DE2821472A1

DE2821472A1 - Reaktionserfassung durch phosphoreszenzmessung

Info

Publication number: DE2821472A1
Application number: DE19782821472
Authority: DE
Inventors: Hans T Noeller
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-05-11
Filing date: 1978-05-11
Publication date: 1979-11-15

Description

Reaktionserfassung durch Phosphoreszenzmessung.
Praeambel Chemische Reaktionen sind in der Regel mit der Freisetzung oder Absorption von Energie verbunden.
Die Freisetzung von Energie in Form von Wärme unter dem Einfluß einer Umsetzung ist be: eits seit dem Altertum bekannt. Bei vielen Reaktionen wird Energie auch oder ausschließlich in anderer Form, etwa in Form von Licht, frei.
Lichtenergie kann heute auf einfache Weise, z.B.
durch Anwendung eines Photonenvervielfachers, mit höchstmöglicher Empfindlichkeit nachgewiesen und gemessen werden. Der Photonenvervielfacher erlaubt sogar die Erfassung von einzelnen Photonen, von Lichtquanten.
In der Enzymologie und in der Immunologie, sowie auch in der analytischen Chemie, besteht oft das Bestreben, noch minimale Substanzmengen quantitativ zu ermitteln.
Enzyme lassen sich mit guter Empfindlichkeit quantitativ durch Farbreaktionen erfassen, und die Bindung von Enzymen an Immunosubstanzen, vorwiegend an Antikörper, wird oft zur quantitativen Bestimmung von Immunosubstanzen mittels einer einfachen Farbreaktion genutzt, unter Umgehung der sonst üblichen Markierung von Immunostoffen mit radioaktiven Isotopen.
Gegenstand der Erfindung Gegenstand der Erfindung ist die qualitative und die quantitative Erfassung von chemischen Reaktionen durch Messung der bei diesen freiwerdenden Lichtmenge, unter Verwendung von höchstempfindlichen Lichtsensoren, vorzugsweise von Photonenvervielfachern.
Anwendungsbeispiel a.) Einführung und Methodik Eine der ersten praktischen Anwendungen erfuhr das Verfahren für den qualitativen Nachweis und für die quantitative Ermittlung von HEPATITIS BAntigen.
Die Bestimmung der HEPATITIS B-Antigen=Konzentration im Blut spielt - nicht nur bei Blutspendern - eine sehr große Rolle; sie wird in der Regel mittels des HEPATITIS B-Radio-Immuno-Assay's (RIA) durchgeführt.
Tests mit enzymgekoppelten Immunostoffen lösen heute mehr und mehr die Radio-Immuno-Assay's für die HEPATITIS B-Diagnostik ab, selbst unter Inkaufnahme der bei der colorimetrischen Auswerttechnik auftretenden Empfindlichkeitsverluste.
Bei meinen Untersuchengen stellte ich fest, daß die Einwirkung der alkalischen Phosphatase, die in der Immunologie auch zur Kopplung mit dem Antikörper gegen das HEPATITIS B-Antigen verwendet wird, bei der Umsetzung des Substrats nicht nur eine Farbänderung, sondern darüber hinaus auch eine ganz beträchtliche Lichterzeugung,veranlasst.
Entsprechend führte ich die Ermittlung des HEPATITIS B-Antigens im Blutplasma mittels des Enzym-Immuno-Assay's, bei dem alkalische Phosphatase an den HEPATITIS B-Antikörper gekoppelt ist, durch, unter Messung der durch die gebundene Phosphatase freisetzbaren Lichtmenge, statt der hier/erzielbaren Farbänderung.
Die Reaktion wurde gemäß der heute üblichen Non-Isotopen-HEPADITIS H-lestmethodik durchgeführt, bei der statt des radioaktiven Markierungsstoffes ein Enzym, und zwar im vorliegenden Falle alkalische Phosphatase, zur Markierung an den - ursprünglich nicht an die Festphase fixierten - HEPATITIS B-Antikörper gebunden ist. Die Reaktion verläuft bei diesem Test -wie bei den meisten HE-l'ADITIS B-Immuno-Assay's -nach dem Sandwich-Prinzip, bei dem eine Xrägerfläche mit HEPATITIS B-Antikörpermolekülen belegt ist. Diese Antikörpermoleküle erden im Verlauf der Reaktion als Ankerpunkte für die in der zu untersuchenden Probe enthaltenen Antigenmoleküle genutzt;hernach werden an diese Antigenmoleküle proportional ihrer Menge mit alkalischer Phosphatase konjugierte HEPATITIS B-Antikörpermoleküle aus einer im Überschuss zugegebenen Lösung angelagert.
Nach Abspülen der Festphase, durch das die nicht durch Antigen fest an die Trägerfläche gebundenen, enzymmarkierten Antikörpermoleküle beseitigt werden, erfolgt der Zusatz des Substrates (p-Nitrophenylphosphat) und - zwecks Ablösung von der Festphase -von Natronlauge (1n NaOh) bei konstanter Temperatur.
Sogleich nach dem Zusatz wurden im vorliegenden Falle die 1essungen vorgenommen, mittels Photonenvervielfachers mit nachfolgendem Registriergerät.
Ein Szintillationszähler, wie er in der Isotopenmeßtechnik üblich ist, bietet sich für diesen Zweck an. Es ist vorteilhaft, statt einer einzigen Messung mehrere Messungen in bestimmten Zeitabständen nacheinander durchzuführen.
Für meine ersten Untersuchungen wurden folgende Blutplasmasamples herangezogen: a.) von einer gesunden Testperson, bei der mit dem RIA ein Wert von 442 counts per minute (cpm) gemessen worden war, und b.) von einem Patienten, bei dem mit dem HEPATITIS B-RIA ein ganz schwach positiver Wert von 623 cpm ermittelt war.
(Der Wendepunkt vom negativen zum positiven Ergebnis war beim gleichen RIA vorangehend - entsprechend dem 2,1-fachen setzt des Durchschnitts der negativen Kontrollen - auf 598 cpm festgelegt worden.) Jeweils 0,5 ml Blutplasma wurde entsprechend der auch sonst für den Enzymtest üblichen Vorschrift für die Reaktion verwendet.
Die Messungen erfassten jeweils die Anzahl der vom Photonenvervielfacher aufgenommenen Photonen 1.) während der Zeitspanne von 0 sec bis 70 sec.
2.) " " 31 " 60 " 3.) II " 61 " 90 " 4. " " 91 " 120 " b. Ergebnisse Die Messwerte waren wie folgt: Zeitspanne gesunde Testpers. HEPAtITIS-Träger 1.) 0 - 30 45 782 172 010 2.) 31 - 60 11 487 45 621 3.) 61 - 90 7 793 30 111 4.) 91 120 6 096- 23 201 Auf semilogarithmisches Papier aufgetragen ergab sich in beiden Fällen eine Gerade; der Neigungswinkel war etwa der gleiche, wohl aber wies die vom Patienten gewonnene Gerade zu jedem Zeitpunkt einen beträchtlich höheren tfert auf als diejenige, die sich vom Plasmasample der gesunden Versuchsperson herleitete.
Vorteile.
Das vorliegende Verfahren ist bei extrem hoher Empfindlichkeit mit keiner der mit der Radioisotopentechnik verbundenen, aktinischen Gefahren behaftet, Darüber hinaus sind die zur Reaktion notwendigen Chemikalien bei entsprechender Lagerungstemperaturberücksichtigung über viele Monate hin lagerfähig, also nicht den halbwertszeitbedingten Gebrauchs einschränkungen unterworfen.
Die Empfindlichkeit übersteigt erheblich die bei der gleichen Enzymmarkierung durch Auswertung der Farbe änderung - statt der Lichtausbeute - ermittelte Größe.
Der Test ist einfach, ohne großen personellen Aufwand und unter Nutzung der bisher für die altherkömmliche RIA-Technik eingesetzten Szintillationszähler durchführbar.

Claims

Ansprüche 1.) Verfahren zur qualitativen und quantitativen Ermittlung der in einem Reaktionsgemisch zustandekommenden Umsetzung, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Reaktion einhergehende Lichterzeugung erfaßt wird.
2.) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die bei einer Umsetzung eines Sarkierun-sstoffes freiwerdende Lichtmenge zur Ermittlung der Menge der Trägersubstanz, mit der die Markierungssubstanz konjugiert-verbunden-ist, herangezogen wird.
3.) Verfahren nach Anspruch 1 - 2, bei dem zur Erfassung der umsatzabhängigen Lichterzeugung ein fhotonenvervielfacher herangezogen wird.
4.) Verfahren nach Anspruch 1 - 3, bei dem durch Filterung eine bestimmte Wellenlänge des erzeugten Lichtes ausgesiebt wird.
5.) Verfahren nach Anspruch 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Ermittlung von Oxydationsprozessen herangezogen wird.
6.) Verfahren nach Anspruch 1 - 5, charakterisiert durch seine Anwendung zur Erfassung von enzymatisch gesteuerten Reaktionen, insbesondere von Reaktionen, die durch alkalische Phosphatase beeinflusst werden.
7.) Verfahren nach Anspruch 1 - 6, charakterisiert durch seine Anwendung zur Auswertung von Immunoreaktionen.
8.) Verfahren nach Anspruch 1 - 7, bei dem Immunostoffe mit Enzymen, vorzugsweise mit alkalischer Phosphatase, gekoppelt sind, und bei dem eine von der alkalischen Phosphatase abhängige chemische Umsetzung, etwa die Umsetzung eines Substrates, qualitativ oder quantitativ erfasst wird.
9.) Verfahren nach Anspruch 1 - 8, bei dem der zeitliche Verlauf der Lichtabgabe zu Rückschlüssen auf Art und enge eines oder mehrerer Reaktionsteilnehmer genutzt wird.
10.) Verfahren nach Anspruch 1 - 9, bei dem der Gehalt eines Antikörpers oder eines Antigens, vorzugsweise des HEPATITIS P-Antigens, im zu untersuchenden Material bestimmt wird.
li.) Verfahren nach Anspruch 1 - 10, bei dem ein Szintillationszähler zur Erfassung herangezogen wird.
12.) Verfahren nach Anspruch 1 - 11, bei dem der pH-rMert im Reaktionsgemisch derart eingestellt ist, daß gezielt eine einzige Umsetzung, etwa eine durch Einwirkung der alkalischen Phosphatase beeinflusste Reaktion, selektiv ausgewertet werden kann.