DE2820071A1

DE2820071A1 - Verfahren zur bestimmung von bakterien und bakterienantikoerpern

Info

Publication number: DE2820071A1
Application number: DE19782820071
Authority: DE
Inventors: Henry Zvi Markus; William Joseph Mcaleer
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1977-05-09
Filing date: 1978-05-08
Publication date: 1978-11-23
Also published as: IT1117351B; IT7849223A0; JPS542318A; FR2390502A1; PT67981B; GB1604884A; NL7804410A; ES469586A1; BE866664A; BR7802880A; CA1109790A; PT67981A

Description

DR.-ING. WALTER ΑΒΓΓΖ

DR. DIETER F. MORF ^

DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER

Patentanwälte

München,

8. Mai 1978

Postanschrift / Postal Address Postfach 8ΘΟ109, 8OOO München 86

Fienzenauerstrafle 28

Telefon 88 38 23

Telegramme: Chemtadus München

Telex: CO} S 23993

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MERCK & CO., INC. Eanway, Few Jersey 07065

Verfahren zur Bestimmung von Bakterien und Bakterienantikörpern

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Die Erfindung betrifft 1) einen automatisierten Test zur Bestimmung des Antikörpertiters einer Probe, indem in einer Mikrotiterplatte ein Gemisch, das eine Testprobe, die Bakterien, deren Antikörper in der Probe bestimmt werden sol],, und Komplement enthält,inkubiert und das bakterielle Wachstum im inkubierten Gemisch gemessen wird, und 2) einen automatisierten Test zur Bestimmung der Identität und der ursprünglichen Konzentration von Bakterien in einer Probe, indem in einer Mikrotiterplatte ein Gemisch, das eine Testprobe, bakterielles Antiserum, Komplement und Wachstumsmedium enthält, inkubiert und die Hemmung des bakteriellen Wachstums gemessen wird.

Somit wird erfindungsgemäss ein automatisiertes Verfahren zur Messung des Antikörpertiters in biologischen Proben, wie Serum, Plasma, Blutfraktionen, Γ-Globulin und dergl., zur Verfügung gestellt. Die Probe wird mit Kaninchenkomplement, vorzugsweise Komplement von neugeborenen Kaninchen bis zu einem Alter von etwa 4- Wochen, und mit den Bakterien, deren Antikörpergehalt in der Probe bestimmt werden soll, vermischt. Nach kurzzeitiger Inkubation des Gemisches, beispielsweise etwa 30 bis etwa 50 Minuten, wird Brühe zugesetzt, worauf das Gemisch etwa 15 "bis etwa 30 Stunden, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 24- Stunden bei etwa 37°C i*ikubiert wird.

Ferner wird erfindungsgemäss ein automatisiertes Verfahren zur Bestimmung der Identität und der ursprünglichen Konzentration von Bakterien in biologischen Proben der vorge- -■ nannten Art zur Verfügung gestellt. Dabei wird die Probe mit Antiseren für die Bakterien, deren Identität bestimmt werden soll, Wachstumsmedium und Komplement versetzt. Nach

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kurzzeitiger Inkubation des Gemisches, beispielsweise 30 bis etwa 50 Minuten, wird Brühe zugesetzt und das Gemisch etwa 15 bis etwa 30 Stunden, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 24· Stunden, bei etwa 37⁰C inkubiert.

Das erfindüngsgemässe automatisierte Bestimmungsverfahren eignet sich zur Antikörper- oder BakterienbeStimmung für alle gram-negative Bakterien. Besonders geeignet ist es zur Bestimmung von Antikörpern gegenüber pathogenen Mikroorganismen, wie N. meningitidis, Salmonella, ITeisseria gonorrhea, Hemophilus influenza, E. coli und dergl.,bzw. zur Bestimmung derartiger pathogener Mikroorganismen selbst.

Die Bestimmung wird unter Verwendung von üblichen Bestimmungsplatten mit 96 Vertiefungen (Bohrungen),automatischen Pipettiervorrichtungen und automatischen Verdünnungsvorrichtungen durchgeführt. Das auf diese Weise automatisierte Verfahren benötigt im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren geringere Mengen an Reagentien und ist schneller und genauer durchführbar. Die Kosten für das Verfahren sind im Vergleich zur bisher angewendeten manuellen Methode wesentlich geringer, während die Genauigkeit erhöht ist.

Das erfindüngsgemässe Verfahren lässt sich zweckmässigerweise mit einem Diagnose-Testreagens (Testpackung) durchführen, das für die bakterielle Bestimmung lyophilisierte Proben von Antikörpern gegenüber gram-negativen Bakterien, wie Antikörper gegen E. coli, S. typhi, IT. meningitidis Stämme A und C, H. influenza und N. gonorrhea, enthält. Komplement kann entweder als Teil des Testreagens vorhanden sein oder vom Verwender des Testreagens eingesetzt werden. Ein derartiges Testreagens wird zur Bestimmung der Identität der vorerwähnten Bakterien in klinischen Proben verwendet.

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Dieser Test hat den. Vorteil, dass nicht-spezifische Effekte ausgeschlossen werden.

Zur Antikörperbestimmung wird das erfindungsgemässe Verfahren zweckmässigerweise mit einem diagnostischen Testreagens (Testpackung) durchgeführt, das lyophilisierte Proben von gram-negativen Bakterien, wie E. coli, S. typhi, N. meningitidis Stämme A und C, H. influenza und U. gonorrhea, enthält, durchgeführt. Auch hier kann Komplement entweder ein Bestandteil des Testreagens sein oder vom Verwender des Testreagens zur Verfügung gestellt werden. Auch dieser Test hat den Vorteil, dass nicht-spezifische Effekte ausgeschaltet werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Gefrorene Serumproben werden in kaltem Leitungswasser rasch aufgetaut. Die Seren werden durch 30-minütiges Erwärmen auf 56⁰C inaktiviert und bis zur Bestimmung in Eiswasser stehengelassen. Jeweils 25 ,ul der zu untersuchenden, hitzeinaktivierten Seren werden mit sterilen Pipettenspitzen in 12 Vertiefungen in der Reihe 1 von Mikrotiterplatten (Cooke Laboratory Products) gebracht. Dabei handelt es sich um sterile, starre Einweg-Polystyrolplatten mit U-förmigen Vertiefungen (Bohrungen). Je nach der gewünschten Genauigkeit werden 8 bis 96 Vertiefungen/Proben verwendet. Jede Platte wird in eine automatische Pipettiervorrichtung (Cooke Laboratory Products) gebracht. Jede der 96 Vertiefungen wird mit 0,025 ml steriler, ausgeglichener Salzlösung (Grand Island Biological Co.) und 0,1 Prozent Rinderserumalbumin versetzt. Die Platte wird sodann in eine automatische Verdünnungsvorrichtung (Cooke Laboratory Products) gebracht,

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die gemäss den Anweisungen des Herstellers bedient wird. Dies ergibt 2-fache Verdünnungen bei Verwendung des 0,025 ml-Verdünners. Unter Verwendung eines frischen Einweg-Tabletts werden die einzelnen Bohrungen mit 0,025 ml frischer Bakterienkultur von Heisseria meningitidis versetzt. Dieses Präparat muss etwa 15 bis 30 frische, lebende Organismen/0,025 ml enthalten. Die Platten werden nach · Zusatz der Bakterien20-30 Sekunden geschüttelt. Sodann werden die Vertiefungen mit einer automatischen Pipettiervorrichtung mit jeweils 0,025 ml Komplement von neugeborenen Kaninchen versetzt. Die Platten werden wieder bis 30 Sekunden geschüttelt und sodann 40 Minuten bei 37°C in einem mit Wasser gesättigten Inkubator inkubiert. Am Ende dieser Inkubationszeit werden die einzelnen Vertiefungen mit jeweils 0,125 ml Mueller-Hinton-Brühe (Difco) unter Verwendung der automatischen Pipettiervorrichtung versetzt. Diese Stufe muss mit eine neuen sterilen Kopf und einem neuen Einweg-Kunststoffbehälter durchgeführt werden. Die Platten werden über Nacht (20 bis 24 Stunden) bei 37⁰C in einem angefeuchteten 5 Prozent CO2,enthaltenden Inkubator inkubiert. Vertiefungen ohne bakterielles Wachstum werden als negativ und solche mit bakteriellem Wachstum als positiv gekennzeichnet. Die Verwendung eines Testablesespiegels (Cooke) erleichtert das Ablesen der Platten. Bei jedem Test werden die nachstehenden Kontrollen durchgeführt: Anzahl der Bakterien in 0,025 ml infizierender Flüssigkeit, Kontrolle des Serums, Kontrolle des Komplements der neugeborenen Kaninchen, Kontrolle des inaktivierten Komplements von neugeborenen Kaninchen,' Organismenkontrolle und Vergleichsseren.

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	Automatisch er	nachher	Manuell mit	Petrischalen
	mittelter Titer	64	ermittelter	Tit er
Probe	vorher	2048	vorher	nachher
1	8	2048	16	128
2	64	256	64	1024 "
3	32	4096	32	512
4	2	256	2	256
5	128	128	32	512
6	8	512	8	256
7	4	2	2	256
8	32	16	256
Bei	spiel

In der nachstehenden Tabelle sind die Schwankungen der Bestimmung als Funktion der Bestimmungen pro Probe zusammengestellt.

Probenanzahl 1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

95 %iger Vertrauensbereich für mittl, log; Potenz

+ 0,692 + 0,489

+ 0,399 + 0,346

+ 0,309 + 0,282 + 0,262 + 0,245 + 0,231

+ 0,219

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Beispiel 3 Testreagens für Antikörper

Eine klinische Serumprobe, die auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen E. coli, S. typhi, N. meningitidis Stämme A und C, H'. influenza und N. gonorrhea untersucht werden soll, wird 30 Minuten bei 56°C hitzeinaktiviert. 25 ;u.l des inaktivierten Serums werden mit sterilen Pipettenspitzen in jede zweite Vertiefung der Reihe A von Mikrotiterplatten (Cooke Laboratory Products) gegeben. In die restlichen Vertiefungen der Reihe A werden jeweils 25 ^uI sterile, ausgeglichene Salzlösung (Grand Island Biologicals) gegeben. Die Platten werden in die automatische Pipettiervorrichtung gebracht. In jede der 96 Vertiefungen werden 25 ,ul sterile ausgeglichene Salzlösung mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Rinderserumalbumin gegeben. Die Platten werden sodann in die automatische Verdünnungsvorrichtung gebracht, die nach den Angaben des Herstellers bedient wird. Es werden 2-fache Verdünnungen angewendet. 25 ,ul einer rekonstituierten lyophilisierten Bakterienkultur von E. coli werden mit sterilen Pipettenspitzen in sämtliche Vertiefungen der Reihen 1 und 2 gegeben. Die Reihe 1 enthält das Serum. Die Reihe 2 dient als Kontrolle für das Bakterienwachstum. In die Reihen 3 und 4 wird S. typhi und in die Reihen 5 und 6 N. meningitidis A gegeben. Die Bakterienpräparate enthalten 15 bis 30 frische, lebende Organismen/25/il. Sie werden in lyophilisiertem Zustand als Teil des Testreagens zugeführt und enthalten nach Rekonstitution die erforderliche Bakterienmenge. Anschliessend werden 25 ^uI Komplement von neugeborenen Kaninchen mit einer automatischen Pipettiervorrichtung in die einzelnen Vertiefungen gegeben. Die Platten werden sodann 20 bis 30 Sekunden geschüttelt und 40 Minuten bei 37°C i*¹ einem mit Wasser gesättigten Inkubator inkubiert. Sodann werden 125,ul Mueller-Hinton-Brühe mit der automatischen Pipettier-

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Vorrichtung in die Vertiefungen gegeben. Diese Stufe muss mit einem neuen sterilen Kopf und einem neuen Einweg-Kunststoffbehälter durchgeführt werden. Die Platten werden über Nacht inkubiert (20 bis 24- Stunden in einem angefeuchteten Inkubator mit 5 Prozent CO- bei 37⁰C). Wenn eine Serumprobe das Bakterienwachstum hemmt, werden Identität und Titer davon bestimmt.

Beispiel K
Testreagens für Bakterien

25 Ul einer Serumprobe werden auf die Anwesenheit der nachstehenden Bakterien untersucht: E. CoIi, S. typhi, N. meningitidis A und C, H. influenza und N. gonorrhea werden mit sterilen Pipettenspitzen in die Vertiefungen der Reihe A von Mikrotiterplatten gegeben. Anschliessend werden 25 ^l Vergleichsantiseren für die untersuchten Bakterien in jede zweite Vertiefung von Reihe A gegeben. In die Vertiefung A2 wird das Antiserum gegen E. coli, in die Vertiefung A4- gegen S. typhi usw. gegeben. Diese Antiseren sind Teil des Testreagens und werden in lyophilisiertem Zustand zugeführt. Die einzelnen Platten werden in die automatische Pipettiervorrichtung gebracht und mit 25 ^l/Vertiefung steriler, ausgeglichener Salzlösung mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Rinderserumalbumin versetzt. Die Platte wird sodann in die automatische Verdünnungsvorrichtung gebracht. Es werden 2-fache Verdünnungen vorgenommen. Anschliessend werden 25 ,nl Komplement von neugeborenen Kaninchen mit einer automatischen Pipettiervorrichtung zugesetzt. Anschliessend werden die Platten 20 bis 30 Sekunden geschüttelt und 40 Minuten bei 37°C in einem mit Wasser gesättigten Inkubator inkubiert. Sodann werden 125 JiI Mueller-Hinton-Brühe mit der automatischen Pipettiervorrichtung in die einzelnen Bohrlöcher gegeben.

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Die Platten werden über Nacht inkubiert (20 bis 24- Stunden in einem angefeuchteten Inkubator mit 5 Prozent CO- bei 37°C). Wenn Proben von Vergleichsseren das bakterielle Wachstum hemmen, dient dies dazu, um die Identität und die anfängliche Konzentration der in den zu untersuchenden Seren enthaltenen Bakterien festzustellen.

Ende der Beschreibung

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Antikörpern gegenüber gram-negativen Bakterien in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mehrzahl von serienmässig verdünnten Lösungen in den Vertiefungen (Bohrungen) einer Bestimmungsplatte, in denen Probe, Bakterien, Komplement und Wachstumsmedien enthalten sind, inkubiert, die Inkubation für eine das bakterielle Wachstum ermöglichende Zeitdauer fortsetzt und das Ausmass des bakteriellen Wachstums in den einzelnen Vertiefungen der BeStimmungsplatte misst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst etwa 30 bis etwa 50 Minuten bei etwa 37°C in einer wassergesättigten Atmosphäre und anschliessend 15 bis etwa 30 Stunden bei etwa 37°C in einem angefeuchteten, 5 Prozent Kohlendioxid enthaltenden Inkubator inkubiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man zwischen der ersten und zweiten Inkubation Brühe in die Vertiefungen der Bestimmungsplatte gibt.

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4·. Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Antikörpern gegenüber gram-negativen Bakterien in einer Probe, wobei die Antikörper aus einer vorbestimmten Gruppe von Antikörpern ausgewählt sind, dadurch gekennzeichnet, dass man in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eine Mehrzahl

von Gemischen mit bakteriellem Wachstum, die jeweils eine Testprobe, Bakterien und Komplement enthalten, inkubiert, wobei jede Vertiefung nur eine Spezies von Bakterien enthält und mindestens in einigen Vertiefungen Bakterien enthalten sind, die dem zu identifizierenden Antikörper entsprechen, und eine Hemmung des bakteriellen Wachstums feststellt.

5. Testreagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Mehrzahl von ausgewählten, lyöphilisierten, gram-negativen Bakterien enthält.

6. Testreagens nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass es als lyophilisierte gram-negative Bakterien E. coli,

S. typhi, Έ. meningitidis, H. influenza und IT. gonorrhea enthält.

7. Testreagens nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Komplement enthält.

8. Verfahren zur Bestimmung der Identität von gram-negativen Bakterien in einer Probe, wobei die Bakterien aus einer vorbestimmten Gruppe von Bakterien ausgewählt sind, dadurch gekennzeichnet, dass man in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eine Mehrzahl von Gemischen mit bakteriellem Wachstum inkubiert, wobei die einzelnen Gemische jeweils eine Testprobe, Antikörper und Komplement enthalten, in jeder Vertiefung nur ein Antikörper vorhanden ist und

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mindestens einige der Vertiefungen Antikörper, die den zu identifizierenden gram-negativen Bakterien entsprechen, enthalten.

9. Testreagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mehrzahl von ausgewählten, lyophilisierten Antikörpern enthalten ist.

10. Testreagens nach Anspruch 9? dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählten, lyophilisierten Antikörper Antikörper gegen E. coli, S. typhi, N. Meningitidis, H. influenza und N. gonorrhea enthalten.

11. Testreagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es auch Komplement enthält.

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