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Nichtenzymatischer Phosphoreszenz-Immuno-Assay
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PraeambeI Während meiner Tätigkeit an der Duke Universität im Sommer
1976 hatte ich ausführliche Gelegenheit, mich mit elektrooptischen Immuno-Assays
auseinanderzusetzen.
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Einer der Immuno-Assays aus dieser Gruppe, der vorwiegend zur HEPATITIS
B-Bestimmung in Serum und Plasma eingesetzt wurde und wird, und der auf Grund seiner
extrem hohen Empfindoichkeit in der Lage ist, den Radio-Immuno-Assay (RIA.) bei
der HEPATITIS B-Diagnostik abzulösen, ist der Puls-Elouro-Immuno-Assay entsprechend
den Patentanmeldungen P 25 23 209.1 und P 26 07 149.8 Neben diesem Test habe ich
mich besonders mit Phosphoreszenzmessungen auseinandergesetzt und dabei einen Phosphoreszen£-Immuno-Assay
höchster Empfindlichkeit entwickelt, der geeignet ist, die verschiedensten immunodiagnostischen
Aufgaben des klinischen und des serologischen Labors mit extrem hoher Empfindlichkeit
schnell, präzise und kostensparend zu lösen.
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P-hosphoreßzenz ist das Nachleuchten von chemischen Substanzen über
eine Zeitspanne von mehr als 10-4 4 Sekunden nach deren Anregung a.) durch Licht
(Photoluminessenz), b.)! durch elektrische Einwirkung (Elektrolumineszenz) oder/und
c.X durch chemische Einwirkung (Chemilumineszenz).
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Gegenstand der Erfindung.
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Beim Verfahren entsprechend der vorliegenden Anmeldung wird unter
Umgehung der enzymatischen Technik eine Immunosubstanz, beispielsweise ein Antikörper,
mit einem phosphoreszenten chemischen Stoff gekoppelt und dann in beim Immuno-Assay
üblicher Weise in die Immunoreaktion verwickelt.
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Nach Trennung des durch die Immunoreaktion gebundenen phosphoreszent
markierten Reaktionspartners vom ungebunden gebliebenen markierten Immunostoffanteil,
- die eXakt entsprechend den in der Immunolegse UblidEen Routinetechilken erfolgen
kann -, wird entweder-(einfacher und ergiebiger) der gebundene markierte Reaktionspartner
oder aber der ungebundene Anteil des markierten Immunostoffes a.) durch Licht, b.)
durch chemische Einwirkung oder aber c.) durch elektrische Einwirkung zur Photonenabgabe
veranlasst und die Grösse der Lichtabgabe gemessen. Die pro Zeiteinheit abgegebene
Lichtmenge ist von der Menge des markierten Immunostoffes abhängig und erlaubt somit
auf einfache Weise eine quantita@tive Erfassung der durch die Immunoreaktion
gebundenen und der gebundenegebliebenen Menge des markierten Immunostoffes und mithin
auch eine Erfassung der Menge des eingesetzten zu bestimmenden Immunostoffes.
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Da hochempfindliche Lichtsensoren sogar in der Lage sind, noch einzelne
Photonen und somit auch phosphoreszierende Einzelmoleküle zu erfassen, läßt sich
die EmFfindlichkeit des Verfahrens - falls erwünscht -sogar weit über die Grenzen
der in der Praxis angestrebten Größenordnung hinaus steigern.
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Als Lichtsensoren eignen sich besondere gut Photonenvervielfacher,
wie sie in Szintillationszählern für die Radioisotopentechnik enthalten sind.
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Die Photonenausbeute, die nach der chemischen Anregung des phosphoreszierenden
Stoffes einsetzt, steht in logarithmischer Beziehung zur Menge des phosphoreszenten
Stoffes und nimmt logarithmisch mit der Zeit ab.
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Bei Anwendung eines Szintillationszählers zur Auswertung ergibt sich
somit bei Durchführung mehrerer - etwa zweier - nacheinander, beispielsweise in
Minutenabstand voneinander durchgeführter, Messungen bei Auftragung der Meßpunkte
auf doppelt-logarithmisches Papier eine gerade Linie, anhand derer die Lichtausbeute
auf jeden beliebigen Zeitpunkt bezogen werden kann.
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Die Abhängigkeit der Lichtausbeute von der Anwesenheit von Spurenelementen
- ein Nachteil von Phosphoeszenzbestimmungen - kann einfach durch Zusatz einer Lösung
von Spurenelementen in ausgewogener Menge oder im Überschuß behoben werden. Durch
eine in starkem Überschuß zugesetzte entsprechende Substanz, etwa ein bestimmtes
Metall, läßt sich die Lichtausbeute pro Gewichtseinheit des Phosphoreszenzstoffes
auf einfache Weise weitgehend bis völlig konstanthalten. Die Lichtausbeute wird
hierdurch streng abhängig von der Menge des phosphoreszenten Markierungsstoffes
in der Analyseflüssigkeit und damit von der Konzentration des zu bestimmenden Immunostoffes
in der zu untersuchenden biologischen Probe.
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Eine größere Zahl von phosphoreszenten Substanzen ist zur D;tarkierung
von Immunosubstanzen geeignet. Die Konjugierung, d.h. die chemische Kopplung dieser
Markierungsstoffe an die Immunosubstanzen, kann in der Regel mit der in der Immunofluoreszenztechnik
üblichen Methodik durchgeführt werden. Einige in der Immunofluoreszenztechnik verwendete
und teilweise sogar an verschiedene Antikörper konjugiert kommerziell erhältliche
Lumineszenzstoffe besitzen in stark alkalischer Lösung chemiphosphoreszente Eigenschaften;
sie können also, wie sich bei meinen Untersuchungen ergab, auch mühelos mit großer
Photonenausbeute für chemilumineszente Phosphoreszenz-Immuno-Assays eingesetzt werden.
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Eigene bei mehreren tausend Immunophosphoreszenztests erworbene Erfahrungen
erstrecken sich vor allem auf 1.) Bis-N-Methyl-Akridin-Nitrat, 2.) 5-Amino-Phthalhydrazid
und 3.) Akridin-hydrochlorid und deren Derivate.
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Anwendungsbeispiel HEPATITIS B-Bestimmung mit dem Doppelaltikörpertest
unter Verwendung von Hia-N-Methyl-Akridin-Nitrat= konjugiertem Ziegen Antikörper
gegen Kaninchen= Gamma=Globulin 1.) Auftragung von je 100 4 zu untersuchenden Blutplasmas
a.) von einer Normalperson mit negativem HEPAEIXIS B-RIA ( 337 counts pro Minute
(cpm) bei einem negativen Durchschnittswert der Kontrollen von 352 cpm und entsprechend
einem"cut-off-point" von 739 cpm) und b.) von einem Patienten mit ganz schwach positiven
HEPATITIS B-RIA (798 cpm) auf eine je 25 x 75 mm große Fläche eines Nylongewebes
(140 mesh) und anschließende Eintrockung.
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2.) Fixierung für 5 Minuten in Azeton und anschließende Trocknung.
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3.) Inkubation für 30 Minuten bei 200 C in einer Lösung folgender
Zusammensetzung 250 ul Kaninchen Anti-HEPATITIS B-Serum, mit 0,01 m Tris-Pufferlösung,
pH # 6,5 1 : 10 verdünnt, + 250 ul Ziegen Anti-Kaninchen-Gamme-Globulin-Serum,
mit Bis-N-Methyl-Akridin-Nitrat konjugiert, mit 0.01 m.Tris-Pufferlösung, pH = 6,5
1 10 verdunnt.
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4.) Waschung, dreimalig hintereinander je 30 Sekunden lang je in
40 ml physiologischer Kochsalzlösung und anschließende Trocknung.
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5.) Einbringen der trocknen Nylonnetze für 10 Minuten in eine Rundküvette,
die 3 ml 0,1 n NaOH-Lösung enthält, und anschließende Entfernung der Netze aus den
Küvetten.
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6.) Einbringen von 0,1 ml 3 % H2O2-Lösung in jede Küvette und zumindest
zweimalige Messung der nun auftretenden Phosphoreszenz mit dem Flüssigkeits-Szintillationszähler
unter Berücksichtigung des Zeitabstandes der Messungen vom Zeitpunkt der H2O2=Zufügung.
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Beim vorliegenden Test ergaben sich folgende Werte a.) für Probe
A von Normalperson In Meßperiode endend 1 min. nach H2O2-Zusatz # 820 cpm n 2 n
15 211 cpm m 3 m 9 399 cpm m 4 m 7 o24 cpm b.) für Probe B von Patienten mit ganz
schwach poaitivem HEPATITIS R -RIt Wert In Meßperiode endend 1 min. nach H202-Zusatz
304 111 cpm m 2 m 63 622 cpm n 3 m 3E 462 cpm m 4 m 29 109 cpm Aus den gefundenwn
Werten ergibt sich, besonders bei Auftragung auf doppelt-logarithmisches Papier-,
wie Fig. 1 zeigt, eine eindrucksvolle Differenz zwischen dem Plasma der Normalperson
A@und demjenigen des Patienten B.
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Vorteile Das in der vorliegenden Anmeldung beanspruchte Verfahren
weist gegenüber dem RIA und gegenüber dem Enzym-Immuno-Assay eine große Reihe von
Vorteilen auf.
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Es ist bei sehr hoher Empfindlichkeit schnell, zuverlässig und einfach
durchführbar; die zu seinem Betrieb erforderlichen chemischen Substanzen sind leicht
beschaffbar, entsprechend nicht teuer, und bei geeigneter Temperatur über eine sehr
lange Zeitspanne lagerfähig.
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Das Verfahren ist mit keinen aktinischen Gefahren behaftet, mithin
auch nich; den Strahlenschutzvorschriften unterworfen.
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Für die Messung kann der in vielen Labors für die RIA-Technik verwendete
Szintillationszähler ohne jede Modifikation verwendet werden oder aber ein einfacher
- billiger - Photonenvervielfacher mit nachgeschaltetem Integrator und zeitgesteuertem
Anzeigegerät herangezogen werden.