmern (Entwicklungsstörungen) verursachen. Ohne daß die Erfindung auf einen bestimmten Wirkungsmechanismus eingeschränkt werden soll, wird nach den bisherigen Erkenntnissen davon ausgegangen, daß die Killertoxine nicht die Bakterien, die die Durchfallerkrankungen hervorrufen, direkt bekämpfen (schädigen oder abtöten), sondern vielmehr die Adhäsion der Pathogene an Darmzellen verhindern. Dadurch können krankmachende Coli-Keime die Darmschleimhaut nicht mehr besiedeln, was nach dem derzeitigen Wissensstand als erste Voraussetzung für die Entstehung der verlustreichen E. coli- Ruhr und Coli-Enterotoxämien gilt. Dieser Mechanismus scheint besonders wirkungsvoll bei Jungtieren (Kälber und Ferkel) in den ersten Wochen nach der Geburt und insbesondere auch bei Absetzferkeln zu verlaufen. Der angeführte Wirkungsmechanismus macht auch deutlich, warum die Mikroorganismen praktisch keine Resistenz gegen Killertoxine entwickeln können und Probleme, wie sie bei der Verabreichung von Antibiotika auftreten, nicht zu erwarten sind.The medicament according to the invention is generally against Diarrheal diseases, especially of young animals, such as calves or piglets, can be used, regardless of the specific pathogen, however, there is some pathogen selectivity, of which the Diarrhea. Especially the use of the drug is preferred for Diarrhea caused by E. coli (EHEC bacteria) are caused because of such diarrheal diseases often run particularly serious and in the piglet and Calf rearing has the most casualty or death losses Take care (developmental disorders). Without that Invention on a specific mechanism of action is to be restricted, according to the previous Knowledge assumes that the killer toxins are not the bacteria that cause the diarrhea, fight directly (damage or kill), but rather prevent the pathogens from adhering to intestinal cells. Thereby disease-causing coli can no longer penetrate the intestinal mucosa colonize what, based on current knowledge, be the first Prerequisite for the emergence of lossy E. coli Ruhr and coli enterotoxemia applies. This mechanism seems particularly effective in young animals (calves and piglets) in the first weeks after birth and especially when Weaned piglets. The mechanism of action mentioned also makes clear why the microorganisms practically none Can develop resistance to killer toxins and problems as they occur when antibiotics are administered are to be expected.
Insbesondere bei Jungtieren zeigt das erfindungsgemäße Arzneimittel neben der Behandlung bzw. Verhütung von Darmstörungen auch eine wachstumsfördernde Wirksamkeit, vor allem bei längerer Anwendungsdauer. Hierzu ist eine Anwendungsdauer von 4 bis 6 Wochen sinnvoll. Die Dosierung hierbei entspricht der Dosierung, die zur Vorbeugung gegen Durchfallerkrankungen verabreicht wird.This shows, in particular, in young animals Medicines in addition to the treatment or prevention of Bowel disorders also have a growth-promoting effectiveness especially with a longer period of use. This is a Useful duration of 4 to 6 weeks. The dosage here corresponds to the dosage used to prevent Diarrhea is administered.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.
Zur Durchführung des Fermentationsprozesses wurde 200 l Bm- Medium mit 10 kg D(+)Glukose, 4 kg DL-Äpfelsäure, 1 kg Ammoniumsulfat, 0,1 kg Trinatriumcitrat-2-hydrat, 8 g myo- Inosit, 200 g Hefeextrakt und 200 g Pepton bereitgestellt. Der pH-Wert des Mediums wurde mit circa 3,35 kg KOH auf etwa 5,0 eingestellt. Das Medium wurde bei 80°C etwa 1 Stunde pasteurisiert und anschließend sofort abgekühlt. To carry out the fermentation process, 200 l of B m medium with 10 kg of D (+) glucose, 4 kg of DL-malic acid, 1 kg of ammonium sulfate, 0.1 kg of trisodium citrate-2-hydrate, 8 g of myo-inositol, 200 g of yeast extract and 200 g peptone provided. The pH of the medium was adjusted to approximately 5.0 with approximately 3.35 kg of KOH. The medium was pasteurized at 80 ° C for about 1 hour and then immediately cooled.
Parallel dazu wurde ein Inoculum von Hanseniaspora valbyensis 13cs/6ρ- mit reichem Medium YPG (2% Glukose, 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, pH etwa 5,0) vorbereitet. 3 × 500 ml Medium wurden vom Schrägagar inoculiert (mit 3 × 50 ml pre-Inoculum) und 20 Stunden bebrütet. Die Kulturen wurden in 3 × 4500 ml-Kulturen überführt und 36 Stunden bei 25 bis 28°C unter starkem Rühren bebrütet. Der pH-Wert des Inoculums betrugt etwa 5, wobei 108 Zellen pro ml vorlagen.In parallel, an inoculum of Hanseniaspora valbyensis 13cs / 6ρ - with rich medium YPG (2% glucose, 1% yeast extract, 2% peptone, pH about 5.0) was prepared. 3 × 500 ml medium were inoculated from the slant agar (with 3 × 50 ml pre-inoculum) and incubated for 20 hours. The cultures were transferred to 3 x 4500 ml cultures and incubated for 36 hours at 25 to 28 ° C with vigorous stirring. The pH of the inoculum was about 5, with 10 8 cells per ml.
Nach dem Abkühlen des pasteurisierten Mediums wurden 15 l des Inoculums von Hanseniaspora valbyensis 13cs/6ρ- zugesetzt. Dieser Stamm wurde unter starkem Rühren 18 Stunden bei 28°C kultiviert. Anschließend wurde unter langsamem Rühren 6 Stunden kultiviert, und schließlich wurde die Fermentationsbrühe 20 bis 24 Stunden ohne Rühren kultiviert. Die Fermentationsbrühe wurde nach dem Kultivierungsprozeß (der pH-Wert betrug circa 5 und die Fermentationsbrühe enthielt circa 107 Zellen/ml) abgekühlt und durch eine Sartorius Membran von 0,45 µm filtriert. Die Fermentationsbrühe wies eine Killeraktivität von circa 20 Units/ml auf und konnte bei 8°C gelagert werden.After the pasteurized medium had cooled, 15 l of the Hanseniaspora valbyensis 13cs / 6ρ - inoculum were added. This strain was cultured at 28 ° C for 18 hours with vigorous stirring. Subsequently, cultivation was carried out with slow stirring for 6 hours, and finally the fermentation broth was cultivated for 20 to 24 hours without stirring. The fermentation broth was cooled after the cultivation process (the pH was approximately 5 and the fermentation broth contained approximately 107 cells / ml) and filtered through a Sartorius membrane of 0.45 μm. The fermentation broth had a killer activity of approximately 20 units / ml and could be stored at 8 ° C.
Die Fermentationsbrühe mit dem Killertoxin aber ohne die abfiltrierten Hefezellen wurde auf übliche Art und Weise lyophilisiert. Von 10 l Fermentationsbrühe von Hanseniaspora valbyensis 13cs/6ρ- konnten etwa 200 bis 250 g Pulver erhalten werden. Das Pulver war bei 8°C in Plastikdosen lagerfähig.The fermentation broth with the killer toxin but without the filtered yeast cells was lyophilized in the usual way. About 200 to 250 g of powder could be obtained from 10 l of fermentation broth from Hanseniaspora valbyensis 13cs / 6ρ - . The powder was storable in plastic cans at 8 ° C.
Die Killeraktivität des Lyophilisats bzw. der Fermentationsbrühe wurde wie folgt bestimmt.The killer activity of the lyophilizate or Fermentation broth was determined as follows.
Pathogene Stämme von E. coli, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Salmonella goldcoast, Enterobacter faecalis und Pseudomonas aeruginosa wurden als sensitive Stämme für Hanseniaspora valbyensis 13cs/6ρ- verwendet. Die Killeraktivität wurde nach Auftragen von 105 Zellen/ml von jeweils einem der genannten Stämme auf ein Standard-Agar- Medium für Bakterien bestimmt. In die Agar-Platte wurde eine Vertiefung mit einem Durchmesser von 6 mm eingeführt, in die anschließend 100 µl Probe zugesetzt wurden (entweder die Fermentationsbrühe oder die 10-fach konzentrierte Fermentationsbrühe nach der Lyophilisierung). Es wurde 24 Stunden bei 37°C inkubiert, und die Fläche der Hemmzone wurde bestimmt. Eine Hemmzone von 10 mm2 entspricht 1 Unit (= 1 Einheit) der Killeraktivität.Pathogenic strains of E. coli, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Salmonella goldcoast, Enterobacter faecalis and Pseudomonas aeruginosa were used as sensitive strains for Hanseniaspora valbyensis 13cs / 6ρ - . The killer activity was determined after application of 10 5 cells / ml of one of the strains mentioned to a standard agar medium for bacteria. A well with a diameter of 6 mm was introduced into the agar plate, into which 100 μl of sample were then added (either the fermentation broth or the 10-fold fermentation broth after lyophilization). It was incubated at 37 ° C for 24 hours and the area of the zone of inhibition was determined. An inhibition zone of 10 mm 2 corresponds to 1 unit (= 1 unit) of killer activity.
In der folgenden Tabelle ist die Killeraktivität in Units/ml der 10-fach konzentrierten Lösung für verschiedene pathogene Stämme aufgeführt.In the following table the killer activity is in units / ml the 10-fold concentrated solution for various pathogenic Tribes listed.
Zur Herstellung eines Futtermittels bzw. Futterzusatzmittels werden von der in Beispiel 1 hergestellten Fermentationsbrühe die Hefezellen durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt. Anschließend wird wie in Beispiel 1 beschrieben die Aktivität bestimmt. Die Fermentationsbrühe als solche oder ein daraus hergestelltes Konzentrat oder Lyophilisat wird in geeignete Behältnisse abgefüllt und kann direkt als Zusatzstoff zur Tränke der Tiere verwendet werden.For the production of a feed or feed additive are from the fermentation broth prepared in Example 1 the yeast cells by filtration or centrifugation separated. The procedure is then as described in Example 1 determines the activity. The fermentation broth as such or a concentrate or lyophilisate made from it is in suitable containers filled and can be used directly as Additive used to water the animals.
Die Wirksamkeit der Killertoxine gemäß der vorliegenden Erfindung wurde an einem Bestand von 1500 Ferkeln pro Jahr, in dem eine endemische Coli-Infektion mit laufenden Erkrankungen und Todesfällen herrschte, getestet. Eine Versuchsgruppe aus 20 Ferkeln im Alter von 5 Wochen wurde 12 Tage mit 20 ml der Fermentationsbrühe aus Beispiel 1 in Wasser eingemischt behandelt. In der Versuchsgruppe traten keinerlei Erkrankungen oder Verluste auf.The effectiveness of the killer toxins according to the present Invention was made on a stock of 1500 piglets per year, in an endemic coli infection with ongoing diseases and deaths prevailed, tested. A test group from 20 piglets at the age of 5 weeks were treated with 20 ml of the 12 days Fermentation broth from Example 1 mixed in water treated. No diseases occurred in the test group or losses on.
In einer Kontrollgruppe von 20 Ferkeln im Alter von 5 Wochen, die parallel zur Versuchsgruppe 12 Tage lang das gleiche Futter wie die Versuchsgruppe erhielten, jedoch ohne Fermentationsbrühe oder eine andere Medikamentation, erkrankten innerhalb von 6 Tagen 12 Ferkel und 2 Tiere verendeten. 4 weitere Tiere zeigten Coli-Ödemsymptome.In a control group of 20 piglets at 5 weeks of age, the same in parallel to the test group for 12 days Received food like the test group, but without Fermentation broth or other medication, 12 piglets and 2 animals fell ill within 6 days dead. 4 other animals showed coli edema symptoms.
Bei bereits festgestellter Erkrankung durch E. coli (Durchfall-, Coli-Ruhr-, Enterotoxämie) ist die Wirkung des Killertoxins nach Beispiel 1 am stärksten bei direkter oraler Verabreichung in Form eines Lyophilisats als Suspension oder, nach zusätzlicher Reinigung, als Lösung. Dabei wird eine 10- fach Konzentration in einem wäßrigen Trägersystem hergestellt. Die Suspension kann sowohl Kälbern als auch Ferkeln, insbesondere in frühjugendlichem Alter, verabreicht werden.If the disease has already been identified by E. coli (Diarrhea, coli dysentery, enterotoxemia) is the effect of Killertoxins according to Example 1 most strongly in direct oral Administration in the form of a lyophilisate as a suspension or after additional cleaning, as a solution. A 10- fold concentration in an aqueous carrier system. The suspension can be used for both calves and piglets, especially in early adolescence.
Die Wirksamkeit der Killertoxine wurde so über einen Zeitraum von 4 Jahren getestet. In diesem Zeitraum wurden insgesamt etwa 3000 bis 4000 neugeborene Ferkel mit der Fermentationsbrühe oder mit Lyophilisat behandelt. Bei den neugeborenen Ferkeln im Alter von 1 bis 5 Tagen wurde dabei bei 60% der Tiere nach einmaliger Behandlung der Durchfall geheilt, bei 35% der Tiere nach zweimaliger Behandlung innerhalb von 1 bis 3 Tagen. Die Dosierung betrug 1 bis 2 ml der Suspension, was 200 bis 400 Units pro Ferkel und pro Verabreichung entspricht. Die Verabreichung wurde nach 12 bis 24 Stunden wiederholt.The effectiveness of the killer toxins has been over a period of time tested by 4 years. During this period, a total of about 3000 to 4000 newborn piglets with the Fermentation broth or treated with lyophilisate. Both newborn piglets aged 1 to 5 days was included diarrhea in 60% of the animals after a single treatment healed in 35% of the animals after two treatments within 1 to 3 days. The dosage was 1 to 2 ml of the suspension, which is 200 to 400 units per piglet and per Administration corresponds. The administration was after 12 to Repeated 24 hours.
Bei älteren Ferkeln von 3 bis 5 Wochen (hier wurden insgesamt etwa 1500 Tiere getestet) war die Erfolgsquote ähnlich wie bei neugeborenen Ferkeln, jedoch war die Dosierung doppelt so hoch wie die Dosierung bei den neugeborenen Ferkeln, das heißt für eine Behandlung wurden 1 bis 3 mal im Abstand von 8 bis 24 Stunden jeweils 2 bis 4 ml der Suspension mit dem Killertoxin nach Beispiel 1 verabreicht.In older piglets from 3 to 5 weeks (here were total tested about 1500 animals), the success rate was similar to that of newborn piglets, however, the dosage was twice as high like the dosage for newborn piglets, that is for one treatment was performed 1 to 3 times at an interval of 8 to 24 Hours 2 to 4 ml of the suspension with the killer toxin administered according to Example 1.
Aus einem Bestand an Ferkeln, in dem ohne Behandlung 30 bis 40% Todesfälle durch Durchfallerkrankungen zu beobachten sind, wurde eine Versuchsgruppe aus 10 Ferkeln ausgewählt. Die Ferkel waren 5 Wochen alt, in der Absetzphase und zeigten hochgradigen Durchfall, Ödemsituation und eine starke Störung des Allgemeinbefindens. Am ersten Tag wurden jedem Ferkel 4 ml Suspension (wie in Beispiel 4 beschrieben) mit einem Dosierer direkt in die Maulhöhle verabreicht. Am zweiten Tag wurde die Behandlung mit gleicher Dosis nach 12 Stunden wiederholt. Am dritten Tag waren bei allen Tieren die Krankheitssymptome verschwunden und alle Tiere zeigten guten Appetit. Am vierten Tag wurde die Behandlung mit 2 ml Suspension wiederholt, um einem Rückfall vorzubeugen. Alle Tiere waren anschließend gesund und zeigten ein gutes Wachstum.From a herd of piglets in which 30 to 40% deaths from diarrhea are observed a test group was selected from 10 piglets. The Piglets were 5 weeks old, in the weaning phase and showed severe diarrhea, edema and severe disorder of general well-being. On the first day, 4 ml Suspension (as described in Example 4) with a dosing device administered directly into the mouth. On the second day the Treatment repeated with the same dose after 12 hours. At the The third day was the disease symptoms in all animals disappeared and all animals showed good appetite. On the fourth Day treatment was repeated with 2 ml suspension to prevent relapse. All animals were then healthy and showed good growth.
Ein 5 Tage altes Kalb mit hochgradigem Durchfall und allgemeinem Schwächezustand wurde mit dem erfindungsgemäßen Killertoxin behandelt. Hierzu wurde eine Suspension eingesetzt, wie bei Beispiel 4 beschrieben.A 5 day old calf with severe diarrhea and general weakness was with the invention Treated killer toxin. For this, a suspension was used used as described in Example 4.
Am ersten Tag wurden 12 ml der Suspension mit einem Elektrolyt-Diätetikum als Adjuvants direkt in die Maulhöhle gespritzt. Am zweiten Tag wurden nochmals 10 ml Suspension oral verabreicht. Nach 36 Stunden waren alle Krankheitsanzeichen verschwunden.On the first day, 12 ml of the suspension were mixed with a Electrolyte dietary as adjuvants directly into the mouth injected. On the second day, another 10 ml suspension administered orally. After 36 hours everyone was gone Signs of illness disappeared.
Wie vorstehend beschrieben wurden 2 Kälber (Zwillinge) im Alter von 4 Tagen, die an Coli-Ruhr erkrankt waren, mit dem Killertoxin aus Beispiel 1 behandelt. An 2 aufeinanderfolgenden Tagen wurden jeweils 10 ml der Suspension oral verabreicht. Beide Tiere waren nach 36 Stunden geheilt.As described above, 2 calves (twins) were in the Age of 4 days, who were suffering from coli dysentery, with the Killer toxin from Example 1 treated. On 2nd consecutive days were each 10 ml of the suspension administered orally. Both animals were healed after 36 hours.
Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Abwandlung, daß statt Hanseniaspora valbyensis 13cs/6ρ- der Stamm Williopsis mrakii AS/15ρ- eingesetzt wurde. Nach der Abtrennung der Fermentationsbrühe von den Hefezellen wurde lyophilisiert. Von dem erhaltenen Pulver wird mit Wasser ein 20-fach Konzentrat hergestellt und unter Verwendung einer 3,5 kD MWCO Membran bei pH 4,7 in 3 mM Citrat/Phosphat Puffer dialysiert. Nach der Dialyse wird erneut lyophilisiert und das Produkt kann gegebenenfalls weiteren Reinigungsschritten wie isoelektrischer Fokussierung, Ionenaustausch-Chromatographie oder Gelfiltration unterworfen werden. Im vorliegenden Beispiel wurden die Killerproteine über eine Ionenaustausch- Chromatographie (FPLC - Fast Performance Liquid Chromatography) mit einem stark kationischen Ionenaustauscher vom Typ Resource Mono S® (der Firma Pharmacia) abgetrennt. Das Programm für die Abtrennung der Killerproteine kann folgender Tabelle entnommen werden. Example 1 was repeated, with the modification that instead of Hanseniaspora valbyensis 13cs / 6ρ - the strain Williopsis mrakii AS / 15ρ - was used. After the fermentation broth had been separated from the yeast cells, lyophilization was carried out. A 20-fold concentrate is prepared from the powder obtained with water and dialyzed using a 3.5 kD MWCO membrane at pH 4.7 in 3 mM citrate / phosphate buffer. After dialysis, the product is lyophilized again and the product can optionally be subjected to further purification steps such as isoelectric focusing, ion exchange chromatography or gel filtration. In the present example, the killer proteins were separated by means of ion exchange chromatography (FPLC - Fast Performance Liquid Chromatography) with a strongly cationic ion exchanger of the Resource Mono S® type (from Pharmacia). The program for the separation of the killer proteins can be found in the following table.
Der Kollektor wurde mit 1 ml/2 min betrieben, das heißt 25 Reagenzgläser mit Fraktionen von jeweils 2 ml wurden abgenommen.The collector was operated at 1 ml / 2 min, i.e. 25 Test tubes with fractions of 2 ml each were decreased.
Die Äquilibrierung der Säule und Abtrennung der Killerproteine erfolgte mit 10 mM Puffer Citronensäure/Natriumcitrat bei pH 3,2. Es wurde mit einem Gradienten von NaCl zwischen 0 bis 0,5 M eluiert, wobei die Natriumchloridlösung mit dem Puffersystem auf einen pH von 3,2 gebracht worden war.Equilibration of the column and separation of the killer proteins was carried out with 10 mM buffer citric acid / sodium citrate at pH 3.2. It was used with a gradient of NaCl between 0 to 0.5 M eluted with the sodium chloride solution using the buffer system had been brought to pH 3.2.
Nach Trennung jeder Fraktion wurde die biologische Killeraktivität getestet. Die höchste biologische Aktivität war zwischen den Fraktionen Nr. 9 und 10 und bei Fraktion Nr. 14, wie es in folgender Tabelle aufgeführt ist. After each fraction was separated, the biological Killer activity tested. The highest biological activity was between Fractions Nos. 9 and 10 and Fraction Nos. 14 as shown in the table below.
Die Fraktionen Nr. 9, 10 und 14 wurden gesammelt und erneut einer Dialyse unterworfen. Nach der Dialyse erhält man 50 ml Lösung, die gefriergetrocknet wurden. Man erhielt 15,6 mg Pulver mit 5 mg Killerproteinen (die Messung der Proteinkonzentration erfolgte nach dem Lowry-Verfahren). Das Leistungsvermögen dieses Reinigungssystems betrug 90%. Nach der Reinigung enthält 1 ml Präparat 0,1 mg Killerprotein mit 320 Units Killeraktivität.Fractions Nos. 9, 10 and 14 were collected and again undergo dialysis. After dialysis, 50 ml are obtained Solution that have been freeze-dried. 15.6 mg was obtained Powder with 5 mg of killer proteins (measuring the Protein concentration was carried out according to the Lowry method). The The performance of this cleaning system was 90%. To the cleaning contains 1 ml preparation 0.1 mg killer protein 320 units of killer activity.
Der Reinheitsgrad des Killertoxins wurde mit einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nativen und denaturierenden Bedingungen überprüft, und es wurde eine isoelektrische Fokussierung durchgeführt.The degree of purity of the killer toxin was determined with a Polyacrylamide gel electrophoresis under native and denaturing conditions checked and it became a isoelectric focusing performed.
Die physikochemischen und biochemischen Eigenschaften des Killerproteins von Williopsis mrakii AS/15ρ- können folgender Tabelle entnommen werden. The physicochemical and biochemical properties of the killer protein from Williopsis mrakii AS / 15ρ - can be found in the following table.
Häufig wird bei Durchfallerkrankungen mit E. coli gleichzeitig eine Mischinfektion mit Rota- oder Coronaviren festgestellt. Die Behandlung mit dem Killertoxin gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere mit dem Killertoxin des Beispiels 1, zeigte hierbei besonders gute Erfolge und ist der Antibiotikaanwendung überlegen. Darmstörungen und Allgemeinbefinden werden schneller regeneriert.Diarrhea is common with E. coli at the same time a mixed infection with rota or corona viruses has been detected. Treatment with the killer toxin according to the present Invention, in particular with the killer toxin of Example 1 showed particularly good results and is Consider antibiotic use. Bowel disorders and General health is regenerated faster.
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