DE2705859A1

DE2705859A1 - Verfahren und reagenzsysteme zur analyse, insbesondere zur kinetischen analyse, von alpha- und beta-amylase, anorganischem phosphat sowie saurer phosphatase

Info

Publication number: DE2705859A1
Application number: DE19772705859
Authority: DE
Inventors: Geb Svetlik Henriette Nadj; Kenneth Jonas Pierre; Ker-Kong Tung
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1976-02-13
Filing date: 1977-02-11
Publication date: 1977-08-18
Also published as: SE442406B; JPS5527800B2; US4097336A; DK61077A; DE2705859C2; DK160844C; GB1540320A; NO770446L; JPS52119296A; NL7701455A; FR2394804A1; NL173285C; NO155844C; FR2394804B1; SE7701564L; DK160844B; CA1076935A; NO155844B; IT1077151B; NL173285B

Description

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Beckman Jnetruaents, Inc., Fullerton, CaI., TTSA

Verfahren vnä Reagenssysteme sur Analyse, insbesondere stur kinetischen Analyse von Alpha- und Beta-AoQrlase, anorganisohem Phosphat sowie saurer Phosphat ase

Die Erfindung betrifft Beagensien und Yerfehren sur Bestimmung der Konzentration von Alpha-Asylase und weiteren Substanzen in wässrigen Lösungen, wie beispielsweise Serum und Urin·

Alpha-Anylase ist ein vom menschlichen Körper erseugtes Bazym und findet sich in Körperflttssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Urin und Speichel. Bs ist noch nicht

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vollständig gesichert, welcher Teil des Körpers Amylaee produziert, jedoch ist als gesichert bekannt, cla£. im gesunden Zustand des Körpers die in menschlicher Kö :?- perflüssigkeiten vorliegende Alpha-Amylasekonzentri tion innerhalb eines bestimmten Wertebereichs schwanken kanu, während unter bestimmten pathologischen Zuständen C es "Coppers die Alpha-Amylasekonzentration entweder höhe r ode ? niedriger als dieser im gesunden Körperzustand vor", leg mc e Bereich ist. So wird beispielsweise bei einer Pers<n, iit an Fankreatitis, Mumps oder Bauchspeicheldrüeenki-el s Iidet, die Alpha-Amylasekonzentration wesentlich ül>ei de u ohne diese Krankheitszustände herrschenden Pegel 1:' ege ·.. Umgekehrt können Lebererkrankungen zu Alpha-Amyltus« kon .ei.-trationen führen, die niedriger als normal liegen.

Die bekannten Techniken zur Bestimmung von Alpha-Ai yle .ekonzentrat ionen beruhen im allgemeinen auf der Vcr\ end on^; von Stärke, und zwar wegen der katalytischen Wirlnii g von Alpha-Amylase auf die Hydrolyse der 1,4-Bindungeii < er Amylose- und Amylopectin-Praktionen der Stärke. IäJt diese Hydrolyse bis zu Ende ablaufen, wird die Stärke durch die Alpha-Amylase fortschreitend in Glukose, Ma und Oligosaccharide abgebaut. Es wurden verschiecler e Techniken erprobt, um die Abnahme der Trübung oder dor Viskosität einer wässrigen Stärkelösung nach der Amylose Hydrolyse in Beziehung zu setzen mit der resultier»nde ι Alpha-Amylasekonzentration.

Anderweitige Analysetechniken machen sich den Betrfg von durch die Alpha-Amylase/Stärke-Reaktion gebildeten reduzierenden Substanzen als HaB für die Alpha-AmylaoeJ onzsn-· tration zunutze, oder das Ausmaß bzw. die Geschwini

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der Farbetofffreisetzung aus gefärbter Stärke durch Alpha· Amylaee.

Des weiteren wurden auch enzymatische Techniken zur Messung der Alpha-Amylaeekonzentration entwickelt, welche auf der Verwendung von Alpha-Amylaee und anderen Enzymen zur Hydrolyse von Stärke in Glykose beruhen, die dann durch gekoppelte enzymatisch^ Reaktionen gemessen wird. Dieser Lösungsweg ist jedoch nicht zufriedenstellend, weil in vielen Analyseproben Glukose vorliegt, die dann gemäß den gekoppelten enzymatischen Reaktionen reagiert unter Bildung des leicht nachweisbaren Produkts zusätzlich zu den durch die enzymatische Stärkehydrolyse erzeugten Abbauprodukt. Die Konzentration dieser in der Probe von Haus aus vorliegenden Glykoae ist im allgemeinen durchaus signifikant im Verhältnis zu der üblicherweise durch die enzymatische Hydrolyse erzeugten Glykosemengei daher muß bei diesem Verfahren anfänglich vorliegende Glykose zunächst aus der Probe eliminiert werden, bevor die Analyse durchgeführt wird.

Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die Jodometrieche Methode, welche auf der bekannten Reaktion zwischen Jod und Stärke unter Bildung einer blauen Farbe beruht. Wird eine eine blaue Farbe aufweisende Stärke-Jod-Lösung mit Alpha-Amylaee hydrolysiert, so nimmt die blaue Farbe mit zunehmendem Abbau der Stärke durch die Alpha-Amylase ab. Diese Farbänderung der blauen 8tärke-Jod-Lösung stellt daher ein gewieeee Maß für die Alpha-Amylasekonzentration dar. Dieses Verfahren gilt Jedoch nicht als zuverlässig und hinreichend bestimmt, da man annehmen muß, daß die Farbänderung in keiner linearen Beziehung zur Konzentration

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von Alpha-Amylase steht.

Alle diese bekannten Verfahren reichen daher 'für die Beschaffung einer allgemeinen Überblioksanzeige der Alpha-Amylasekonsentratiön aus, sind jedoch nicht voll befriedigend, da sie entweder keine wissenschaftlich genauen Messungen ermöglichen und/oder su seitaufwendig sind.

Durch die Erfindung sollen daher ein neues Verfahren und neue Besgenssysteme für die Alpha-Amylase-Analyse geschaffen werden, durch welche die mit den bekannten Verf.ihren zur Bestimmung von Alpha-Amylaeekonzentrationen verbundenen Probleme vermieden werden. Insbesondere soll du ?ch die Erfindung ein Analyseverfahren zur Bestimmung von Alpha-Amylaeekonzentrationen geschaffen werden, das schnell und einfach durchführbar ist und zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse liefert.

Zu diesem Zweck ist gemäfi der Erfindung ein neues kinetisches Analyaeverf ahren sur Messung von Alpha-Amylasekonzentrationen (sowie Xonsentrationen anderweitiger Substanzen) in wässrigen Lösungen vorgesehen, das auf den folgenden Reaktionen beruht ι

(I) Alpha-1,4 gebundenes Glucan Alpha-Maltose * andere Malz-Oligosaccharide

(II) Alpha-Maltose + PO₄. * 2!L* Glucose + Beta-D-G-1-P (III) Beta-D-G-1-P G-6-P (IV) G-6-P- + KAD fi£E3BL» 6-P-G + KADH,

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wobei die Konsentration der Alpha-Aaylaae in der wässrigen Lösung durch Messung dea Betrage der Geschwindigkeit der Bildung von KJLM bestimmt wird, daa ein Maß far die Alpha-Amrlasekonzentration darstellt · Die In den oben angegebenen Reaktionsgleichungen und im weiteren Verlauf der Beschreibung verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:

- Phosphation
HP - Maltosephosphorylase Beta-D-G1P - Beta-D-Glucose-1-Phosphat Beta-FQM - Beta-D-Phosphoglucomutase G-1,6-fliP - D-Gluoose-1,6-Diphoephat G-6-P - Glucoee-6-Phosphat
6-PG - 6-Phosphogluconat
G6PDH - Glucoee-6-Phoephatdehydrogenaee 6PIH - 6-Phoephogluoonatdehydrogenaee NAD - Beta-Vicotinamid-Adenindinucleotid

HADH - reduzierte Pom yon Beta-Hicotinamid-Adenindinucleotid.

Das erflndungsgemäBe Beagenssystem enthält das Auagangsmaterial von Reaktion I, d. h. Alpha-1,4 gebundenes Glucan, und sämtliche weiteren Bestandteile,mit Ausnahme von Alpha-Amylase, wie sie für den Ablauf der angegebenen vier Reaktionen erforderlich sind, d. h. also Phosphationen, HP, Beta-PGH und G6PDH. Dieses Reagenzsyatem kann als ein Gemisch geliefert und verwendet werden; alternativ kann es auch in Form eines Analyse-Sets aus mehreren Reagenzien

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geliefert werden, die Jeweils einen oder mehrere der Bestandteile des Reagenzsystems enthalten und zur Verwendlang für die erfindungsgemäfie Alpha-Amylase-Analyse miteinander gemischt werden. Die Komponenten des erfindungsgemäBen Reagenzsystems scheinen sämtlich als ein Gemisch stabil zu sein, so daß die Lieferung des Reagenzsystems als ein fertiges Gemisch vorzuziehen ist, da es einfacher sein wird, mit einem Reagenz als mit mehreren Reagenzien zu arbeiten.

Die Erfindung betrifft auch auf weitgehend ähnlichen Simultanreaktionen, wie die vorstehend angegebene erfindungsgemäße Alpha-Amylase-Analyse, beruhende Analyseverfehren und Reagenzsysteme für anderweitige Substanzen, nämlich für Beta-Amylaee, für anorganisches Phosphat sowie für saure Phosphatase, wie weiter unten noch im einzelnen erläutert wird.

Im folgenden werden bevorzugte /usführungsformen der Erfindung beschrieben·

Zu der ersten gemäfi der Erfindung Anwendung findenden Reaktion:

(I) Alpha-1,4- gebundenes Glucan _Alpha. Haitose sowie weitere Malz-Oligosaccharide

Bei dem Alpha-1,4 gebundenen Glucan kann es sich um ein beliebiges, in der Hauptsache aus Glucose bestehendes Polysaccharid handeln, wobei die Glucosemoleküle in der Hauptsache, durch Alpha-1,4-Bindungen gebunden sind, auf welche die Alpha-Amylase einwirken kann. Beispiele derartiger Polysaccharide sind Stärke, Amylopectin, Amylose,

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Glycogen, Dextrin und ihre Abbauprodukte, sowie Homologe von Malz-Oligosacchariden, wie beispielsweise Haltotriose, Haltotetraose und Haltopentaose oder Gemische hiervon.

Stärke wird als Glucan für die vorliegenden Zwecke bevorzugt, da es die beste Kombination hinsichtlich Löslichkeit, niedriger Kosten, Rückgewinnung und Stabilität bietet. Superlose 300 ist die Handelsbezeichnung einer gemäß einer bevorzugten Ausltthrungeform der Erfindung verwendeten Stärke. Diese Stärke besitzt gute Kaltwasserlöelichkeit, zeigt ein besseres Ansprechverhalten und höhere Linearität als andere Stärken, ergibt eine gute Reproduzierbarkeit und ist in Lösung trübungsfrei. Superlose 300 ist eine von der Firma Stein-Hall Company, New York City, kommerziell vertriebene modifizierte Amylose. Superlose 300 ist ein weißes, körniges Material mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 10 %, einem pH-Wert 7 und einer Film-Zugfestigkeit von mehr als 8.000 (TJS) Pfund pro Quadratzoll· Die Viskosität von Superlose 300 in Brookfield cps bei 150⁰F beträgt 185 für 14 % Feststoffgehalt, 55 für 10 % Feststoff gehalt und 10 für 5 % Fest stoff gehalt. Bei 75°F beträgt die Viskosität 2.000 für 14 % Feststoffgehalt, 275 für 10 % Feststoffgehalt und 30 für 5 % Feststoff gehalt. Superlose 300 ist in Wasser bei Zimmertemperatur leicht löslich, im Gegensatz zu den meisten Stärken, welche einiges umrühren und/oder Erwärmen benötigen, bevor sie in Lösung gehen. Superlose 300 wird aus der modifizierten Amylosefraktion von Kartoffelstärke hergestellt und enthält keinen nennenswerten Anteil der Amylopectinfraktion von Stärke.

"GR brand starch" ist der Handelsname einer anderen

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Stärke, die eich zur Verwendung gemäß der bevorzugten Ausführungeform der Erfindung eignet. Diese GR brand etarch wird von der Firma E. Merck Company, Elmsford, New York, vertrieben und von der Firma Nerck European, Darmstadt, Deutschland, hergestellt. Diese Stärke wird vor der Anwendung dialysiert und besitzt die folgenden Eigenschaften: maximale Sulfatasche von 7 Gew.#; 10 % Gewichtsverlust beim Trocknen; 1 g GR-Stärke besitzt ein Reduktionsvermögen äquivalent 7 mg Maltose; pH-Vert zwischen 6,5 und 7» 5» sowie günstige Werte im Empfindlichkeitstest.

Für die Zwecke der Erfindung ist es erforderlich, daß die Alpha-Amylasemenge geschwindigkeitsbegrenzend ist. Daher sollen die anderen Bestandteile des Reagenzsystems gemäß der Erfindung in solchen Mengen vorliegen, daß gewährleistet ist, daß die für das gesamte Analysesystem beobachtete und gemessene Reaktionsgeschwindigkeit charakteristisch für die Geschwindigkeit der durch die Alpha-Amylase katalysierten Reaktion (Reaktion I) ist und durch diese bestimmt wird. Für die Analyse wässriger Lösungen von menschlichem Blut oder Urin ist eine Konzentration im Bereich von etwa 1,0 bis etwa 20 g eines Alpha-1,4 gebundenen Glueans pro Liter Reagenz vorzuziehen. Eine Glucankonzentration von etwa 5 S P^r<> Liter Reagenz wird für die bevorzugte Ausführungsform verwendet.

Zu der zweiten gemäß der Erfindung Anwendung findenden Reaktion:

(II) Alpha-Maltose + Phosphat
Glucose + Beta-D-Glu-1-P

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Die bei der ersten Reaktion gebildete Alpha-Haltοse wird mit Phoephationen zur Reaktion gebracht, unter Verwendung von Maltose-Phosphorylase als enzymatischer Katalyeator zur Erzeugung von Glucose und Beta-D-Glucose-1-Phosphat.

Die Phosphationen werden dabei aus einer mit dem erfindungsgemäßen Reagenzsystem kompatiblen Quelle zugeführt. Beispiele einer derartigen geeigneten Quelle sind anorganische Phosphate. Die gemäß der bevorzugten Aueführungsform der Erfindung verwendete Phosphatkomponente iet ein Gemisch aus KgHPO^ und KHoFO*.; dieoeo bildet bei einem pH-Wert von etwa 6,5 eine gepufferte Lösung als Optimum.

Die Konzentration der Phosphationen eoll einen Wert besitzen, der gewährleistet, daß Alpha-Amyiase die geschwiiidigkeitsbegrenzende Verbindung ist. Jedoch ist eine zu hohe Konzentration von Phoephationen unerwünscht, da sehr hohe Konzentrationen die Aktivität dee Beta-FGM Üuizyms inhibieren können. Vorzuziehen ist eine etwa 0,01 bis etvn 0,1 molare Konzentration an anorganischem Phosphat; eine Konzentration von etwa 0,025 molar ist für die Analyse von Serum der vorteilhafteste Wert.

Maltosephosphorylase 1st ein die Reaktion von Alpha-Maltose und anorganischem Phosphat katalysierendes Enzym. Wenigstens 200 Internationale Einheiten (IU) dieses Enzyme pro Liter Reagenz sind erforderlich, der bevorzugte Wert ist etwa 2.000 IU pro Liter.

Die bevorzugte Quelle für Maltose-Phosphorylase ist ein Stamm les Mikroorganismus Lactobacillus brevis. (/!TCC8287); dieeer Mikroorganismus wurde von der Firma Beckman

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Instrumente, Inc., Microbics Operatione in Carlebad, California, gezüchtet und hieraue das Enzym nach herkömmlichen Methoden extrahiert und gereinigt. Anderweitige Quellen für dieses Enzym sind Stimm» von Heisseria meningitides« Heieieria perflava« sowie anderweitige Lactobacilli-Sti

Zu der dritten bei dem erfindungsgemäfien Analyseverfahren Anwendung findenden Reaktion:

(III) Beta-D-Glu-1-P Glu-6-P

Das Enzym Beta-Fhosphoglucomutase (Beta-FGM) katalysiert die Umwandlung von Beta-D-Glucose-1-Phoephat in Glucose-6-Fhosphat. Beta-Fhoephoglucomutaee soll in einer Menge von wenigstens 100 IU pro Liter Reagens vorliegen, so daß Alpha-Amylase in Reaktion I der geschwindlgkeitsbegrenzende Bestandteil bleibt. Zur Analyse von Alpha-Amylase in menschlichem Serum ist eine Anwendung von etwa 500 IU Beta-FGM pro Liter Reagens vorzuziehen. Die bevorzugte Quelle für Beta-PGM ist Lactobacillus brevis (ATCC8287). Sie Züchtung und Reinigung dieses Mikroorganismus erfolgt nach herkömmlichen Verfahren der Enzymreinigung· Weitere Quellen sind Stamm« von Jelsserla meningltides. Heisseria perflava und Buglena gracilis.

Vorzugsweise soll Gluoose-1,6-Diphoephat (6lu-1,6-diP) in dem Enzymsystem vorliegen, zur Wirkung als Cofactor bzw. Hilfestoff für Beta-FGM. Beta-FGM verlangt zur Wirksamkeit die Beta-Form von Glu-1,6-dlF, es darf Jedoch angenommen werden, daß auch die Alpha-Form dieses Cofactors wirksam wäre. Die bevorzugte Konzentration von Glu-1,6-dlP soll

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wenigstens etwa 0,01 g pro Liter Reagenz betragen. Die optimale Konzentration beträgt etwa 0,075 g pro Liter.

Des weiteren sollten vorzugsweise auch zweiwertige Kationen aus der Gruppe Mn⁺², Mg⁺², Co⁺², Zn⁺² oder Hi⁺² in dem Enzymsysteu vorliegen, als Cofactor für Beta-PGM. Die Kationen Mn⁺², Mg⁺² oder Co⁺² sind dabei gegenüber Zn⁺² oder Ni⁺ vorzuziehen· Die Cationenkonzentration sollte wenigstens etwa 1 Millimol pro Liter Reagenz betragen, vorzugsweise ist sie 8,4 Millimol pro Liter.

Zu der vierten, beim erfindungsgemäfien Verfahren verwendeten Reaktion:

(IV) G-6-P + NAD SSElS* 6-P-G + NADH

Das Glucose-6-Phosphat wird mit Beta-Nlcotinamid-Adenindinucleotid und G6PDH zur Reaktion gebracht, zur Bildung von 6-Phosphogluconat und NADH.

Die Menge NAD sollte dabei genügend groß sein, so daß Alpha-Amylase der geschwindigkeitsbegrenzende Bestandteil bleibt. Etwa 1 bis etwa 10 Millimol pro Liter Reagenz ist ein geeigneter Bereich für die NAD-Konzentration. Die bevorzugte NAD-Konzentration beträgt etwa 2,5 Millimol· Anstelle von NAD kann für die Zwecke der vorliegenden Erfin dung auch Beta-Niootinamid-Adenindinucleotidphosphat (NADP) verwendet werden·

Die Glucose-e-Phosphatdehydrogenase (G-6-PDH) soll ebenfalls in einer Konzentration von wenigstens etwa 500 IU pro Liter Reagenz vorliegen, damit diese Reaktion nicht

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geachwlndigkeitebegrenzend wird. Die bevorzugte Konzentration dee G-6-PDH-Bnzyme beträgt etwa 5·ΟΟΟ IU pro Liter Reagens. Die bevorzugte Quelle für G-6-PDH ist Leuconoatoc meeenteroides (iSCC 12291)« Jedoch kann ea auch aue anderweitigen Quellen erhalten werden.

GemäB der bevorzugten Aueführungeform der Erfindung iat die Anwendung einer fünften Reaktion als Teil dee Analyseverfahrene ervunecht:

(7) 6-P-G + HAD" Ribuloee-5-P + ΝΑΒΗ + CO₂

Zweck dieser fünften Reaktion iet eine Erhöhung der Empfindlichkeit und Genauigkeit der Analyse durch Erhöhung der erzeugten HADH-Henge.

Die Hindeatkonzentration von 6-PDH soll wenigstens etwa 200 Internationale Einheiten (IU) pro Liter Reagenz betragen. Sie optimale 6-PDH-Konzentration ist etwa 700 IU pro Liter. Die bevorzugte Quelle für dieses Enzym ist Leuconoetoc meeenteroidee (ATCC 12291)« aus welchen das Enzym nach herkömmlichen bekannten Methoden gezüchtet und gereinigt wurde; Jedoch kann ee auch aue anderweitigen Quellen erhalten werden.

Zur Erhöhung der Aktivität der Alpha-Amylase kann dem 3eagenzeyetem Natriumchlorid zugesetzt werden.

Zur Einetellung dee optimalen pH-Wertes für die Durchführung der Reaktioneeequenz können Puffer wie insbesondere dibaaiechee und monobaeiechee Kaliumphoephat (K₂HPO₄. bzw. KH₂PO₄.) verwendet werden. Auch Nicht-Phoephatpuffer können

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angewandt werden, sind jedoch weniger vorteilhaft, da Phosphatpuffer gleichzeitig eine Quelle für Phosphationen darstellen. Beispiele anderweitiger Puffer, die untersucht wurden und sich als zufriedenstellend erwiesen haben, sind Piperazin-N,N' -bis(2-Äthansulfonsäure), Tris(Hydroxymethyl)-Aminomethan, N-2-Hydroagräthylpiperazin-N' -2-Äthansulf onsäure, sowie Triäthanolamin. Beispiele anderweitiger, ebenfalls zufriedenstellender Puffer sind n-(2-Acetamido)iminodiessigsäure, n-(2-Acetamido)-2-aminoäthansulfonsäure, sowie N,N'-bis(2-Hydroxyäthyl)-2-Aminoäthansul fonsäure·

Die Geschwindigkeit der ΝΑΠΗ-Erzeugung und die Umwandlung dieser Geschwindigkeit in ein HaB für die Konzentration von Alpha-Amylase erfolgt nach an sich bekannten Methoden. Eine derartige Methode verwendet spektralphotometrische Vorrichtungen zur Messung der Änderung des Lichtabsorptionsvernögens Infolge der NADH-Bildung bei Wellenlängen im Bereich von etwa 300 bis etwa 370 Millimicron (mn) bei einer Temperatur im Bereich von etwa 15⁰C bis etwa 50⁰C. Die Vorzugswerte sind eine Wellenlänge von etwa 340 nm bei etwa 37°C

Nachdem das AusmaB bzw. die Geschwindigkeit der Änderung des Absorptionsvermögens gemessen wurde, kann die Konzentration der Alpha-Amylase nach der folgenden Gleichung berechnet werden, in welcher die Änderung des Absorptionsvermögens bei einer Wellenlänge von 340 nm und einer Temperatur von 37⁰C gemessen wurde:

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ΔΑχΤ.χ 1000 V

ΔΑ - Inderung dee Absorptionsvermögens/Minute

V^ * Geeamt-Reaktionsvolumen V₈ ■ das die Alpha-Amylase enthaltende Probenvolumen

6,22 - millimolarer Abeorptioneindex von NABH bei 340 mn.

Beispiel I Ansatz des Analysengemiechs für Alpha-Amylase

Im folgenden wird die Zusammensetzung des Reagenz gemäß der bevorzugten Aueführungsform der Erfindung angegeben, und zwar als 1 Liter Lösung in ent ionisiert em Wasser:

Superlose 500	5,00	ε
dibasisches Kaliumphosphat	2,65	g
monobasisches Kalium phosphat	1,33	β
Maltosephosphorylase	2000	IU
Beta-Phosphoglucomutase	500	IU
NAD«4H₂0	1,8	g

Glucose-6-Phosphat-

dehydrogenase 5000 IU

6-Phosphogluconat-

dehydrogenase 700 IU

MgCl₂-SH₂O 1,7 g

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Natriumchlorid 0,5 g

G-1,6-diP 0,075 g·

Ber pH-Wert wird auf etwa 6,0 bis etwa 7,5, vorzugsweise 6,5, eingestellt.

Bas erfindungsgemäBe Reagenzsystem kenn als wässrige Lösung gelagert und verwendet werden, alternativ kann die Lösung auch in herkömmlicher Weiee gefriergetrocknet und zur Gebrauchefertigkeit mit Wasser rekonstituiert werden. Bas Reagenzsystem kann auch mit den angegebenen Bestandteilen in Pulverform hergestellt werden und zur Gebrauchsfertigkeit in Wasser gelöst werden.

Bas Enzym Beta-Amylase, das im Unterschied von dem in Tieren auftretenden Enzym Alpha-Amylaee in Pflanzen vorkommt, katalysiert eine ähnliche Reaktion wie die erste Reaktion (I), nämlich die Hydrolyse von Alpha-1 ,^-gebundenem Glucan zu Beta-Maltose.

Im Fall eines Reagenzsysteme für eine Analyse von Beta-Amylase bestünde die einzige Modifikation des oben angegebenen Reagenzsysteme in der Zugabe des Enzyms Mutarotase zur Katalyse der Umwandlung von Beta-Maltose in Alpha-Maltose. Bie kinetische Beta-Amylase-Anolyse umfaßt daher die folgenden Simultanreaktionen:

(VI) Alpha-1,4 gebundenes Glucan Beta-Maltose

(VII) Beta-Maltose Alpha-Maltose

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(II) Alpha-Maltose + FO₄ 5 &* Glucose + Beta-D-G-1-P (III) Beta-D-G-1-P <j_6-P (IV) G-6-P + VAO 6-P-G + HAM

sowie gemäß einer bevorzugten Aueführungsform auch die folgende Reaktion:

(V) 6-P-G + VAD Ribulose-5-P + VAIE + CO₂

Ttir die vorstehend angegebene kinetische Analyse von Beta· Amylaee ist es erforderlich, dafi die vorhandene Menge Beta-Amylaee geschwindigkeitsbegrenzend ist· Die verschiedenen in dem Beta-Amylase-Reagenzsystem vorliegenden Reagensien liegen in gleicher Menge wie oben für den Fall des Alpha-Amylase-Seagenssystems beschrieben vor, mit dem einsigen Unterschied, daß dem Beta-Amylase-Reagenzsystem wenigstens etwa 2000 Einheiten, vorzugsweise etwa 60.000 Einheiten Mutarotaee pro Liter Reagens zugesetzt werden.

Die Grundgedanken der vorliegenden Erfindung eignen sich auch zur Anwendung für Analysen auf Phosphatasen und anorganisches Phosphat, indem man die für den Ablauf der ersten Reaktion vorgesehenen Bestandteile des erfindungsgemäßen Reagenzsystems wegläßt und noch die weiteren zusätzlichen Modifikationen in dem Reagenzsystem vorsieht:

Im Falle sowohl des kinetischen Reagenzsystems wie eines Endpunkt-Reagenzsystems für die Analyse auf anorganisches Phosphat werden Stärke und Phosphation aus dem angegebenen Reagenssystem fortgelassen und Maltose zugefügt.

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Sowohl die kinetische Analyse auf anorganisches Phosphat wie auch die Endpunktanalyse auf anorganisches Phosphat beruhen auf den folgenden Reaktionen:

(II*) Maltose + PO₄ s SE* Glucose + Beta-D-G-1-P (III) Beta-D-G-1-P g-6-P (IY) 0-6-P + NAD S2SL» 6-P-O +

Gemäß einer bevorzugten Aueführungsform der kinetischen Analyse auf anorganisches Phosphat kann auch die folgende Reaktion verwendet werden:

(V) 6-P-G + NAD Ribuloee-5-P + NADH + CO₂

Im Fall der Endpunkt-Analyse auf anorganisches Phosphat müssen Maltose und NAD (sowie, falls verwendet, KVDP) im molaren Überschuß über dem zu analysierenden anorganischen Phosphat vorliegen. Im Fall der kinetischen Analyse auf anorganisches Phosphat muß die Menge des anorganischen Phosphate geschwindigkeitsbegrensend sein.

Sowohl bei der kinetischen wie bei der Endpunkt-Analyse erfolgt die Bestimmung der Menge an Phosphatlon durch Messung der Bildung von NADH, NADFH oder Gemischen dieser als Folge der gekoppelten Eiusymreakt ionen gemäß der vorliegenden Erfindung· Im einzelnen erfolgt im Falle der Endpunkt-Analyse auf anorganisches Phosphat die Bestimmung der Phosphatlonen-Menge durch Messung der Gesamtmenge an durcta die gekoppelten Ensymreaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugtem NADH, NADPH oder Gemischen dieser; im

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Falle der kinetischen Analyse auf anorganisches Phosphat erfolgt die Bestimmung der Phosphationen-Menge durch Messung des Ausmaßes bzw· der Geschwindigkeit der Bildung von NAUH, NASPH oder Gemischen dieser bei den gekoppelten Simultan-Enzymreaktionen gemäß der Erfindung.

Sowohl die kinetische Analyse wie das Endpunkt-Analyseverfahren auf anorganisches Phosphat können bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis etwa 8 durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die kinetische Analyse auf anorganisches Phosphat bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 8, besondere bevorzugt bei einem pH-Wert von 7,M- durchgeführt. Der bevorzugte pH-Wert für die Endpunkt-Analyse auf anorganisches Phosphat beträgt etwa 7,0.

Sowohl beim kinetischen wie beim Endpunkt-Analyseverfahren auf anorganisches Phosphat kann das Beagenzsystem mit einem beliebigen Nlcht-Phoepatpuffer gepuffert werden, der einen pH-Wert von etwa 6 bis etwa 8 besitzt und mit den übrigen verwendeten Reagenzien kompatibel 1st. Beispiele derartiger Nicht-Phosphatpuffer sind: Piperazin-N,N'-bis-(2-lthansulfonsäure), N,N¹-bis(2-Hydro2yäthyl)-2-Aminoäthansulfonsäure, Triäthanolamin*HCl und Trie (Hydroxymethyl)amlnomethan. N,N-bis(2-Hydroayäthyl)-2-aminoUthansulfonsäure ist der bevorzugte Puffer zur Anwendung beim Reagenzsystem für die kinetische Analyse auf anorganisches Phosphat, Piperazln-N,N'-bis(2-äthaneulfoneäure) ist der bevorzugte Puffer zur Anwendung im Reagenzsystem für die Endpunkt-Analyse auf anorganisches Phosphat. In den nachfolgenden Beispielen 2 und 3 werden Seagenzsysteme für die kinetische bzw. für die Endpunkt-Analyse auf organisches Phosphat angegeben.

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Beispiel 2

Ansatz für das Gemisch zur kinetischen Analyse auf anorganisches Phosphat

Bestandteile
Nicht-Phosphatpuffer Haitose

zweiwertiges Kation Co-Enzym (NAD, NADP) Haltosephosphorylase Beta-Phosphoglucomutase 6-Phosphogluconat DH Gluoose-6-Phosphat DH Glucose 1,6-diP

Bevorzugte Henge 50 mH 13,9 mH 2 mH 2 mH 1,6 IU/ml 0,4 IU/ml 0,7 IU/ml 5 IU/ml 0,5 mH

Erforderliche Kindestmenge

10 mH 2 mH 0

0,1 mH 0,5 IU/ml 0,1 lU/ml 0,1 IU/ml 1 IU/ml 0

Beispiel 3

Ansätze für das Gemisch zur Endpunkt-Analyse auf anorganisches Phosphat

Bestandteile

Bevorzugte Erforderliche Henge Kindestmanne

Nicht-Phosphatpuffer	50 mH	10 mH
Haitose	13,9 mH	2 mH
Co-Enzym (NAD, NADP)	1,6 mH	0,1 mH
zweiwertiges Kation	2 mH	0

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Olucose 1,6-dlP 0,05 mM O Maltosephosphorylase 3 IU/ml 0,5 IU/ml Beta-Phosphoglucomutase 0,6 IU/ml 0,1 IU/ml Glucose-6-Phosphat DH 5 IU/ml 1,0 IU/ml

Im Falle eines Reagenzsysteme für eine Analyse auf säur ο Phosphatase werden Stärke und Phosphation aus dem Reagenzsystem fortgelassen und dafür organisches Phosphat und Maltose in das Reagenzsystem einbezogen· Zwar kann an sich jedes beliebige anorganische Phosphat verwendet werden, vorzugsweise wird das organische Phosphat jedoch aus der Gruppe Beta-glycerophosphat, Phenylphosphat, p-Nitropheiiylphosphat, CL-Naphthylphosphat, Adenosin-3' -Monophosphat, Thymophthaleinmonophosphat und Phenolphthalelnmonophosphat, sowie besonders bevorzugt Alpha-Naphthylphosphat, gewählt· Die kinetische Analyse auf saure Phosphatase umfaßt daher die folgenden Simultan-Reaktionen:

(VIII) organisches Phosphat (R-PO₄ δ) s-i-R

(II¹) Maltose + PO₄ a ^* Glucose + Beta-&-G-1-P (III) Beta-D-G-1-P

(IV) G-6-P + NAD 6-P-G + WLIB.

sowie gemäfi einer bevorzugten Aueführungeform auch die folgende Reaktion:

(V) 6-P-G + NAD Ribulose-5-P + NADH + C0_P

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Bei der vorstehenden kinetischen Analyse auf saure Phosphatase miß die Menge der sauren Fhosphatase geschwindigkeit sbegrenzend sein. Das organische Phosphat wird durch die saure Phosphatase zu Phosphat ion hydrolysiert. Das HaB und die Geschwindigkeit der Phoaphation-Preisetzung wird dann durch Messung der Bildungsgeschwindigkeit von NADH₁ HADFH oder Gemischen hiervon mit Hilfe der gekoppelten enzymatischen Reaktionen gemäß der Erfindung bestimmt. Der pH-Wert ist "bei der Analyse auf saure Phosphat aee im Bereich von etwa 4· bis unterhalb 7» vorzugsweise von etwa 4·,5 bis etwa 6, und besonders bevorzugt von etwa 5 bis etwa 6 gehalten. Das Reagenzsystem kann mit einem beliebigen Nicht-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 4 bis unterhalb 7 gepuffert werden, der mit den verwendeten Reagenzien kompatibel ist· Beispiele für derartige Nicht-Phosphatpuffer sind Natriumeitrat, Natrium-Waeseretoff-Maleat sowie Natriumcacodylat. (Natriumeitrat ist der bevorzugte Puffer zur Verwendung in dem Reagenzsystem für die kinetische Analyse auf saure Phosphat aee.) Das Reagenzsystem für die Analyse auf saure Phosphatase ist in demnachfolgenden Beispiel 4· zusammengestellt.

Beispiel Ansatz des Analysengemischs für saure Fhosphatase

Bevorzugte Erforderliche Bestandteile Menge Mindestmenge

Organisches Phosphat 1-5 mM 0,5 fflM Maltose 5-20 mM 2 mM Maltoeephoephorylaee 1-5 IU/ml 0,5 IU/ml

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-22--

, 31

β-Phosphogluconutase Co-Enzym (NAD, NAJIP) Glucose-6-Fhosphat IH zweiwertiges Cation Glucose-1,6-Diphosphat Nlcht-Fhosphatpuffer

0,3-2 IU/ml 0,1 IU/ml

0,2-4 oM 0,1 DH

2-10 IU/ml 1 IU/ml

1-5 mM 0

0,02-0,2 mM 0

0,02-0,05 M 0,01 M

Die Erfindung wurde vorstehend an Hand spezieller bevorzugter Beispiele beschrieben, die jedoch selbstverständlich in Einzelheiten abgewandelt werden können, ohne daß hierdurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

!fassung

Die Erfindung betrifft die kinetische Analyse zur Messung des Alpha-Amylasegehalts in wässrigen Lösungen, sowie auch Analysen sur Messung des Gehalte an Beta-Amylase, anorganischem Phosphat und saurer Phosphatase in wässrigen Lösungen.

Die Analyse auf Alpha-Aaylaaegehalt beruht auf den folgenden Reaktionen:

I. Alpha-1,4 gebundenes Glucan Maltose

II Alpha-Maltose + PO₄ s IE* Glucose + Beta-D-G-1-P

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Ill Beta-D-G-1-P α-6-Ρ
IV α-6-Ρ + HAD 6-Ρ-Ο +

Die Bestimmung dtr Konzentration von Alpha-Amylase erfolgt in der Weise, daß man die Geschwindigkeit des mit der Bildung von HAIS verbundenen Anstiegs des Absorptionsvermögens als NaB für die Aktivität von Alpha-Amylaee Bißt.

Die Erfindung betrifft auch ein Reagenzsystem für die Analyse; dieses Beagenssystem weist folgende Bestandteile auf:

ein Polysaocharid mit in der Hauptsache durch Alpha-1,4-Bindungen gebundenejiGlucosemolekülen

Haltose-Phosphorylase (HP)
Phosphatieren (PO4»)

Beta-Hiootinamid-Adenindinuoleotid (HAD) oder Beta-Hiootinamid-Adenindinuoleotidphosphat

Beta-D-Phosphoglticomutase (Beta-PGH) Gluoose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) ·

Die kinetische Analyse auf Beta-Amylase beruht auf den obengenannten Reaktionen II bis IV und zusätzlich den folgenden Reaktionen:

VI Alpha-1,4 gebundenes Glucan seta-Haltos VII Beta-Maltose Alpha-Maltose.

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Die kinetische Analyse auf saure Phosphatase beruht auf den obengenannten Reaktionen III und IV und susätslich den folgenden Reaktionen:

• VIII saure Fhosphatase + organisches Phosphat —» PO₄. '

II* Maltose + PO₄ - &» Glucose + Beta-D-G-1-P

Die Erfindung betrifft neben den kinetischen auch Endpunkt-Analysen. Sowohl die kinetische wie auch die Endpunkt-Analyse auf anorganlsohes Phosphat beruhen auf den obengenannten Reaktionen III und IV sowie zusätzlich der Reaktion II'.

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche

Analyseverfahi^n für Alpha-Amylaae, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrenssohritte:

(a) Durchführung der folgenden Simultan-Reaktionen:

(i) Beaktion eines Polysaccharide mit hauptsächlich durch Alpha-1,4-Bindungen gebundenen GlucosemolekUlen in Gegenwart einer Alpha-Amylase enthaltenden Probe zur Bildung von Alpha-Maltose,

(ii) Reaktion von Alpha-Maltose mit Phosphat ionen in Gegenwart von Maltoeephosphorylase zur Bildung von Glucose und Beta-D-Glucoee-1-Phosphat,

(iii) Reaktion von Beta-D-Glucose-1-Phosphat in

Gegenwart von Beta-D-Phosphoglucomutaae zur

Bildung von Glucose-6-Phosphat

sowie

(iv) Reaktion von Glucose-6-Phoephat in Gegenwart von Gluoose-6-Phospnatdehydrogenaee und einem Co-Ensym aus der Gruppe Beta-Nicotlnamid-Adenindinucleotid, Bet a-Nicot inamid-Adenindinucleotidphosphat und Gemischen hiervon unter Bildung der reduzierten Form des Co-Enzyms und von 6-Phosphogluconat,

(b) Messung der Bildungsgeschwindigkeit des reduzierten Co-Enzyms, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die zu messende Alpha-Amylase geschwindigkeit sbegrenzend ist.

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ORIGINAL INSPECTED
2. Alpha-Amylaee-Analyae nach Anspruch 1, dadurch gekenn» zeichnet, daB daa Beta-D-Gluoose-1-Phosphat in Gegenwart einer Beta-D-Phosphoglucomutase und von Glucose-1,6-diphosphat unter Bildung von Glucoae-6-phoephat zur Reaktion gebracht wird.
3· Alpha-Amylaee-Analyse nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß daa Beta-D-Glucoee-1 -Phosphat in Gegenwart von Beta-D-Phosphoglucomutase, Glucose-1,S-diphosphat sowie einen Kation aus der Gruppe Mn , Mg*², Co⁺², Zn⁺², Hi⁺² sowie Gemischen hiervon unter Bildung von Glucose-6-Phosphat zur Reaktion gebracht wird.
4. Alpha-Anylase-Analyse nach einen oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3· dadurch gekennzeichnet, daß man 6-Phosphogluconat in Gegenwart des Co-Enzyms und von 6-Phosphogluconatdehydrogenase zur Reaktion bringt unter Bildung der reduzierten Vorn des Co-Enzyms und von Ribulose-5-Phoephat·
5. Alpha-Amylase-Analyse nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sinultan-Reaktionen bei einem pH-Wert in Bereich von etwa 6 bis etwa 7»5» vorzugsweise bei etwa 6,5t ausführte

»o
6. Analyseverfahren für anorganisches Phosphat, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensechritte:

(a) Durchführung der folgenden gekoppelten Reaktionen bei einen pH-Wert von etwa 6 bis etwa 8:

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(i) Reaktion von Maltose nit einer anorganisches Phosphat enthaltenden Probe in Gegenwart von Maltoaephosphorylaee unter Bildung von Glucose und Beta-D-Glucoee-1-Phosphat,

(ii) Reaktion von Beta-D-Glucoee-1-Phosphat in Gegenwart von Beta-D-Phosphoglucomutase unter Bildung von Glucoee-6-Phosphat, sowie

(iii) Reaktion von Glucoee-6-Phosphat in Gegenwart von Glucose-6-Phosphatdehydrogenase und einem Co-Enzym aus der Gruppe Beta-NicotJnamid-Adenindinucleot id , Beta-Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat und Gemischen hiervon, zur Bildung der reduzierten Form des Oo-Eazyme und von 6-Phosphogluconat,

(b) Messung der Bildung des reduzierten Co-Enzyma,

su

wobei das/bestimmende anorganische Phosphat \l*n begrenzenden Bestandteil in dem Simultan-Reaktionasyete« bildet und der pH-Wert mit einem Nicht-Phosphatpuffer eingestellt und kontrolliert wird.
7· Analyse auf anorganisches Phosphat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Beta-D-Glucoee-1-Phosphat in Gegenwart einer Beta-D-Phoephoglucontutase und von Gluooee-1,6-diphosphat reagiert wird, unter , Bildung von Glucose-6-Phoephat. '
8. Analyse auf anorganisches Phosphat nach Anspruch 6 oder 7« dadurch gekennzeichnet, daß das Beta-D-Gluoose-1-Phosphat in Gegenwart von Beta-D-Phoephoglucomutase, Glucose-1,6-diphosphat und einem Kation

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aus der Gruppe lto⁺², Mg⁺², Oe⁺², Zn⁺², Hi⁺² und Gemischen hieraus cur Reaktion gebraoht wird, uncer Bildung von Gluooee-6-Phosphat·
9· Analyse auf anorganisches Phosphat nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtbildung von reduziertem Co-Enzym gemessen wird, und daß Maltose und das genannte Co-QiZTm im molaren Überschuß über dem zu bestimmenden anorganischen Phosphat vorliegen.
10. Analyse auf anorganisches Phosphat nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 9 t dadurch gekennzeichnet, daß die Bildungsgesohvindigkeit des reduzierten Oo-BoLzyms gemessen wird und die Bedingungen des Reektionssystems so eingestellt sind, daß das zu bestimmende anorganische Phosphat geschwindigkeitsbegrenzend ist.
11. Analyse auf anorganisches Phosphat nach einem oder mehreren der Ansprüohe 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man 6-Phosphogluoonat in Gegenwart von dem Co-fiizym und von 6-Phoephoglueonatdehydrogenase zur Reaktion bringt, unter Bildung der reduzierten Form des Co-Enzyms sowie von Ribulose-5-Phoephat und von
12. Analyseverfahren zur Bestimmung des Gehalts einer Probe an saurer Phosphataee, gekennzeichnet durch die Yerfahrenssohritte:

(a) Durchführung der nachfolgenden Simultan-Reaktionen

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bei einem pH-Vert im Bereich von etwa 4,5 bie etwa 6:

(1) Reaktion eine· organischen Phosphate aus der Gruppe Beta-Glyoerophosphat, Phenylphosphat, p-Vitrophenylphosphat, ▲lpha-Naphthylphoaphat, ▲denosln-3'>4!onophosphat_t Thymolphthaleinmonophosphat und Phenolphthaleinmonophosphat in Gegenwart von saurer Phosphatase unter Freisetzung von anorganischem Phosphat,

(ii) Reaktion von Kaltose mit Phosphationen in Gegenwart von Maltosephosphorylaee, unter Bildung von Glucose und Beta-D-Glueose-1-Phosphat,

(iii) Reaktion von Beta-D-Glucoae-1-Phosphat in Gegenwart von Beta-D-Phosphoglucomutase unter Bildung von Glucose-6-Phoephat, sowie

(Iv) Reaktion von Gluoose-6-Phosphat in Gegenwart von Gluoose-6-Fhosphatdehydrogenase und einem Co-Ensym aus einer Gruppe Beta-iico-

Beta-Jfiootinamid—

Adenindlnucleotidphosphat sowie Gemisohen hiervon, unter Bildung der redusierten form des 00-Ensyms und von 6-Phosphoglueonat,

(b) Hessen der Bildungegesohwlndigkeit des reduzierten Co-fiusgrms,

wobei die Bedingungen des Reaktionssystems so gewählt sind, daß die su bestimmende saure Phosphatase geschwindigkeit sbegrensend ist, und unter Verwendung

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•ines Vieht-Phosphatpuffere sur Einstellung und Kontrolle des pH-Vertee·
13· Analyse auf saure Fhospnatase nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, da£ das Beta-D-Glucose-1-Phosphat in Oegenwart von Beta-D-Phosphoglucomutase und Gluoose-1,6-diphosphat unter Bildung -von Glucose-6-Phoephat zur Reaktion gebracht wird.
14. Analyse auf saure Phosphataee nach Anspruch 12 oder 131 dadurch gekennzeichnet, daB das Beta-D-Glucose-1-Fhosphat in Gegenwart von Beta-D-Phosphoglucomutase, Glueoee-1,6-0iphosphat und einen Sation aus der Gruppe Ifa*², Mg⁺², Co⁺², Zn⁺², Hi⁺² und Gemischen hiervon zur Reaktion gebracht wird, unter Bildung von Glucose-6-Phosphat.
15· Analyse auf saure Phosphatase nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß »an 6-Phosphogluoonat in Gegenwart des Oo-Ehzyms und von 6-Phosphogluoonatdehydrogenase zur Reaktion bringt, unter Bildung der reduzierten form des Oo-Bizyms und von Ribulose-5-Phosphat.
16. Analyse auf saure Phosphatase nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 15t dadurch gekennzeichnet, daß die Simultan-Reaktionen bei eins« pH-Wert im Bereich von etwa 5,0 bis etwa 6 durchgeführt werden.
17· Reagenssyetem zur Durchführung der Alpha-Amylase-Analyse nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch

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(a) ein Polysaccharide mit In dar Hauptsache durch Alpha-1,4-Bindungen gebundenen Glucoeeuolekülen,

(b) Phosphat ionen,

(c) Maltosephosphorylase,

(d) ain Co-Ensym au« dar Gruppe Beta-Hicotinamid-Adenindinuoleotid, Beta-Niootinamid-Adenindinucleotidphoaphat sowie Gemischen hiervon,

(a) Gluooee-6-Phoephatdehydrogenase und

(f) Beta-D-Phosphogluoomutase,

vobai dia vorstehenden Bestandteile in solchen Mengen vorliegen, daB dia su baetimende Alpha-Amylaee geschwindigkeit sbegrensend ist·
18. Reagenssysten nach Ansprach 1, &ur Anwendung für eine Beta-ABylase-Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß es Busatslich su den Koaponenten (a) bia (f)

(g) Hutarotasa

enthält, wobei wiederum die angegebenen Bestandteile in solcher Menge vorliegen, daß sie su bestimmende Beta-Amylaae geechwindigkeitsbegrensend ist«,
19· Baaganssystem für dia Analyse auf anorganisches Phosphat nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 11, gekennzeichnet durch die folgenden Bestandteile:

(a) Maltose,

(b) Maltosephoephorylasa,

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-H-

(o) ein Co-Enzy* «α· der Gruppe Beta-Nicotinamid-Adenindinucleotid, Beta-Hieotinamid-Adenindinucleotidpnospnat sowie Gemischen hiervon,

(d) Glucoee-6-Phoephatdehydrogenaee,

(e) Beta-D-Phosphoglucomutaee,

wobei die vorstehend angegebenen Komponenten jeweils in solcher Menge vorliegen, daß das zu bestimmende anorganische Phosphat die begrenzende Komponente darstellt, sowie

(f) einen Nicht ^Phosphatpuff er mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis etwa 8,
20. Reagensaystem nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus der Gruppe Piperazin-N,F·- bis(2-lthaneulfons&ure), *,N-bis(2-H^roxyäthyl )-2-Amlno&thaneulfons&ure, Triethanolamin· HCl und Tris-(HydroxymethyD-ABinomethan gewählt ist.
21. Beagenssysten nach Anspruch 19 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien jeweils in solcher Menge vorliegen, daß das zu bestimmende anorganische Phosphat geschwindigkeitsbegrensend ist, derart, daß das Beagenssjstem ein kinetisches Analyaereagenzsystem bildet.
22. Beagenseystem nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dafi die Maltose und das Co-Ensym in molarem Überschuß über dem su bestimmenden anorganischen Phosphat vorliegen, derart, daß das Reagenz «yet em ein

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- ie -

Endpunkt-Analyse-Reagenzsystem bildet·
23. Reagenzsystem für eine Analyse auf saure Phosphatase gemäß den Ansprüchen 12 bis 16, gekennzeichnet durch die folgenden Komponenten:

(a) Haitose,

(b) ein organisches Phosphat aus der Gruppe Beta-Glycerophosphat, Phenolphosphat, p-Nitrophenolphosphat, Alpha-Naphthylphoephat, Adenosin-3¹-Honophosphat, Thymolphthaleinmonophosphat und Phenolphthaleinmonophosphat,

(c) Maltosephosphorylase,

(d) ein Co-Eazym aus der Gruppe Beta-Nicotinamid-Adenindlnucleotid, Beta-Nicotlnamid-Adenindinucleotldphosphat sowie Genlsehen hiervon,

(e) Glucose-6-Phoephatdehydrogenase,

(f) Beta-D-Phosphoglucoautase,

wobei die vorstehend angegebenen Komponenten jeweils in soloher Menge vorliegen, daß die su bestimmende saure Phosphatase geschwindigkeitsbegrensend ist, und

(g) ein nicht-phosphatnaltiger Puffer mit einem pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 6·
24·· Beagenssystem nach Anspruch 23· dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus der Gruppe Natriumeitrat, Hatriumhydromaleat und Natriumcacodylat gewählt ist·

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27U5859
25· Reagenssystem nach, eine« oder mehreren der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennseloanet« daB es de· weiteren Gluooae-1,6-Dlpnosphat enthält.
26· Beagenssystem nach Anepruoh 25, dadurch gekennzeichnet, daB ea dee weiteren 6-Phosphogluoonatdehydrogena~ ee enthält.
27· Beagensaystea nach Anepruoh 25 oder 26, dadurch gekennielohnet, daB es dee weiteren ein Kation aus der Gruppe Hn⁺², Ife*², Co+², Zn⁺², Hi⁺² und Gemischen hiervon, vorsugsweise ein Cation aus der Gruppe Mg , Mn⁺², Co⁺² und Gemischen hieraus, enthält.
28. Beagensayetem nach einem oder mehreren der Ansprüche 25 bie 27, dadurch gekennseiohnet, daB das Glucose-1,6-Uphosphat im wesentlichen aus der Beta-form besteht.

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