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Verfahren zur Bestimmung des Endotoxingehaltes einer
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wässrigen Flüssigkeit
Die Erfindung bezieht sich auf
die Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten, um das Vorliegen von Pyrogen festzustellen,
das heißt von einer Substanz, die beim Vorliegen im Blut von Säugetieren Fieber
bewirkt. Die häufigste und umfangreichste Anwendung für die Erfindung liegt im Bereich
der Untersuchung von parenteral angewendeten wässrigen Flüssigkeiten, Jedoch sind
auch andere Anwendungen möglich.
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Alle parenteral zur Anwendung gelangenden Arzneimittel sind potentiell
gefährlich, weil sie während Jeder Stufe ihrer Herstellung verschmutzt werden können.
Seit vielen Jahren sind strenge Kontrollen als Enduntersuchung auf das Vorliegen
von Bakterien üblich und standardisierte Sterilitätsuntersuchungen, wie sie in der
U.S. Pharmacopoeia beschrieben sind, sind als entsprechende und wirksame Sicherheitsmaßnahmen
bekannt. Das Problem der Pyrogene, die zwar kontrollierbar sind, ist jedoch sehr
viel schwieriger und die Prüfverfahren sind weitschweifig, kostspielig und nicht
immer reproduzierbar. Wie vorstehend ausgefiihrt, sind Pyrogene fieberverursachende
Substanzen, im allgemeinen Lipopolysaccharide, die durch Gram-negative als Endotoxine
freigemacht werden.
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Bei der Herstellung von Medikamenten können alle bakteriellen Zellen
entfernt werden und das Arzneimittel als "steril" befunden werden, dabei können
Jedoch noch Pyrogene vorliegen, die bei der Injektion zu ernsthaften Reaktionen
führen können. Aus diesem Grund müssen alle parenteral zur Anwendung kommenden Arzneimittel
auf Pyrogene durch ein Verfahren geprüft werden, das ähnlich dem in der U.S. Pharmacopoa
beschriebenen Verfahren ist, bei dem eine Gruppe von Kaninchen intravenös mit einer
spezifischen Menge des Arzneimittels injiziert wird und der erhaltene mittlere Temperaturanstieg,
wenn ein solcher auftritt, über einen Zeitraum von 3 Stunden beobachtet wird. Wegen
der offensichtlichen Schwankungen,
die bei biologischen Tests dieser
Art in unzähliger Weise auftreten können, müssen bei dem Prüfverfahren alle Schritte
unternommen werden, um sicherzustellen, daß die Bedingungen so gleichmäßig und standardisiert
wie möglich durchgeführt werden. Dies verlangt eine besondere Laboratoriumstechnik,
bei der die Tiere in einem Grundzustand gehalten werden können und eine entsprechende
Zufuhr von Tieren dabei derart stattfindet, daß zwischen den Versuchen eine vollständige
Erholungszeit besteht.
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Trotz der Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung gleichmäßiger
Bedingungen hat sich dieser Test als äußerst üblich erwiesen. Er wird weltweit durchgeführt,
um pyrogene Reaktionen bei Arzneimitteln auf einem Minimalwert zu halten. Ein vereinfachtes,
in vitro durchgeführten Verfahren würde Jedoch die Zeit- und Materialkosten für
die Durchführung dieses wesentlichen Tests erheblich verringern. Es gibt außerdem
bestimmte Arten von Arzneimitteln, zum Beispiel kurzlebige radio-markierte Diagnostika,
cysternographische Mittel und bestimmte Klassen von Hypnotika, die durch ihre Art
vom Kaninchen-Fieber-Pyrogentest ausgeschlossen sind. Diese Materialien werden zur
Zeit mit dem Risiko, daß sie nicht pyrogenfrei sind, benutzt.
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Die Notwendigkeit zur Untersuchung einer wässrigen Flüssigkeit, die
gelöst oder dispergiert ein Medikament wie Codein oder ein Antibiotikum oder andere
Substanzen enthält, die medizinisch wirken, erstreckt sich auch auf Lösungen oder
Dispersionen von anderen Substanzen, die parenteral angewendet werden und die im
Sinne dieser Anmeldung und Ansprüche als Medikamente im breiteren Sinne angesehen
werden, beispielsweise Lösungen von gochsalz oder Glukose, die intravenös angewendet
werden, oder eine Lösung oder Dispersion der verschiedenen Xahrstorte, die intravenös
zugeführt werden. Die Notwendigkeit der
Untersuchung auf das mögliche
Vorliegen von Pyrogenen erstreckt sich auch auf Flaschen und andere Behälter für
parenteral zur Anwendung gelangende Flüssigkeiten sowie auf Röhrchen, Schläuche,
Injektionsnadeln und andere Geräte, die bei der parenteralen Anwendung von Medikamenten
zur Anwendung gelangen oder bei Transfusionen oder bei Infusionen angewendet werden.
Untersuchungen auf Verschmutzungen durch Pyrogene werden auch bei Wasser und Salzlösungen
durchgeführt, die zur Verwendung bei parenteral angewendeten Lösungen und für andere
Zwecke vorgesehen sind. Beispielsweise hat das Vorliegen von Pyrogen in Trinkwasser
einen definierten Zusammenhang mit dem Bakteriengehalt. Die Untersuchung auf das
Vorliegen von Pyrogenen dient auch anderen Anwendungen, beispielsweise der Bestimmung
ihres Vorliegens in bestimmten Körperflüssigkeiten von Säugetieren.
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Vor mehreren Jahren erschien die Durchführung eines invitro-Tests
möglich, als entdeckt wurde, daß umlaufende Zellen, die Amöbozyten, im Blut von
Hufeisenkrebsen (Limulus Polyphemus) eine Gruppe von Proteinen enthalten, die mit
niedrigen Anteilen von Endotoxinen reagieren.
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Es wurde der Beweis erbracht, daß eins von drei Proteinen, wahrscheinlich
ein proteolytisches Enzym, auf bisher noch nicht erkannte Weise durch Endotoxin
aktiviert wird und' anschließend die Koagulation oder Gelierung von anderen Proteinen
bewirken kann. Die Proteinmischung (Lysat) kann von den Amöbozyten abgetrennt und
als Reaktionsmittel zur Feststellung des Vorliegens von Endotoxin verwendet werden,
wobei man die Bildung eines Gels nach der Bebrütung des Lysats mit Endotoxin nach
einer Stunde oder mehr feststellen kann.
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Bei dem bisher im allgemeinen verwendeten Testverfahren wird das Lysat
hergestellt, indem man die Amöbozytenzellen, die im Blut von Hufeisenkrebsen enthalten
sind,
so wäscht, daß die Bestandteile des Blutes entfernt werden,
die keine Amöbozytenzellen sind. Dies wird üblicherweise erreicht unter Verwendung
von Wasser, das Natriumchlorid enthält, um eine vorhergehende Zerstörung der Zellwandungen
so weit als möglich zu verringern. Vorzugsweise enthält die Waschlösung auch Calciumchlorid.
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Das Waschverfahren wird auch in Gegenwart von N-Athylmaleimid durchgeführt,
von dem gefunden wurde, daß es wirksam die Aggregation von Amöbozytenzellen verhindert,
so daß diese leichter von dem wässrigen Waschwasser durch Zentrifugieren abgetrennt
werden können. üblicher weise reichen zwei solche Waschverfahren mit anschliessender
Zentrifugation aus. Die gewaschenen Zellen werden anschließend unter Verwendung
von zwei Volumenteilen Wasser auf jedes Volumenteil der gewaschenen Zellen langsam
aufgelöst. Nach beendeter Auflösung, beispielsweise nach Bewegung der suspendierten
Zellen, wird der Proteingehalt der Zellen in Wasser dispergiert, das nach Abtrennung
der Zellreste durch Zentrifugieren zum "Lysat" wird. Es sind auch andere Möglichkeiten
der Lysatbildung bekannt.
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Bei der Durchführung des vorstehend beschriebenen Geltests werden
0,1 ml der wässrigen Lösung, wie sie für eine parenterale Anwendung hergestellt
worden ist, zu 0,1 nl des Lysata gegeben, das wie vorstehend beschrieben hergestellt
worden war. Nach einer Stunde Bebrütung der Mischung bei 37 s wird die Mischung
auf die Gelbildung untersucht. Wenn Gel gebildet wird, ist dies ein Beweis für das
Vorliegen eines Endotoxins aufgrund der Koagulierung des Proteingehalts im Lysat.
Die übliche Art der Bestinnng, ob ein Gel gebildet wurde oder nicht, beruht auf
den Vermögen der Mischung im Röhrchen zurückzubleiben, in den der Versuch durchgeführt
wurde, wenn das Röhrchen umgedreht wird.
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Üblicherweise wird der Versuch auch mit einer bekannten
Menge
an Endotoxin als Vergleichsmaß durchgeführt. Da das Lysat jedoch von Ansatz zu Ansatz
schwankt und auch die Art der verschiedenen Endotoxine, ist die Gelbildung nicht
immer gleichmäßig und bei der Entwicklung werden häufig subjektive Merkmale bestimmt.
Darüberhinaus ist für sehr niedrige Endotoxinanteile die Bebrütungszeit länger und
gelegentlich wird eine Verdikkung der Mischung oder eine Bildung von Granalien ohne
Bildung eines festen Kerns beobachtet, wodurch der Versuch noch schwieriger zu entwickeln
ist.
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Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines in-vitro-Tests für nicht
nur die qualitative, sondern auch die quantitative Bestimmung des Endotoxingehalts
in einer wässrigen Lösung, die mit Ausnahme des vorhandenen Endotoxins physiologisch
für Menschen und andere Säugetier verträglich ist und bei der Anwendung beim Menschen
oder anderen Säugetieren oder sonstigem Vorkommen bei diesen als Träger für etwa
vorhandene Endotoxine dienen kann, die Fieber induzieren. Zur Abkürzung werden alle
solche Flüssigkeiten, die auf das mögliche Vorliegen von Endotoxin untersucht werden,
in der nachstehenden Beschreibung und in den Ansprüchen als die "wässrige Flüssigkeit"
bezeichnet, die beim Testverfahren verwendet wird.
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Gemäß einem Merkmal der Erfindung wird das Testverfahren derart durchgeführt,
daß eine quantitative Antwort auf das Vorliegen eines Endotoxins auf eine Weise
erhalten wird, daß eine bestimmte Ablesung erfolgen kann, die die Endotoxinmenge
in der Probe der untersuchten wässrigen Flüssigkeit anzeigt.
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Gemäß einem besonderen Merkmal der Erfindung wird das Testverfahren
derart durchgeführt, daß die Antwort auf den Endotoxingehalt in einer Probe der
wässrigen Flüssigkeit als Schwankung des Absorptionsvermögens gemessen
werden
kann, das quantitativ proportional der Endotoxinkonzentration in der Probe bei Verwendung
von üblichen optischen Geräten wie einem Spektrophotometer ist.
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Gemäß der Erfindung wird eine Probe der zu untersuchenden wässrigen
Flüssigkeit mit einem Lysat gemischt, das aus dem Produkt von mit Wasser aufgelösten
gewaschenen Amöbozytenzellen besteht, wobei dieses Lysat auf einen pH-Wert zwischen
etwa 6,5 und etwa 6,8 abgepuffert und auf eine solche Konzentration verdünnt worden
ist, daß 1 ml davon mit 0,1 ml einer Endotoxinlösung reagiert, die 1 ng Je ml Endotoxin
enthält und bei 60 Minuten Bebrütung bei 37 s zu einer Trübung entwickelt wird,
die ein Absorptionsvermögen zwischen etwa 0,07 und etwa 0,2 bei Verwendung von 360
nm-Licht verleiht. Wie nachstehend ausführlich erläutert wird, ist eine solche Konzentration
weit verdünnter als ein in üblicher Weise hergestelltes Lysat, wie es bei dem vorstehend
beschriebenen Geltest zur Anwendung gelangt. Bei Verdünnung zur Erreichung der vorstehend
genannten Konzentrationsbereichsgrenzen wurde gefunden, daß die Trübung, die durch
das Vorliegen eines Endotoxins bewirkt wird, derart ist, daß die Antwort auf das
Endotoxin optisch auf empfindliche und genauer reproduzierbare Weise durch Messen
der Absorption von Licht einer gegebenen Wellenlänge, zum Beispiel 360 nm, bestimmt
werden kann. Auf diese Weise kann das Vorliegen von Endotoxin leicht in vitro bestimmt
werden, wenn man die leichte Durchführbarkeit und genaue Abhängigkeit bei der Verwendung
eines Spektrophotometers oder anderer äquivalenter Geräte ausnutzt.
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Bei der praktischen Durchführung der Erfindung wird die Mischung der
wässrigen Flüssigkeitsprobe und des Lysats unter Temperatur- und Zeitbedingungen
bebrütet, die zum Anstieg des Absorptionsvermögens aufgrund der Trübung führen,
die als Antwort auf die Umsetzung zwischen dem
Lysat und dem Endotoxingehalt
der Probe induziert wird, wobei das Absorptionsvermögen der bebrüteten Mischung
bestimmt wird. Gewöhnlich ist die Probe der wässrigen Flüssigkeit eine Probe einer
wässrigen Flüssigkeit, die für eine parenterale Anwendung hergestellt worden ist.
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In einem solchen Fall wird bei der Durchführung des Versuchs 0,1 ml
der so hergestellten Flüssigkeit mit einem ml Lysat vermischt, das 90 hergestellt
wurde, daß es in dem vorherstehend genannten kritischen Verdünnungsbereich liegt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der erhaltene Wert mit einem Wert verglichen,
der auf gleiche Weise mit einer ähnlich hergestellten Mischung mit gleichem Lysat,
jedoch unter Verwendung einer Endotoxinlösung bekannter Konzentration erhalten worden
ist.
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Zu Vergleichszwecken werden unter Verwendung des gleichen Lysats zusätzliche
Messungen durchgeführt, bei denen Endotoxinlösungen verschiedener bekannter Konzentrationen
verwendet werden, so daß eine Kurve gezeichnet werden kann, von der die Meßwerte
abgelesen werden können, die bei einer Probe mit einem unbekannten Endotoxingehalt
erhalten werden.
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Es wurde festgestellt, daß man beim Abpuffern des Lysats auf den vorstehend
genannten Bereich und bei Verdünnung auf die vorstehend genannte Konzentration eine
Antwort auf den Endotoxingehalt unter den genannten Bedingungen derart erhält, daß
die abgelesene Absorption in direkter Beziehung zum Endotoxingehalt steht. Es wurde
weiter festgestellt, daß unter solchen Bedingungen die Ansprechbarkeit auf Endotoxin
äußerst empfindlich ist, so daß Endotoxingehalte ermittelt werden können, die im
Fall des Kaninchen-Fieber-Tests, der häufig und weitverbreitet ist, nicht bestimmt
werden können.
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Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens konnten 80 geringe
Mengen wie 10 2g tatsächlich vorhandenen
Endotoxins festgestellt
werden. Bei diesem Verfahren kann der Endotoxingehalt auch genauer gemessen werden,
als es bei Anwendung des Geltests, der bisher empfohlen wurde, möglich ist. Darüberhinaus
wurde gefunden, daß es in bestimmten Fällen bei der praktischen Durchführung der
Erfindung möglich ist, das Vorliegen von Endotoxin festzustellen, das bei Anwendung
des Geltests nicht erkannt werden kann.
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Bei der praktischen Durchführung der Erfindung ist es günstig, so
zu arbeiten, wie bisher bei der Herstellung von Lysat gearbeitet und vorstehend
beschrieben wurde.
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Der Proteingehalt des so hergestellten Lysats ist so, daß eine umfassende
Verdünnung notwendig ist, um die vorstehend genannten Konzentrationsbedingungen
zu erreichen, die für die Durchführung der Erfindung wesentlich sind.
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Bei einem wie vorstehend beschrieben hergestellten Lysat umfaßt das
eine 20- bis 22-fache Verdünnung des Lysats mit einem Puffer bei einem pH-Wert zwischen
etwa 6,5 und 6,8. Das abgepufferte, verdünnte Lysat wird dann in der vorstehend
beschriebenen Weise geprüft, um zu bestimmen, ob die Absorption im Bereich fon etwa
0,07 bis etwa 0,2 liegt. Wenn das Absorptionsvermögen nicht innerhalb dieses Bereiches
liegt, wird die Verdünnung des Lysats so eingestellt, daß die Konzentrationsanforderungen
erfüllt werden. Ublicherweise verwendet man zu Beginn zur Herstellung des Lysats
zwei Volumenteile Wasser auf Jedes Volumenteil gewaschener Zellen. Dies ist Jedoch
nicht wesentlich, denn kritisch ist nur die verdünnte Konzentration des bei der
Durchführung der Absorptionsbestimmung verwendeten Lysats, die unabhängig ist von
der Konzentration des Lysats, das ursprünglich hergestellt wurde. Die abgepufferte
Lysatlösung kann unmittelbar zur Herstellung einer Kurve verwendet werden, die auf
bekannten Endotoxinlösungen verschiedener Konzentrationen beruht, wobei sich zusätzliche
Messungen, wenn gewünscht, anschlies-
sen können, um den Endotoxingehalt
verschiedener Proben zu untersuchender wässriger Flüssigkeiten zu messen.
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Solche notwendigen Versuche müssen sofort durchgeführt werden, da
die gepufferte Lösung nur für etwa 2 Stunden stabil bleibt.
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Um ein Reaktionsmittel herzustellen, daß für eine Lagerung und anschließende
Verwendung im Labor geeignet ist, wie es üblicherweise in Verbindung mit der praktischen
Durchführung der Erfindung der Fall ist, wird ein Anteil eines wie vorstehend beschrieben
hergestellten Lysats vor der Verdünnung mit einer ausreichenden Puffermenge vermischt,
um einen pH-Wert innerhalb eines Bereichs von etwa 6,5 bis 6,8 zu erreichen, wenn
diese unverdünnte Menge auf den Konzentrationsbereich verdünnt wird, der zur Durchführung
des vorstehend beschriebenen Absorptionstests erforderlich ist, und der durch direkte
Einstellung der Konzentration des Lysats ermittelt wurde.
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Anschließend wird die Mischung aus dieser Lysatmenge und dem Puffer
durch Lyophilisierung zur Trockne eingeengt.
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Im lyophilisierten Zustand kann das Lysat bei einer Temperatur von
etwa 2 bis 6 T längere Zeit lang gelagert werden, so daß das hergestellte Material
für spätere Laborversuchszwecke verkauft werden kann. Es wurde festgestellt, daß
bei der praktischen Durchführung der Erfindung der sogenannte "Pipes"-Puffer, das
heißt 1,4 Piperazinbis-(äthan-schwefelsäure) im Vergleich zu anderen Puffern wie
einem Phosphatpuffer die spezifische Eigenschaft hat, mit Bezug auf das Reaktionsvermögen
des Lysats gegenüber Endotoxin eine verbesserte Stabilität gegen Zersetzung in nicht
eingefrorenem Zustand zu verleihen. Salz- oder Phosphatpuffer oder Wasser als solches
haben ein gewisses Absorptionsvermögen, das vorzugsweise niedrig sein soll, um optimale
optische Eigenschaften bei der Durchführung des Absorptionstests auszuüben. Phosphatpuffer
wie Na F 04-EH2P04 haben optimale Eigenschaften
eines niedrigen
anfänglichen Absorptionsvermögens und eines antwortenden Reaktionsvermögens auf
Endotoxin bei Verwendung in der Testlösung zur Durchführung des Versuchs bei einer
Konzentration von etwa 0,025 M. Zwar sind Stabilität und Reaktionsvermögen gegenüber
Endotoxin bei Verwendung von Phosphatpuffern gewährt, jedoch ist für einen einwandfreien
Zustand unter Verschiffungs-und Lagerbedingungen der verschiedensten Art eine grössere
Stabilität wünschenswert. Diese kann durch Verwendung des "Pipes"-Puffer in wirksamer
Menge erreicht werden, wobei im wesentlichen die Stabilität im Vergleich zur Verwendung
von Phosphatpuffer gleicher Molarität verbessert wird. Eine optimale Kombination
der Eigenschaften eines niedrigen Anfangsabsorptionsvermögens und einer hohen Stabilität
wird erreicht, wenn die fertige Testlösung etwa 0,0125 M Phosphatpuffer und etwa
0,0125 M "Pipesß'-Puffer enthält. Der "Pipes"-Puffer selbst bewirkt zwar eine höhere
Stabilität,hat Jedoch auch ein Anfangsabsorptionsvermögen, das nur wenig größer
ist als das von Phosphatpuffer. Er kann daher auch als einziger Puffer verwendet
werden. Ein üblicher Wärmestreßtest, der angewendet wird, um vor übermäßiger Instabilität
bei Verschiffung und Lagerung sicher zu sein, ist eine Lagerung bei 40 T für drei
Tage. Die erhöhte Stabilität, die beim Vorliegen von "Pipes"-Puffer erreicht wird,
wird durch folgende Werte bewiesen, die die Anfangsabsorptionsfähigkeit und die
bei steigenden Endotoxinspiegeln von 0,025 M Phosphatpuffer, 0,0125 M "Pipes"-Puffer
und von einer Mischung von 0,0125 M Phosphatpuffer mit 0,0125 M "Pipesn-Puffer zeigt,
wobei die Konzentration der Endtestlösung entspricht. Lysat in einer Menge, die
eine Absorption von etwa b,1 unter den vorstehend genannten Bedingungen des Tests
bewirkt, wurde mit den vorstehend beschriebenen Puffern lyophilisiert und die nach
3 Tagen Kühlung auf 5 s erhaltenen Absorptionswerte wurden mit denen verglichen,
die nach
dreitägiger Lagerung bei 40 s erhalten wurden. Es wurden
folgende Werte erreicht: Endotoxin 0,025 M Phosphat- 0,025 M "Pipes"- 0,0125 M Phosphatng/ml
Absorption Absorption 0,0125 M "Pipes"-Absorption 5 S 40 S 5 S 40 s 5 s 40 s 0.0000
.055 .14? .158 .167 0.123 .114 0.0625 .131 .146 .184 .182 0.167 .150 0.125 .190
.141 .212 .210 0.245 .202 0.25 .309 .145 .267 .300 0.406 .433 0.50 .431 .145 .498
.441 .506 .499 Wie die vorstehenden Werte zeigen, war der Phosphatpuffer nicht stabil,
wenn er drei Tage bei 40 s gelagert war, während das gepufferte Lysat im wesentlichen
unbeeinflußt in seiner Aktivität verblieb bei Verwendung von "Pìpes"-Puffer. Es
zeigt sich auch, daß optimale Verbundeigenschaften von niedrigem Anfangsabsorptionsvermögen
und zurückbehaltenem hohen Absorptionsvermögen nach drei Tagen bei 40 s bei Verwendung
des Gemisches aus Phosphat- und "Pipes'-Puffern erreicht werden.
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Zum Zeitpunkt der Anwendung wird das lyophilisierte, nicht verdünnte
Lysat, das mit dem Puffer vermischt ist, mit einem Anteil Wasser aufbereitet, der
die erforderliche Lysatkonzentration bewirkt, die vorstehend beschrieben wurde und
die wesentlich für die Durchführung der Erfindung ist. Die vorhergehende Entwicklung
eines besonderen Lysats mit Bezug auf die Lösungen von bekanntem Endotoxingehalt
ist erforderlich, weil der Proteingehalt der Amöbozytenzellen einer gewissen Schwankung
unterliegt. Wesentlicher ist, daß das Reaktionsvermögen von Endotoxin gegenüber
dem Proteingehalt der Amöbozyten-
zellen sehr erheblich schwankt
in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie geographischem Vorkommen der verwendeten
Hufeisenkrebse und der Jahreszeit. Daher ist es im Fall eines gegebenen Lysats immer
erforderlich, die geeignete Einstellung der Konzentration durch Verdünnung auf einer
breiten empirischen Basis durchzuführen, die auf vorhergehender Erfahrung beruht,
damit das notwendige Absorptionsvermögen als Antwort unter den vorstehend beschriebenen
Bedingungen erreicht wird.
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Wenn die gewünschte Konzentration nicht zu Beginn erreicht wird, kann
diese Konzentration eingestellt werden. Dafür können bekannte Einstellverfahren
angewendet werden unter Verwendung eines Teiles des ursprünglich erhaltenen Lysats,
das durch Lyophilisierung in Gegenwart einer erforderlichen Puffermenge zur Trockne
eingeengt worden ist und das zum Zeitpunkt der Verwendung durch Zugabe einer festgelegten
Menge Wasser auf die gewünschte Lysatkonzentration gebracht werden kann.
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Bei Verwendung eines Lysats, hergestellt durch auflösendes Waschen
von Amöbozytenzellen unter Verwendung von zwei Volumenteilen reinem Wasser auf Jedes
Volumenteil gewaschener Zellen, ist es üblicherweise günstig, 0,5 ml des Lysats
zu verwenden und die Konzentration so zu regeln, daß 1 ml des verdünnten Lysats
bei Pufferung auf einen pH zwischen 6,5 und 6,8 mit 0,1 ml einer Endotoxinlösung
reagiert, von der bekannt ist, daß sie 1 ng Je ml Endotoxin enthält, um ein Absorptionsvermögen
innerhalb des erforderlichen Bereichs zu erreichen. Wenn diese Bestimmungen durchgeführt
sind, ist eine Basis dafür erreicht, daß 0,5 ml des gleichen Lysats mit einer entsprechenden
Menge Puffer vermischt und durch Lyophilisierung zur Trockne eingeengt werden kann
und zur Zeit der Anwendung dann dieses lyophilisierte Lysat unter Verwendung einer
entsprechenden Wassermenge zur Erreichung der für den Versuch erforderlichen Konzentration
aufbe-
reitet werden kann. Wenn beispielsweise 0,5 ml des Lysats
lyophilisiert werden, können 11 ml reines Wasser zur Aufbereitung des gepufferten
Lysats verwendet werden, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Dies ist
ein günstiges Verfahren, da ausreichend Lösung zur Durchführung von 10 Versuchsmessungen
vorgesehen wird, von denen einige Bezug nehmen auf Endotoxinlösungen bekannter Konzentration,
um eine Standardkurve zu erhalten, während die zusätzliche Lösung zur Verfügung
steht für Testbestimmungen in Verbindung mit Proben von Medikamenten mit anderen
wässrigen Flüssigkeiten mit unbekanntem Endotoxingehalt. Auf diese Weise erhält
man ein Testverfahren, das unabhängig von Schwankungen im Reaktionsvermögen der
Proteine verschiedener Hufeisenkrebsquellen zum Messen des Endotoxingehaltes einer
wässrigen Flüssigkeit mit einem hohen Genauigkeitsgrad und mit einem außerordentlich
hohen Empfindlichkeitsgrad zur Bestimmung des Vorliegens von extrem geringen Mengen
Endotoxin geeignet ist.
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Der Ausdruck "Absorptionsvermögent' wird in dieser Beschreibung in
der üblichen Bedeutung als negativer Logarithmus der Transparenz verwendet. Wenn
T5 die Transparenz einer gegebenen Lösung bezeichnet, kann das Absorptionsvermögen
(As) wie folgt dargestellt werden: A = log 1 s T 5 wobei die Transparenz T8 das
Verhältnis der Transparenz der Lösung zu der des Lösungsmittels ohne den aufgelösten
Stoff entsprechend dem Ausdruck: T n Trensparenz der Lösung Transparenz des Löaungsmittels
ist.
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Die Transparenz der Lösung und die des Lösungsmittels
werden
dabei unter gleichen Wellenlängenbedingungen (hier 360 nm) einfallender Lichtintensität
und Länge des Durchgangs durch die Lösung, üblicherweise 1 cm, gemessen. Die wie
vorstehend beschrieben gemessene Absorption wird auch als optische Dichte bezeichnet,
wobei die Werte die gleichen sind.
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Die Erfindung läßt sich für die Prüfung von wässrigen Flüssigkeiten
in einem breiten Bereich anwenden, so wie diese in geeigneten Behältern in einem
Zustand für eine Verwendung ohne Veränderung für die parenterale InJektion vorliegen.
Bei Medikamenten oder anderen Substanzen, die ursprünglich mit anderen Konzentrationen
oder in trockenem Zustand hergestellt worden sind, kann der erfindungsgemäße Test
durch Einstellung der Konzentration des Medikamentes oder der anderen Substanz,
beispielsweise durch Zugabe von Wasser oder Salzlösung, so eingestellt werden, daß
die anfallende wässrige Lösung in einem Zustand erhalten wird, der die Konzentrationen
umfaßt, wie sie für eine parenterale Injektion geeignet sind. In einem solchen Fall
muß das Wasser oder die Salzlösung als solche, die zur Einstellung der Lösung auf
eine geeignete Konzentration verwendet werden, auf das Vorliegen von Endotoxin in
der vorstehend beschriebenen Weise geprüft werden, das heißt durch Zugabe von 0,1
ml davon zu 1 ml Lysat, wobei der kritische Verdünnungsbereich, wie er vorstehend
beschrieben wurde, eingehalten wird. Wenn gewünscht kann auch eine Lösung eines
Medikamentes oder einer anderen Substanz mit irgendeiner anderen Konzentration als
sie für eine parenterale Injektion geeignet sind, beim Testverfahren verwendet werden,
wenn die Trübungsantwort zum Messen der Absorptionsfähigkeit günstig ist, die durch
das Vorliegen von Endotoxin induziert wird. Gelegentlich ist es wünschenswert, das
mögliche Vorliegen von Endotoxin in einem Arzneimittel zu prüfen, das lokal
angewendet
wird und das bei einer derartigen Anwendung ausreichend absorbiert wird, um in den
Blutstrom zu gelangen. Wenn es die Zusammensetzung des Medikamentes erlaubt, wird
es in einem solchen Fall in die Form einer wässrigen Flüssigkeit durch Zugabe von
Wasser oder Salzlösung überführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um eine Konzentration
zu erreichen, die zur Prüfung bei Zugabe von 0,1 ml bis 1 ml des verdünnten Lysats
geeignet ist. Wenn erforderlich, können die Versuche der vorstehend beschriebenen
Art mit verschiedenen Lösungskonzentrationen wiederholt werden, um die Trübung zu
erreichen, die die günstigste zum Messen des Absorptionsvermögens ist.
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Eine Verunreinigung von Behältern, Röhrchen, Injektionsnadeln und
dergleichen durch Endotoxine kann erfindungsgemäß durch Abspülen der Instrumente
oder anderen Geräte mit einer geringen Menge, zum Beispiel etwa 40 ml, Wasser oder
einer physiologischen Salzlösung wie 0,85 %igem Natriumchlorid bei geringer Geschwindigkeit
von zum Beispiel 10 ml je Minute festgestellt werden. Die wässerige Abspülflüssigkeit
wird dann auf das Vorliegen von Endotoxin, wie vorstehend beschrieben, untersucht,
das heißt durch Zugabe von 0,1 ml dieser Lösung zu einem ml des Lysats, wobei der
vorstehend angegebene kritische Verdünnungsbereich eingehalten wird.
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Bei der Untersuchung von Wasser, wie es beispielsweise in den Rohrleitungen
einer Gemeinde vorliegt, um bakterielle Verunreinigungen festzustellen, die durch
das Vorliegen von Endotoxin angezeigt werden, kann der Endotoxingehalt so groß sein,
daß beim Vermischen von 0,1 ml eines solchen Wassers mit 1 ml des Lysats in der
vorstehend genannten kritischen Verdünnung, eine Trübung erreicht wird, die zu einer
Absorption über den Bereich von 0,07 bis etwa 0,2 führt. In solchen Fällen verdünnt
man das zu untersuchende Wasser mit bekannten Mengen
Wasser, von
dem bekannt ist, daß es im wesentlichen pyrogenfrei ist, bis bei der Untersuchung
das Absorptionsvermögen innerhalb des gewünschten Bereiches liegt.
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Daraus folgt, daß der Pyrogengehalt des unverdünnten Wassers eine
Funktion des Pyrogengehaltes des verdünnten Wassers in Abhängigkeit von dem bekannten
Ausmaß der Verdünnung ist. Dieses Verfahren kann auch auf andere wässrige Flüssigkeiten
als Wasser angewendet werden.
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Das bedeutet allgemein, daß das hier beschriebene Testverfahren und
die dafür erforderliche Zusammensetzung immer dann angewendet werden können, wenn
es gewünscht wird, eine wässrige Flüssigkeit auf das mögliche Vorliegen von Endotoxinen
zu untersuchen. Beispielsweise kann das Vorliegen von Endotoxin im Urin durch Vermischen
von 0,1 ml Urin mit 1 ml des Lysats innerhalb des vorstehend genannten kritischen
Verdünnungsbereiches bestimmt werden. In gleicher Weise kann auch das Vorliegen
von Endotoxin in Riickenmarksflüssigkeit bestimmt werden.
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Wenn die zu untersuchende Flüssigkeit für sich einige Trübung aufweist,
die die erreichte Gesamttrübung verstärkt, wenn die Probe wie vorstehend beschrieben
untersucht wird, ist es üblicherweise wünschenswert, das Absorptionsvermögen zu
bestimmen, das der Probe als solcher zukommt, indem man 0,1 ml der Probe mit 1 ml
der gleichen Pufferlösung vermischt, die bei dem verdünnten Lysat verwendet wird,
das zur Bestimmung der Gesamtabsorptionsfähigkeit verwendet wird, und dann das Absorptionsvermögen
aufgrund der Trübung der Probe von der Gesamtabsorption abzieht, die erreicht wird,
wenn 0,1 ml der Probe mit 1 ml des verdünnten Lysats bebrütet werden. Der Unterschied
stellt das Absorptionsvermögen dar, das dem Antigengehalt der Probe entspricht.
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Die Bestimmung des Absorptionsvermögens der Probe als
solcher
erfolgt üblicherweise auf gleiche Weise, wenn die Probe eine gefärbte Flüssigkeit
wie Urin ist, das heißt das Absorptionsvermögen wird gemessen, wenn 0,1 ml der gefärbten
Flüssigkeit mit 1 ml Pufferlösung in Abwesenheit des Lysats vermischt worden sind.
Das so gemessene Absorptionsvermögen wird abgezogen von dem Absorptionsvermögen
der Probe, wenn diese in gleicher Menge mit einer gleichen Menge des verdünnten
Lysats vermischt wird.
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Bei Verwendung von Lysat, das so verdünnt worden ist, daß die vorstehend
festgelegte Absorptionsfähigkeit unter den vorstehend beschriebenen Testbedingungen
erreicht wird, das heißt, daß 1 ml mit 0,1 ml einer Endotoxinlösung reagieren kann,
die 1 ng per ml Endotoxin enthält, so daß sich bei 60 Minuten Bebrütung bei 37 T
eine Trübung entwickelt, die ein Absorptionsvermögen zwischen etwa 0,07 und etwa
0,2 bei 360 nm hat, wird es üblicherweise bei Messung des Endotoxingehaltes einer
Flüssigkeit mit unbekanntem Endotoxingehalt vorgezogen, die Absorptionsfähigkeit
bei 360 nm zu messen. Wenn jedoch das verdünnte Lysat den vorstehend genannten Anforderungen
entspricht, kann der Endotoxingehalt einer unbekannten Flüssigkeit unabhängig davon
bestimmt werden, ob das Absorptionsvermögen bei gleicher oder anderer Wellenlänge
als 360 nm gemessen wird, zum Beispiel bei 340 nm, vorausgesetzt, daß das Absorptionsvermögen
der unbekannten Probe bei derselben Wellenlänge gemessen wird, wie sie bei der Herstellung
der Standardkurve verwendet wurde, mit der sie verglichen wird. In analoger WeGe
kömen auch Zeit und Temperatur bei der Bebrütung verändert werden, beispielsweise
durch Anwendung einer etwas längeren Brutzeit bei etwas niedrigerer Temperatur,
solange damit die Trübungsantwort ausreicht, um den Endotoxingehalt mit gewünschter
Empfindlichkeit festzustellen. 60 Minuten Brutzeit bei 37 s und Bestimmung der
Absorptionsfähigkeit
bei 360 nm stellen jedoch optimale Bedingungen für die praktische Durchführung der
Erfindung dar.
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Das Prüfverfahren gemäß der Erfindung läßt sich allgemein anwenden
mit wenigen Ausnahmebeispielen, wenn die zu untersuchende Flüssigkeit eine Substanz
enthält, beispielsweise einen Inhibitor, der die Entwicklung der Trübung in einem
derartigen Ausmaß hindert, daß der Versuch nicht genau die tatsächliche Menge etwa
vorhandenen Endotoxins wiedergibt. Carbenacillin ist ein Beispiel für eine solche
Substanz, deren Vorliegen in einer für eine parenterale InJektion geeigneten Lösung
die Trübungsantwort stört. Bei der überwiegenden Mehrheit von Anwendungen des Testverfahrens
gemäß der Erfindung besteht keine Notwendigkeit entersuchung auf das mögliche Vorliegen
von Inhibitoren, insbesondere nachdem die Erfahrung bewiesen hat, daß die in Frage
kommenden parenteral angewendeten Medikamente oder anderen wässrigen Flüssigkeiten,
die üblicherweise verwendet werden, keine Probleme mit Bezug auf das mögliche Vorliegen
eines Inhibitors oder anderer Substanzen bieten, die die Trübungsantwort stören.
Wenn jedoch das Testverfahren auf eine Materialart angewendet wird, die vorher noch
nicht dem Testverfahren unterworfen worden ist, gebietet es die Vorsicht, auf das
mögliche Vorliegen von störenden Substanzen zu prüfen. In erster Linie kann eine
solche Prüfung dadurch erreichtQerden, daß man die zu untersuchende wässrige Flüssigkeit,
zum Beispiel 0,1 ml, zu einer Mischung von 1 ml Lysat mit dem vorstehend genannten
kritischen Verdünnungsbereich mit einer bekannten Menge Endotoxin gibt, zum Beispiel
zu 0,1 ml Endotoxinlösung, die 1 ng je ml Endotoxin enthält. Wenn die Trübung geringer
ist, als sie von Endotoxin bei Fehlen der zusätzlichen Substanz unter den Prüfbedingungen
entwickelt werden würde, ist das Vor-
liegen eines Inhibitors anzunehmen.
Wenn andererseits keine Verringerung der Trübung auftritt, kann zusätzlich untersucht
werden, ob bein Kaninchenimpfverfahren das Vorliegen von Endotoxin bewiesen werden
kann. Wenn diese Vorsichtsmaßnahme durchgeführt worden ist und feststeht, daß das
fragliche Material,so wie es üblicherweise anfällt, frei von Inhibitoren ist, kann
das Testverfahren mehrfach wiederholt werden, ohne daß auf das mögliche Vorliegen
eines Inhibitors geprüft wird. Wird festgestellt, daß ein Inhibitor vorliegt, dann
läßt sich das Testverfahren gemäß der Erfindung in Abwesenheit von Mitteln, die
die Störung durch den Inhibitor verhindern, nicht anwenden.
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Die Erfindung wird durch das nachstehende Beispiel erläutert.
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Beispiel Mehrere lebende Hufeisenkrebse wurden erhaltenUtrch Einsetzen
einer Injektionskanüle mit einer großen Bohrung am Punkt der Thorax- und Abdominalsegmente
Blut entnommen und das Blut in 250 ml-Bechern mit einem Gehalt an 50 ml einer Mischung
von 0,125 %igem N-äthylmaleimid, 3 %igem NaCl und 0,02 M CaCl2 gesammelt. Das Blut
wird dann bei 750 G 10 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag aus sedimentierten
Amöbozyten (amebocytes) bleibt zurück und wird in der Hälfte des ursprünglichen
Volumens der vorstehend genannten Mischung wieder suspendiert.
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Die Zellen werden wieder zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit
sbgegossen und Wasser entsprechend etwa dem doppelten Volumen der Zellen zugegeben.
Die Zellsuspension wird dann in einem kalten Raum in eine Schüttelvorrichtung gegeben
und zwei Tage bei 5 s lysiert. Die Suspension wird bei 26 000 G zentrifugiert, die
über-
stehende Flüssigkeit zurückbehalten und die Zellreste verworfen.
Die überstehende Flüssigkeit ist das Lysat, das die Proteine enthält, die von den
gewaschenen Amöbozytenzellen stammen.
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0,5 ml des Lysats werden mit 11 ml Wasser verdünnt, das ausreichend
Phosphat-"Pipes"-Puffer enthält, um einen pH-Wert von etwa 6,8 einzustellen. 1 ml
des verdünnten Lysats wird mit 0,1 ml einer Lösung vermischt, die 1 ng je ml Endotoxin
enthält, om gleichmäßige Werte zu erreichen. Für das Endotoxin verwendet man wünschenswert
als Lösung eine solche, die vom FDA unter der Bezeichnung "Elebsiella" standardisiert
ist. Die erhaltene Mischung wird 60 Minuten bei 37 S bebrütet und dann in eine Mikroküvette
überführt, in der die Absorption bei 360 nm unter Verwendung des bekannten Standardverfahrens
für die Messung der Absorptionswerte gemessen wird. Unter diesen Prüfbedingungen
wird eine optimale Konzentration des Lysats angezeigt, wenn die Absorption im wesentlichen
0,15 beträgt, obwohl wie vorstehend ausgeführt, die Toleranzbreite schwanken kann
zwischen etwa 0,07 und etwa 0,2. Wenn die optische Dichte nicht innerhalb dieses
Bereiches liegt, wird die Konzentration so geregelt, bis die Anforderungen für die
optische Dichte getroffen werden. Solche Einstellung besteht in einer Veränderung
der Menge des Lysats, das bei Verdünnung mit 11 Teilen Wasser eine Konzentration
hat, die die Anforderungen zur Bildung der geeigneten Absorption erfüllt. Das bedeutet
mit anderen Worten, daß die eingestellte Lysatmenge nur 0,5 ml betragen kann.
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Wenn tatsächlich 0,5 ml den Anforderungen für die Bildung der erforderlichen
Absorption genügen, kann das Lysat in lyophilisierter Form durch Zugabe von 0,5
ml des Lysatpuffers auf einen pH-Wert von 6,8 gebracht werden, wobei man 0,05 M
"Pipes"-Puffer und 0,05 M Phosphat-
tive Antwort auf das Vorliegen
von Endotoxin geben. Jede derartige Flüalgkeit kann und wird wahrscheinlich anschließend
dann erneut geprüft im quantitativen Verfahren, wie es vorstehend beschrieben worden
ist, wobei geeignete Geräte wie ein Spektrophotometer für eine genaue Messung der
Trübung verwendet werden.
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puffer verwendet und mit Wasser auf ein Endvolumen von 2,5 ml auffüllt.
Das Fläschchen, des diese Reaktionsmischung enthält, wird dand lyophilisiert, um
den Inhalt zur Trockne einzuengen. Wenn ein Anteil von etwas grösser oder kleiner
als 0,5 ml die geeignete Absorption ergibt, dann wird diese Menge mit Puffer vermischt
und lyophilisiert.
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Wenn es wünschenswert ist, den Anteil von etwa vorliegendem Endotoxin
in einer wässrigen Flüssigkeit zu messen, wird der Inhalt des Fläschchens mit 11
ml Wasser aufgefüllt. In der Praxis wird 1 ml des verdünnten Lysats in Jedes von
mehreren Teströhrchen gegeben. Zum Zeitpunkt 0 werden 0,1 nl einer Reihe von bekannten
Endotoxinstandardproben und gleichfalls von den unbekannten Proben jeweils in jedes
Rohr zugegeben. Nach 60 Minuten Bebrütung bei 37 s wird der Inhalt jedes Röhrchens
durch Bewegen vermischt und in eine Mikroküvette überführt, in der die Absorption
bei 360 nm bestimmt wird. Eine gleiche Ablösung wird im Fall eines Kontrollreagenz
gemacht und diese Ablösung wird von den anderen Ablösungen abgezogen.
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Die Endotoxinabsorption-Ablösung, die im Fall der Reihen von bekannten
Endotoxinstandardproben erhalten wird, wird zu einer Kurve aufgetragen, die als
anwendbar für das infragestehende besondere Lysat angesehen werden kann.
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Der Endotoxingehalt der unbekannten Proben wird dann direkt von der
so hergestellten Standardkurve abgelesen.
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Wenn auch ein Merkmal und Hauptvorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
darin besteht, daß ein verbessertes Verfahren und verbesserte Mittel zum Beweis
des Vorliegens von Endotoxin in einer wässrigen Flüssigkeit durch quantitative Bestimmung
vorgesehen werden, so kann die r1indung doch auch dafür eingesetzt werden, einen
qualitativen Beweis für das Vorliegen von Endotoxin allein durch Mischen einer Menge
von Lysat zu erreichen, das