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Verfahren zur Herstellung eines mit L-Amino-
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säure substituierten Polypeptids In den vergangenen Jahren waren
Wissenschaftler bemüht, schmackhafte nahrhafte proteinische Nahrungsmittel aus Pflanzen
und billigen tierischen Quellen als Ergänzung oder Ersatz für tierische proteinische
Nahrungsmittel herstellten. Um für den menschlichen Verbraucher akzeptabel zu sein,
muß das Proteinprodukt wirtschaftlich, ernährungsmäßig ausgeglichen, angenehm im
Geschmack und frei von unangenehmen Gerüchen oder Farben sein. Zur Zeit werden proteinhaltige
Nahrungsmittel hauptsächlich aus Hülsenfrüchten oder Getreide hergestellt. Diese
Proteine haben jedoch unglücklicherweise einen Mangel an wichtigen Aminosäuren,
wie Metheonin, Lysin und dergleichen. Nahrungsmittelwissensohaftler bazeicoanc..
solche Aminosäuren als "begrenzend". Daher wird der Nährwert der Proteine auf den
Gehalt beschränkt, der durch die erste "begrenzende" Aminosäure bestimmt wird, und
um einen ausreichenden Nährwert
zu haben, muß man sehr große Mengen
an Protein verbrauchen.
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Es ist bekannt, daß die Nährqualität von proteinischen Stoffen dadurch
verbessert werden kann, daß man berechnete Mengen an fehlenden oder an "limitierenderî"
Aminosäuren zugibt. Man hat z.B. festgestellt, daß durch Zugabe von Lysin zu Maisprotein
der Nährwert eines solchen Proteins erheblich verbessert wird. In ähnlicher Weise
hat man Sojabohnenprotein mit Methionin angereichert und dadurch eine Verbesserung
des Nährwertes erzielt. Unglücklicherweise sind wegen erheblicher, bisher nicht
gelöster Geschmacksprobleme viele Versuche, Aminosäure-defiziente Nahrungsmittel
mit freien Aminosäuren anzureichern, erfolglos geblieben, was zum Teil auf die Eigenart
der jeweiligen zugegebenen Aminosäuren zurückzuführen ist.
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Außer den den freien Aminosäuren anhaftenden Geschmackseigenschaften
treten andere, nicht vermeidbare Geschmacke durch Abbauverfahren, z.B. durch Luftoxidation
und insbesondere als Ergebnis des Streckerschen Abbaus der Aminosäure (eine Reaktion,
bei der übelriechende Verbindungen, wie Mercaptane und Sulfide entstehen) auf. Wegen
dieser unangenehmen Geschmacksprobleme liegt ein Bedürfnis vor, andere Mittel aufzufinden,
um die Aminosäure-Defizienz, insbesondere Methionin-Defizienz, zu überwinden.
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Eine Reihe von Verfahren zum Verbessern der Geschmacksprobleme, die
durch die Zugabe von Methionin und anderen Aminosäuren eintreten, sind bekannt.
Zu den bekannten Verfahren gehört das Einkapseln der freien Aminosäure in ein inertes
Medium, wie Rindertalg, die gleichzeitige Einverleibung von gewissen Anti3rowning-Mitteln,
um den Streckerschen Abbau zu verhindern, die Anwendung der Plastein-Reaktion, die
Verwendung von verschiedenen Proteinmischungen,
wie Maisprotein
mit Sojaprotein und die Verwendung von Derivaten von Metheonin oder anderen Aminosauren,
die geschmacklos, nicnt-toxisch, stabil und dennoch bei der Einnahme nahrhaft sind.
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Von den vorerwähnten Verfahren ist die Plasteinreaktion besonders
sorgfältig als Mittel zum Modifizieren von Proteinen für die Anreicherung in Nahrungsmitteln
untersucht worden (5. Agr. Biol. Chem., 34, 483-484, 1325-1337, 1484-1500, 1593-1596;(1970);
ibid, 35, 86-91 (1971); ibid 36, 1353 (1972); Cereal Chem. 51, 143 (1974); J. Agr.
c-hem. 24 1100 (1976);- und U.S.-Patentschrift 3 803 327).. Wird ein Protein teilhydrolysiert,
konzentriert und dann mit -gewissen proteolytischen Enzymen unter geeigneten Bedingungen
inkubiert, so bildet sich ein Proteinähnliches Material mit hohem Molekulargewicht,
dessen Bigenschaften sich von dem Ursprungsprotein unterscheiden. Diese proteinähnlichen
Substanzen werden als "Plasteine" bezeichnet und die Umsetzung, die zu diesen Plasteinen
führt, wird als "Plastein-Reaktion" bezeichnet, die im wesentlichen die folgenden
beiden verschiedenen Stufen umfaßt:
| Protein (niedrige Substratkonzentration) |
| enzymatische Hydrolyse |
| Protein-Hydrolysat (hohe SubstratRonzentration) |
| enzymatische (Papain) Synthese |
| pH 3-7 |
| Plastein |
| Plastein |
Die vorerwähnte Plastein-Reaktion ist besonders geeignet zur Verbesserung des Geschmackes
des Ausgangsmaterials
ohne dessen Aminosäureprofil wesentlich zu
beeinflussen.
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Dieses wohlschmeckende Plastein ist dann als proteinhaltiger Ergänzungsstoff
bei verschiedenen Nahrungsmitteln geeignet.
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Es wurde auch festgestellt, daß die Papain-katalysierte Plastein-Reaktion
die Einverleibung von Aminosäureester(n) ermöglicht, wodurch ein modifiziertes Plasteinprodukt
mit einem hohen verbesserten Niveau an den eingebauten Aminosäuren gebildet wird
(S. J. Agr. Food Chem., 19, 1151 (1971) ). Diese Reaktion besteht im wesentlichen
aus den folgenden beiden unterschiedlichen Stufen:
| Protein (niedrige Substratkonzentration) |
| enzymatische Hydrolyse |
| Protein-Hydrolysat (hohe SubstratRonzentration) |
| + Aminosäureester |
| enzymatische (Papain)-Synthese |
| pH 5-7 |
| Mit Aminosäure angereichertes Plastein |
Die vorstehende Plastein-Reaktion wird zum Verbessern des Geschmacks und des Aminosäureprofils
der Ausgangsstoffe verwendet. Das so angereicherte Plastein kann dann als Ergänzung
und zur Verbesserung des Aminosäureprofils bei Aminosäure angereicherten Nahrungsmitteln
verwendet werden.
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Obwohl das klassische Plastein und die Aminosäure angereicherten Piasteine
beim Verstärken von proteinhaltigen Nahrungsmitteln durchaus versprechend sind,
hat die Plastein-Reaktion doch Nachteile, die deren praktische Verwendbarkeit beschränken.
Insbesondere erfordert die Reaktion die verschiedenen einzelnen Stufen der Hydrolyse,
der Substratkonzentration
und der Synthese. Die Notwendigkeit,diese
einzelnen Verfahrensstufen vorzunehmen, ist zeitaufwendig und kostspielig. Deshalb
wäre es sehr wünschenswert, ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung eines
wohlschmeckenden und ernährungsmäßig ausgeglichenen proteinhaltigen Ersatz stoffes
für die Anreicherung in Nahrungsmitteln zu zeigen.
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Im September 1977 wurde in einem Aufsatz mit dem Titel "Nutritional
Improvement of Food Proteins By Means of the Plastein Reaction and Its Novel Modification"
by S. Arai, M. Yamashita und M. Fujimaki, der bei einem Symposium der American Chemical
Society in Chicago, Illinois, vorgetragen wurde, ein Einstufenverfahren zum Einverleiben
von Aminosäuren in Proteine gezeigt. Im April 1977 wurde ein Vortrag vor der Agricultural
Chemical Society in Japan von Imaizumi ein ähnliches Einstufenverfahren, das auf
den Arbeiten von S. Arai und M. Fujimaki aufbaut, vorgetragen.
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Gemäß der Erfindung wird ein neues Verfahren zur Herstellung eines
L-Aminosäure-substituierten Polypeptids gezeigt. Das Verfahren umfaßt die Herstellung
einer wäßrigen Reaktionsmischung aus einem Protein, einem Aminosäure-Niedrigalkylester-Hydrochlorid
und einem proteolytischen Enzym, worauf die Mischung unter geeigneten Reaktionsbedingungen
umgesetzt wird unter Ausbildung eines L-Aminosäure-substituierten Polypeptidproduktes,
das aus der wäßrigen Mischung dann gewonnen wird. Das Polypeptidprodukt ist als
Proteinersatz oder als Zusatz zu verschiedenen Aminosäure-defizienten Nahrungsmitteln
geeignet.
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Geeignete Protein-Ausgangsmaterialien sind solche aus pflanzlichen
und tierischen Quellen. Pflanzenproteine werden
aufgrund ihrer
niedrigen Kosten und Zugänglichkeit bevorzugt und schließen Hülsenfrüchtesamenproteine,
Getreideproteine und dergleichen ein. Bevorzugte Pflanzenproteine sind Hülsenfrüchteproteine,
wie Sojabohnen, Erdnüsse, Baumwollsamen, Sonnenblumensamen und dergleichen. Ganz
besonders bevorzugt wird Sojabohenprotein. Zu den anderen Proteinen gehören Kasein,
Fischprotein, Molkeprotein, Lactalbumin, Mikrobenprotein und dergleichen. Verschiedene
Proteinfraktionen aus Hülsenfrüchtenproteinen und anderen Proteinen, die durch ihren
Proteingehalt und das Verfahren ihrer Herstellung gekennzeichnet sind, wie Mehle,
Konzentrate oder Isolate, können verwendet werden.
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Man stellt eine wäßrige Mischung her, welche das vorgenannte Protein
in einer Konzentration von etwa 10 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht
der Mischung, enthält. Bei Proteinkonzentrationen erheblich unterhalb 10 Gew.-%
tritt eine unerwünschte Proteinhydrolyse ein. Bei Konzentrationen erheblich oberhalb
30 Gew.-% wird die wäßrige Mischung zu dick, um noch einfach gehandhabt zu werden.
Vorzugsweise liegt die Konzentration des Proteins in der Mischung zwischen etwa
10 und 20 Gew.-% und insbesondere bei etwa 20 Gew.-%. Innerhalb des genannten Konzentrationsbereiches
wird die Proteinhydrolyse bei einem Minimum gehalten.
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Alle Aminosäure-Reaktanten und deren Isomere sind bekannt und im Handel
erhältlich. Geeignete Aminosäuren schließen solche ein, deren Ester in wäßrigem
Reaktionsmedium bei einem pH zwischen etwa 6,0 und 11,0 löslich sind, und die ausreichend
reaktiv sind, um kminosäure-substituierte Polypeptidprodukte gemäß der Erfindung
zu bilden. Beim erfindungsgemäßen
Verfahren wurden z.B. die folgenden
Aminosäuren erfolgreich verwendet: L-Aminobuttersäure, Tyrosin, Methionin, Norvalin,
Leucin, Phenylalanin, Norleucin, Tryptophan, Lysin und Threonin. Man kann entweder
DL-razemische Mischungen oder die L-stereoisomeren Formen der Aminosäure verwenden,
weil man festgestellt hat, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren nur die L-Stereoisomere
selektiv eingebaut werden.
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Die Aminosäurealkylester-Hydrochloride mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen
in der Alkylketter werden in bekannter Weise hergestellt gemäß Helv. Chim. Acta.
39, 1421 (1950). Die Aminosäure wird z. B. in einem wasserfreien geradkettigen oder
verzweigten Alkohol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Äthanol, Propanol,
Butanol, Pentanol, Hexanol, Heptanol oder Octanol und dergleichen dispergiert, gekühlt
und unter Rühren wird gasförmiger Chlorwassrstoff oder Theonylchlorid zugegeben.
Dann wird die Mischung mehrere Stunden unter Bildung des Aminosäureester-Hydrochlorids
rückflußbehandelt. Die erhaltene Mischung wird im Vakuum konzentriert und das Aminosäureester-Hydrochlorid
wird durch Zugabe von Äther ausgefällt. Ein reines kristallines Produkt erhält man
durch Umkristallisation aus einer Alkohol/ Äther-Mischung.
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Das Aminosäure-Niedrigalkylester-Hydrochlorid wird zu der vorerwähnten
wäßrigen Mischung in einer Konzentration von etwa 1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das
Gewicht des Proteinsubstrat gegeben. Vorzugsweise beträgt die Konzentrati nn, 5
bis 10 Gcw.-°, kezogcrX auf das P ProteIn. Bei Konzentrationen von mehr als etwa
30 Gew.-% findet eine unerwünschte Selbstpolymerisation des oder der Aminosäure(n)
statt.
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Bei diesem Verfahren sind proteolytische Enzyme, wie Papain, Bromlain,
Ficin und dergleichen brauchbar. Am meisten wird Papain als Enzym bevorzugt. Proteolytische
Enzyme mit hohen Esterase- oder Lipaseaktivitäten sollen vermieden werden.
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Das proteolytische Enzym wird zu der wäßrigen Mischung in einer Konzentration
von weniqstens etwa 0,1 Gew.-%, bezoqen auf das Gewicht des Proteinsubstates, gegeben.
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Vorzugsweise liegt die Konzentration zwischen 0,1 und 2,0 Gew.-%,
bezogen auf das Gewicht des Proteins. Ganz besonders wird eine Konzentration zwischen
0,5 und 1 Ges. %, bezogen auf das Protein.
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Die wäßrige Mischung kann als Bestandteil gegebenfalls auch einen
Enzymaktivator enthalten. Geeignete Aktivatoren für proteolytische Enzyme sind Sulfhydryl-enthaltende
Reagenzien wie Cystein, Mercaptoäthanol und dergleichen. Insbesondere für Papain
wird Cystein als Aktivator bevorzugt.
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Der Aktivator wird vorzugsweise in einer Menge von etwa 1,0 mMol.
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Die so hergestellte wäßrige Mischung wird dann zur Bildung eines L-Aminosäure-substituierten
Polypeptids geeigneten Reaktionsbedingungen unterworfen. Es wird angenommen, daß
die Einstufenreaktion wie folgt verläuft:
| Protein + proteolytisches Enzym t Aminosäureester HCl |
| P eptidyl-Enzym-Zwischenprddukt |
| (in situ gebildet) |
| Amino lys e |
| I r |
| Polypeptid-Aminosäureester + proteolytisches Enzym |
Geeignete Reaktionsbedingungen schließen die Einstellung des pH,
Überwachung der Temperatur und der Zeit ein. Die Reaktionsbedingungen werden so
ausgewählt, daß sie maximal den Einbau der ausgewählten Aminosäure(n) begünstigen.
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Es wurde festgestellt, daß die Anfangsgeschwindigkeit des Aminosäureeinbaues
erheblich von der Struktur und der Hydrophobizität der Aminosäure und der Alkylesterseitenkette
der Aminosäure abhängt. Zum Beispiel haben sterisch gehinderte Aminosäuren, wie
ß-verzweigte Aminosäuren, beispielsweise Valin und Isoleucin oder solche mit Hydrophobizitäten
von weniger als -etwa 350 cal/Mol, wie Glyzin, Alanin und dergleichen, bei diesem
Verfahren niedrige Reaktivitäten.
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Diese Wirkung kann jedoch durch Veresterung der jeweiligen Aminosäure
mit einem hydrophoberen, d.h. langkettigen Alkohol, wie Butan, Hexanol oder Octanol,
zur Erhöhung der Einbaugeschwindigkeit, modifiziert werden. Vorzugsweise haben die
Aminosäuren eine Hydrophobizität von mehr als 350 cal/Mol.
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Zum Beispiel haben die Aminosäuren L-Aminobuttersäure (378), Tyrosin
(513), Methionin (598), Norvalin (733), Leucin (838), Phenylanalin (867), Norleucin
(897) und Tryptophan (958), solche bevorzugten Hydrophobizitäten (cal/Mol).
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Der Anfangs-pH der wäßrigen Mischung wird auf etwa 6,0 bis 11,0 eingestellt.
Vorzugsweise liegt der Anfangs-pH der wäßrigen Mischung zwischen pH 8,0 und 10,0.
Oberhalb etwa pH 11,0 und unterhalb etwa pH 6,0 wird der Einbau der Aminosäure drastisch
vermindert. Der pH kann durch Verwendung eines basischen oder Puffermaterials, wie
Natriumhydroxid, Natriuiiicärbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumhydroxid, Mischungen
und dergleichen, eingestellt werden. Obwohl die Umsetzung ohne nachfolgende Anpassung
des pH der wäßrigen Mischung abläuft, wird die Verwendung eines geeigneten
Puffers
oder die nachfolgende Anpassuny des pH zur Aufrechterhaltung des pH der Mischung
innerhalb des Anfangs-pH-Bereiches bevorzugt.
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Die Temperatur der wäßrigen Mischung wird zwischen etwa 200C und 400C
gehalten. Sie beträgt vorzugsweise etwa 37°C.
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Man läßt die Umsetzung ablaufen, bis die Aminosäureester im wesentlichen
Maße eingebaut worden sind. Man kann periodisch Proben entnehmen und sie nach Standard-Verfahren
zur Bestimmung des Gehaltes an nichteingebauten Aminosäureestern analysieren. Vorzugsweise
liegt die Reaktionszeit zwischen 8 und 24 Stunden.
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Das L-Aminosäure-substituierte Polypeptidreaktionsprodukt kann in
bekannter Weise aus der wäßrigen Reaktionsmischung die neben dem gewünschten Produkt
noch etwas nichtumgesetzten Aminosäureester, Oligopeptide, Salze, Enzyme und dergleichen
enthält, gewonnen werden. Solche Verfahren schließen Dialyse, Lösungsmittelausfällung
und dergleichen ein. Zur Herstellung eines besonders befriedigenden Produktes wird
die Dialyse bevorzugt.
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Wählt man die Dialyse zur Gewinnung des Polypeptidproduktes so wird
das Reaktionsgemisch in einer starken Base, wie 0,1 m Natriumhydroxid in einer Dialysekammer,
wie einem Cellulose rohr, gelöst und gegen fließendes Wasser bei 50C dialysiert,
bis die nichtdiffundierbare Fraktion (als "Tenat " bezeichnet) einen pH von etwa
7,0 hat. Unter diesen Dialysebedingungen wird der Niedrlgalkylester hydrolysiert
und ergibt das L-Aminosäure-substituierte Polypeptid. Das Tenat kann, so wie es
ist, verwendet werden oder gewünschtenfalls gefriergetrocknet
oder
sprühgetrocknet werden mit Verdünnungsmitteln vermischt oder weiter gereinigt werden,
z.B.
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durch Dialyse oder Lösungsmittelausfällung. Das Tenat hat einen angenehmen
Geschmack und eine angenehme Farbe.
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Wählt man die Lösungsmittelausfällung, so wird die Reaktionsmischung
mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie etwa 80 bis 95 Vol.-% wäßrigen Äthanol,
dispergiert und vermischt, wobei das L-Aminosäure-substituierte Polypeptidprodukt
ausfällt. Das ausgefallene Produkt kann aus der Mischung einfach durch Zentrifugieren,
Ultrafiltration und dergleichen gewonnen werden. Das ausgefallene Produkt kann so
wie es ist verwendet werden oder gewünschtenfalls getrocknet, mit Verdünnungsmitteln
vermischt oder weiter gereinigt werden. Obwohl die Lösungsmittelausfällung weniger
zeitaufwendig ist als die Dialyse kann das Produkt einen etwas salzigen Geschmack
haben und geringe Mengen an freier Aminosäure enthalten.
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Die L-Aminosäure-substituierten Polypeptide gemäß der Erfindung sind
geeignet, um proteinhaltige Nahrungsmiftel mit einer ernähungsmäßig zusätzlichen
Menge des substituierten Polypeptids, bezogen auf die Aminosäuredefinzienz, zu verstärken.
Ernährungstechnische Informationen, die erforderlich sind, um die Höhe der Aminosäuredefizienz
zu ermitteln, sind frei erhältlich. Zum Beispiel ist eine Veröffentlichung von der
Food and Agricultural Organization der Vereinten Nationen mit dem Titel 1,Amino
Acid Content of Foods and Biological Data on Proteins", No. 24 (1970) erhältlich.
Die nährmittelmäßig wirksame Menge, die einem jeweiligen Nahrungsmittel zugegeben
wird, kann vom Fachmann, der das proteinhaltige Nahrungsmittel und dessen Aminosäuredefinzienz
und
die Verfügbarkeit von Aminosäuren kennt, einfach ermittelt
werden. Stammt z.B. das proteinhaltige Nahrungsmittel von Sojabohnen, so ist bekannt,
daß dieses Nahrungsmittel einen Mangel an Methionin hat. Um das Aminosäureprofil
zu verbessern, kann man ein L-Methionin-substituiertes Polypeptid, das gemäß der
Erfindung hergestellt wurde, diesem Nahrungsmittel in einer Menge von etwa 0,1 bis
2,0 Gew.-% an Methioninäquivalenz zugeben. Das Aminosäureäquivalent oder Methioninäquivalent
ist definiert als die Menge an Aminosäuresubstituiertem Polypeptid, die ernährungsmäßig
der freien Aminosäure äquivalent ist. Um das Aminosäureäquivalent zu berechnen,
wird unterstellt, daß das Aminosäure-substituierte Polypeptid vollständig für die
Ernährung zur Verfügung steht.
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Das substituierte Polypeptid gemäß der Erfindung kann einem Aminosäure-defizienten
Nahrungsmittel nach bekannten Verfahren, wie sie bei dem jeweiligen Nahrungsmittel
angewendet werden, zur Erzielunq eines verstärkten proteinhaltigen Nahrungsmittels
zugegeben werden. Zum Beispiel kann man das substituierte Polypeptid in Form eines
trockenen Pulvers, als wäßrige Dispersion oder zusammen mit-anderen Bestandteilen,
wie Geschmacksstoffen oder als Dispersion in einem inerten Träger zugeben. Aufgrund
seines angenehmen Geschmackes und der angenehmen Farbe kann das substituierte Polypeptid
ernährungsmäßig Nahrungsmitteln zugegeben werden, ohne deren angenehmen Geschmack
zu beeinflussen.
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Da die Ami. saÜrzdcf iz in: des Ausgangsproteiriniaterials wirksam
durch das erfindungsgemäße Verfahren geheilt werden kann, ist das L-Aminosäure-substutuierte
Polypeptid auch als Ersatz für ein Aminosäure-defizientes Nahrungsmittel geeignet.
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Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung ohne sie zu beschränken.
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BEISPIEL 1 In diesem Beispiel wird die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen
Verfahrens beschrieben.
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Man stellt eine wäßrige Mischung her, indem man 1000 g entfettetes
Sojamehl (Ajinimoto Proten-S, enthaltend 47,6 Gew.-t Protein) mit 1000 ml Wasser
anfeuchtet, und dann 71,4 g Natriumbicarbonat und 21,4 g Natriumcarbonat, gelöst
in 100 ml Wasser zugibt und darauf 119 g DL-Methioninäthylester*HCl in 230 ml Wasser
und anschließend 5,7 g Papain und 0,35 g L-Cystein in 100 ml Wasser zugibt. Die
Formulierung ergibt eine Proteinkonzentration von 22,4 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht
der Mischung, eine Enzymkonzentration von 1,19 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des
Proteins,und eine Aminosäureesterkonzentration von 25 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht
des Proteins. Die so bereitete wäßrige Mischung hatte einen Anfangs-pH von 9,0 und
wurde 24 Stunden bei 37 0C inkubiert. Zum Reaktionsprodukt wurden dann 1000 ml einer
0,1 n Natriumhydroxidlösung gegeben. Das alkalisch eingestellte Reaktionsprodukt
wurde in ein Dialyserohr (regenerierte Cellulose) gegen und gegen fließendes Wasser
von 5 0C 48 Stunden dialysiert. Die nichtdiffundierbare Fraktion mit einem pH von
etwa 7,0 wurde gefriergetrocknet, wobei man 833 g des gereinigten Produktes erhielt.
Das Produkt war hellgrau und angenehm im Geschmack und Farbe. Der Aminosäuregehalt
des Produktes wurde analysiert nach Hydrolyse mit 6 n HCl im Vakuum durch Ionenaustauschchromatographie
und mit einem in gleicher Weise hydrolysierten Sojamehlausgangsmaterial verglichen.
Das Ergebnis dieser Aminosäureanalyse
wird in der folgenden Tabelle
I gezeigt.
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TABELLE 1 Aminosäure- Sojamehl, wie Reaktionszusammensetzung eingesetzt,
Gew.-%* produkt,Gew.-% Lysin 6,46 5,17 Histidin 2,58 3,12 Arginin 8,12 7,01 Asparaginsäure
12,61 11,59 Threonin 4,70 3,21 Serin 5,25 4,47 Glutaminsäure 16,29 17,77 Prolin
4,54 2,33 Glycin 4,50 3,45 Alanin 4,16 3,73 Valin 3,04 4,47 Methionin 1,32 8,21
Isoleucin 5,06 5,28 Leucin 8,74 8,50 Tyrosin 4,11 3,56 Phenylalanin 5,36 5,43 %,
bezogen auf Proteingehalt Aus dem Vergleich der in Tabelle I gezeigten Aminosäureanalyse
wird ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist, um in das Endprodukt
6,89 Gew.-% Methionin, bezogen auf das Gesamtprotein ( N x 6,25) einzubauen. Dies
bedeutet ein 6-fache Erhöhung gegenüber dem Ausgangsmaterial der Menge an dieser
Aminosäure. Dieses Material wurde
dann einem proteinhaltigen Nahrungmittel
zur Verbesserung des Methioningehaltes zugegeben.
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BEISPIEL 2 In diesem Beispiel wird der Nährwert des L-Aminosäuresubstituierten
Polypeptidproduktes erläutert. Die folgenden Nahrungsmittelzusammensetzungen wurden
zur Bewertung des Verhältnisses an wirksamem Protein (PER) durch Ratten hergestellt:
Nahrungsmittelzusammensetzung Kasein Sojamehl Versuch g g : g Stickstoff- Kasein
Sojamehlg Mischung* quelle 10 21 20,-6 Protein aus der Quelle 10 10 10 Stärke 60
49 49,4 Saccharose 15 15 15 Cellulose 5 5 5 öl 5 5 5 Salzmischung 4 4 4 Vitaminmischung
0,85 0,85 0,85 Cholin'HC1 0,15 0,15 0,15 Ajinomoto Proten-S, entfettetes Sojamehl.
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Die Stickstoffquelle der Versuchsdiät ist eine Mischung, enthaltend
16,5 g entfettetes Sojamehl und 4,1 des iIa Beispiel 1 hergestellten L-Methionin-substltuierten
Polypeptids. Die Gesantmenge an Protein in der Mischung entspricht 10 g und das
Methioninniveau in der Mischung ist gleich 2,7 Gew.-%, bezogen auf den Proteingehalt.
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Männliche Ratten mit einem Anfangsdurchschnittsgewicht von 50 g erhielten
während 20 Tagen eine der oben erwähnten Nahrungsmittel zusammensetzungen. Für jede
Zusammensetzung wurden 5 Ratten verwendet. Die nachfolgenden Daten beziehen sich
auf die Gewichtszunahme und die Stickstoffaufnahme während des 20-tägigen Versuchs
bei 200C.
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Nahrungsmittelzusammensetzung PER (mittlere und Standarabweichung)
Kasein 2,38 + 0,12 Sojamehl 1,15 + 0,31 Versuchsbeispiel 3,03 ~ 0,25 Die obigen
Daten zeigen die Ernähungsäquivalente zwischen der Versuchsprobe und dem Standardkontrollkasein
und zeigen auch den Vorteil der Anreicherung bzw. Verstärkung eines ernährungsmäßig
defizienten Nahrungsmittels, d.h. Sojamehl, durch eine ernährungsmäßig wirksame
Menge eines erfindungsgemäßen L-Aminosäure-substituierten Polypeptidproduktes.
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Die PER-Werte für die Kaseindiät und die Versuchdiät unterscheiden
sich erheblich von der Sojamehldiät beim 95 % Vertrauensniveau (confidence level).
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BEISPIEL 3 Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von verschiedenen
L-Aminosäure-substituierten Polypeptiden.
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Man stellte die folgenden Ausgangsprodukte her: Sojaproteinisolat
(Fujipro R, Fuji Oil Mills Co.) wurde mit 0,1 n NaOH denaturalisiert und dialysiert
(regenerierte Cellulose) gegen fließendes Wasser bis das Tenat neutral war (pH 7,0).
Das Tenat wurde dann gefriergetrocknet.
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Die Äthylester von Aminosäuren: L- & - Aminobuttersäure, L-Norvalin,
L-Norleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylanalin und L-Tyroptophan wurden nach dem
von Boissonas und Mitarbeitern beschriebenen Verfahren (Helv. Chim.
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Acta, 39, 1421 (1956) hergestellt.
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Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde in gleicher Weise wiederholt
und es wurden 7 Reaktionssysteme hergestellt, von denen jedes 200 mg Sojaproteinisolat
(gefriergetrocknetes Tenat, wie vorher hergestellt), 100 fMol Aminosäureäthylester
(ausgewählt aus den wie oben erwähnt zubereiteten),2 mg Papain, 2 mMol L-Cystein
und 1,0 ml 1 m Carbonatpuffer zur pH-Einstellung auf 9,0 hergestellt.
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Jedes der so hergestellten wäßrigen Reaktionssysteme wurde 2 Stunden
bei 370C inkubiert. Die Produkte wurden isoliert, gereinigt und die Aminosäuregehalte
wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise analysiert. Es wurde festgestellt,
daß jede der Aminosäuren in das Protein eingebaut worden war. Die eingebaute Menge
variierte zwischen 0,05 und 0,14/uMol Aminosäure/mg Papain/Minute und stand in direkter
Beziehung zu der Hydrophobizität der Aminosäure.