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Mittel gegen Rhinovirus
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Die Erfindung bezieht sich auf Mittel zur Verhütung oder zur Behandlung
von Rhinovirusinfektionen. Durch diese Mittel, die ein substituiertes Thiozolylphenylguanidin
und einen pharmazeutischen Trägor enthalten, wird das Wachstum des gewöhnlichen
Erkältungsvirus (Rhinovirus) inhibiert.
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Die gegen Rhinovirusinfektionen wirksamen Thiazolylphenylguanidine
können durch folgende Formel wiedergegeben werden:
worin R Wasserstoff oder Chlor und R' Wasserstoff, Fluor, Chlorr oder eine Alkyl-,
Carboxyl- oder Carbalkoxygruppen bedeuten, wobei die Alkylgruppen jeweils 1 bis
4 Kohlenstoffatome enthalten.
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Die erfindungsgemäßen Mittel können als Wirkstoff auch die pharmazeutisch
annehmbaren Säureadditionssalze der Verbindungen der oben angegebenen allgemeinen
Formel enthalten.
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Zu diesen Salzen gehören die Hydrochloride, Sulfate, Nitrate, Hydrobromide,
Maleate, Tartrate und Benzoate. Diese Salze werden in üblicher Weise durch Umsetzung
der Basen mit einer Säure hergestellt.
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Die Wirkstoffe der erfindungsgemäßen Mittel werden nach folgendem
Verfahren hergestellt:
worin R und R' die obige Bedeutung besitzen.
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Das Diäthylaminsalz von N-Cyanthioharnstoff (1) (J. Organic Chen.
Bd. 17, S. 1494 (1953)/wird mit einem alpha-Halogenacetophenon (II) in Methanol
zum Sieden unter Rückfluß erwärmt, wodurch ein 4-Phenyl-2-thiazolyl-2-carbamonitril
(III) entsteht, das dann mit Anilin oder einem substituierten Anilin in Xthanol
beim Sieden unter Rückfluß zu dem 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-phenylguanidin (IV)
umgesetzt wird.
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Die beschriebenen Verbindungen und ihre pharmazeutisch annehmbaren
Säureadditionssalze können nach auf dem Gebiet der Pharmazie allgemein bekannten
Methoden zu antirhinoviralen Präparate verarbeitet werden. Sollen die Präparate
oral verabreicht werden, vorzugsweise in Form von Tabletten oder Kapseln, dann können
sie sowohl in üblicher Weise als auch so zubereitet werden, daß man Präparate mit
verzögerter Wirkstofffreigabe erhält. Auch die intranasale Anwendung ist eine bevorzugte
Form der Verabreichung; dabei werden vorzugsweise Suspensionen oder Lösungen verwendet,
die in das Nasalgewebe eingesprüht werden. Die erfindungsgemäßen Präparate können
schließlich auch durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht werden.
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Die Tabletten und Kapseln können nach an sich bekannten Methoden hergestellt
werden und können die üblichen pharmazeutischen Träger wie Saccharose, Stärke, Lactose
und Magnesiumstearat enthalten. Diese oralen Präparate werden in 2 bis 4 Dosen von
50 bis 400 mg Wirkstoff pro Dosis verabreicht, was sich auf etwa 100 bis 1600 mg
pro Tag beläuft. Die Intranasalpräparate werden am besten als 0,5 bis 10-prozentige
Suspension in Form eines Sprühmittels oder von Nasentropfen mehrmals am Tag angewandt.
Die injiziebaren Zubereitungen werden einmal mit einer Konzentration von 0,5 bis
2,0 mg/kg Körpergewicht angewandt.
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Die Präparate werden vorzugsweise vor einer Rhinovirusinfektion an
Warmblüter verabreicht, um die Infektion zu verhüten oder abzuschwächen, wenn die
Infektionsgefahr
bekannt geworden ist, oder aber nach dem Auftreten
von Symptomen zur Behandlung der Infektion und zur Senkung ihrer Wirkungen auf ein
Minimum.
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Im folgenden wird als Beispiel eine Zubereitung für Tabletten, die
eine antirhinovirale Verbindung, zum Beispiel 1-(4-Phenylthiazolyl-2)-3-phenylguanidin
enthalten, wiedergegeben: antivirale Verbindung 250 mg Calciumcarbonat 150 mg Saccharose
88 mg Stärke 20 mg Magnesiumstearat 5 mg Eine beispielhafte Formulierung für Kapseln,
die die oben erwähnte antirhinovirale Verbindung enthalten, ist folgende: antivirale
Verbindung 250 mg Lactose 150 mg Magnesiumstearat 6 mg Eine beispielhafte Zubereitung
für ein intranasales Sprühmittel, eine dieselbe antirhinovirale Verbindung enthaltende
Suspension ist folgende: antivirale Verbindung 5,0 % Gew./Vol.
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Natriumcarboxymethylcellulose 1,0 % Natriumcitrat 0,2 % Kaliumbiphthalat
0,13 $ Eukalyptol 0,02 % Rudbeckia-Aroma 0,001 % gereinigtes Wasser .... q.s. auf
100
Andere Verbindungen der oben angegebenen allgemeinen Formel
können gleichfalls in Präparate dieser Art eingeführt werden.
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Die oben definierten Verbindungen wirken in vitro gegen die verschiedensten
Viren die Respirationserkrankungen verursachen, zum Beispiel gegen den gemeinen
Erkältungs-oder Rhinovirus.
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In Gewebekulturschalen aus Kunststoff gezüchtete zusammenfließende
Monoschichten aus einer zusammenhängenden Zellenanordnung, zum Beispiel HeLa, HEp-2,
KB oder L-132, werden mit einem Rhinovirus, zum Beispiel Typ 1B, 2, 5, 14 oder 23
oder einem anderen Vertreter der Picornavirusgruppe, zu der auch die Enteroviren,
wie Coxsackie A-11 und A-21 gehören, infiziert.
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Ein Schutz der Gewebe gegenüber den cytopathischen Wirkungen der Viren
kann auf einem von zwei verschiedenen Wegen festgestellt werden: Entweder durch
eine Inhibitionsprüfung, bei der die zu prüfende Verbindung nach Adsorption an einer
Filterpapierscheibe auf den Agar, der als Deckschicht auf die infizierte Zellenmonoschichten
aufgebracht wurde, gelegt wird, oder durch eine solche Prüfung, bei der die Verbindung
in diese Agardeckschicht eingeführt wird. Das für die Deckschicht verwendete Agarmedium
hat folgende Zusammensetzung: Minimalwirkstoff-Medium (Eagle), das Earles-Salze
(Grant Island Biological Co., Grand Island, N.Y.) enthält, versetzt mit Ionagar
Nr. 2 0,4 % Diäthylaminoäthyldextran 0,01 % Magnesiumchlorid 0,06 % Fötalserum (Kalb)
2,0 % Vol./Vol.
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Die virusinfizierten Zellenmonoschichten plus Prüfverbindung werden
3 bis 5 Tage bei 33 OC in einer 5 % Kohlendioxid enthaltenden Atmosphäre eines Befeuchtungsgeräts
inkubiert. Das Vermögen dieser Verbindungen, Gewebe gegen die Zerstörung durch Viren
zu schützen, wird nach Färben der verbliebenen nichtinfizierten Zellen mit 0,5 %
Kristallviolett in 20-prozentigem ethanol evident. Die erhaltenen Ergebnisse sind
in der Tabelle I zusammengestellt.
T A B E L L E I Rhinovirus-Stänme
Verbindung 2 5 14 23 1B 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-phenylguanidin + + + + + 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-(3-chlorphenyl)-
+ guanidin 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-(4-carbomethoxy)- + + # phenylguanidin 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-(p-tolyl)-
+ + + + + guanidin 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-(4-fluor- + + + boxyphenyl)-guanidin
1-[4-(4-Chlorphenyl)]-2-thiazolyl)-3- + + (p-tolyl)-guanidin + = völliger Schutz
gegen Gewebszerstörung durch das Virus # = teilweiser Schutz
Pur
Plattenprüfungen zur Bestimmung der minimalen inhibierenden Konzentration (MIC)
wird 1-(4-Phenylthiazolyl-2-)-3-phenylguanidin in Dimethylsulfoxid oder Polyäthylenglycol
400 in Mengen von 100 bis 250 mg/ml gelöst oder in gleichen Mengen mit Kulturmedium
homogenisiert. Doppelreihenverdünnungen mit dem Kulturmedium oder dem entsprechenden
Lösungsmittel werden hergestellt, und aliquote Anteile jeder einzelnen Verdünnung
werden in das Kulturdeckschichtmedium in der gewünschten Wirkstoffkonzentration
eingebracht. Im Fall von Wirkstoff lösungen liegt eine konstante Endkonzentration
von 0,04 % in Dimethylsulfoxid oder von 0,2 % in Polyäthylenglycol in dem Kulturdeckschichtmedium
vor.
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Zur Bestimmung der MIC (der Konzentration des Wirkstoffs, die die
Virusplattenbildung um 50 % inhibiert) werden Plattentests mit HeLa, Zellen, die
mit 100 bis 300 plattenbildenden Einheiten von Rhinovirus, Poliovirus oder Coxsackievirus
infiziert sind, durchgeführt. Nach der Virusadsorption werden 10 ml Agardeckschichtmedium
in jede Schale gegeben, das 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-phenylguanidin enthält. Mit
Rhinovirus infizierte Kulturen werden 4 bis 5 Tage bei 33 OC inkubiert. Mit Polio-
und Coxackievirus infizierte Kulturen werden 2 bis 4 Tage bei 37 OC inkubiert. Nichtinfizierte
Kulturen, die allein den Wirkstoff enthalten, und Kulturen, die allein Dimethylsulfoxid
oder PolyäthylEnglycol 400 enthalten, werden als Blindproben in die Prüfungen eingeschlossen.
Nach dem Ende des Inkubierens werden die Kulturen mit 0,1 % Kristallviolett in 20-prozentigem
Xthanol gefärbt und die Platten werden gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II
zusammengestellt.
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T A B E L L E II Minimale inhiobierende Konzentration (ug/ml) HeLa-Zellen
L-132-Zelleen Detroit-6-Zellen Rhinovirus Serotyp 1A 0,2-0,4 1B 0,8-1,6 0,8 2 0,4-0,8
0,4-0,8 0,4 3 0,4-0,8 5 0,4-0,8 12 0,2-0,4 14 0,8-1,6 20 0,4 23 0,2-0,4 0,4-0,8
32 0,4 39 0,4 50 0,2-0,4 52 0,4 Coxsackievirus A-5 0,4 A-11 1,6-3,1 A-15 1,6-3,1
A-21 1,6-3,1 A-22 1,6-3,1 B-1 1,6-3,1 B-2 0,8-1,6 B-5 0,8-1,6 Poliovirus Typ 1 0,8
Bei
der Prüfung der Virusempfindlichkeit nach der Filterscheibenmethode werden 5 mg
1-(4-Phenylthiazolyl-2)-3--phenylguanidin in 1 bis 2 Tropfen Dimethylsulfoxid und
2,5 ml Kochsalzlösung gelöst. Die Filterpapierscheiben absorbieren bis zur Sättigung
mit der Lösung etwa 50 ug der Verbindung.
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Die Empfindlichkeitsprüfungen werden mittels einer Modifikation der
Methode von Herrmann, et al., Proc. Soc.
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Exp. Biol. & Med., Bd. 103, S. 625 (1960) vorgenommen.
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HeLa-Monoschichten in 150 mm Kunststoffschalen werden mit 1,0 ml Rhinovirussuspension
infiziert, die erfahrungsgemäß in 4 bis 5 Tagen zur Zerstörung von 80 bis 90 % der
Zellen führt. Nach der Virusabsorption werden die Zellen mit 30 ml Minimalwirkstoffmedium
nach Eagle, das 0,5 z Nobelagar, 2,0 % Fötalserum (Rind), 100 ug/ml Diäthylaminoäthyldextran
und 3 mMol Magnesiumchlorid enthält, beschichtet. Filterscheiben (6,35 mm Carl Schleicher
und Schuell Co., No. 740E), die etwa 50 ug 1-(4-Phenylthiazolyl-2)-3-phenylguanidin
enthalten, werden auf die fest gewordene Oberfläche gelegt, und die Kulturplatten
werden bei 33 OC inkubiert. Nach 4 bis 5 Tagen wird das Beschichtungsmedium abdekantiert,
und die Zellen werden mit 0,1 % Kristallviolett in 20-prozentigem Xthanol angefärbt.
Eine Zone von 10 mm oder mehr, in der wenigstens 2/3 der Zellen von den viralen
cytophatischen Wirkungen verschont blieben, zeigt antivirale Wirksamkeit an. In
der folgenden Tabelle III sind 35 Rhinovirusserotypen aufgeführt, die durch diese
Verbindung inhibiert werden.
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T a b e 1 1 e III Rhinovirus-Typ Stamm 1B B632 2 HGP 4 16/60 5 Norman
9 211CV13 10 204CV14 11 1CV15 12 181CV16 13 353 14 1059 15 1734 16 11757 19 6076CV18
21 47CV21 22 127CV22 23 5124CV24 24 5146CV25 25 5426CV26 26 5660CV27 28 6101CV29
29 179E 30 106F 31 140F 34 137-3 36 342H 38 CH79 41 56110 45 Baylor 1 46 Baylor
2 47 1979CV46 49 8213 50 A2 No. 58 51 605CV45 52 515-CV34 53 FO13928
Virusausbeute-Verringerungstest
Bei einem Test zur Bestimmung der Virusausbeute wird 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-phenylguanidin
in Minimalwirkstoffmedium nach Eagle eingefithrt, das mit 2,0 % Rinderfötusserum
ergänzt ist. HeLa-Zellen-Monoschichten in 60 mm Schalen werden während und nach
der Infektion mit Rhinovirusserotyp 1B in einer Virusmultiplizität von 1, 6 Stunden
lang diesem Wirkstoff in dem genannten Medium ausgesetzt. Mit Wirkstoff behandelte
Kulturen und Blindproben werden dreimal gewaschen und für die restliche Bebrütungsdauer
wird Medium ohne Wirkstoff zugegeben. Die Virusausbeuten werden durch Plattenprufung
von Kulturflüssigkeiten bestimmt, die 24 bzw. 48 Stunden nach der Infektion entnommen
werden. Die Ergebnisse dieser Prüfung, die eine signifikante Inhibition von Rhinovirus-Typ
1B zeigen, was sich aus der Unterdrückung von 1 bis 2 log Virusausbeute in mit 0,4
bis 0,8 ug/ml des Wirkstoffs 24 Stunden behandelten Kulturen ergibt. Diese Ergebnisse
sind in Tabelle IV zusammengestellt.
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T a b e l l e IV Wirkstoffdosis Dauer der Einwirkung des Wirk- Platten
bildende Einheiten/ml (log 10) ug/ml stoffs auf die Zellen+ 24 Stunden 48 Stunden
6,2 0 Stunde bis +6 Stunden 5,8 6,1 3,1 5,5 6,1 1,6 5,5 6,2 0,8 5,7 6,3 0,4 5,2
5,8 0,0 7,0 7,0 12,5 +1 Stunde bis +7 Stunden 3,8 5,2 6,2 4,5 5,6 3,1 4,7 6,3 1,6
5,4 6,6 0,8 6,0 7,4 0,4 6,4 7,1 0,0 7,0 7,2 +HeLa-Zellen werden mit Virus bei einer
Multiplizität von 1 vom Zeitpunkt 0 ab 1 Stunde adsorbiert. Der Wirkstoff wird zunächst
in Dimethylsulfoxid oder Polyäthylenglycol 400 löslich gemacht und während oder
1 Stunde nach der Virusadsorption zugegeben und dann nach 6 Stunden entfernt, wonach
die Monoschichten dreimal mit Medium gewaschen werden.
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Die Verbindung 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl) -3-phenylguanidin ist außerdem
wirksam gegenüber einem breiten Spektrum von Rhinoviren und anderen Picornaviren,
unter anderem Coxsackie-und Poliovirus in Kulturen menschlicher Zellen. 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-phenylguanidin
fiihrt zur konzentrationsabhängigen Inhibierung von Viruswachstum, was durch inhibitorische
Wirkungen auf Virusplattenbildung und Virusausbeute bestimmt werden konnte. Die
Verbindung ist in gleichem Maße wirksam gegen Rhinoviren in drei verschiedenen menschlichen
Epithelzellanordnungen (Hela, L-132 und Detroit-6).
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
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Beispiel 1 Herstellung von 4-Phenyl-2-thiazolcarbamonitril Eine Mischung
aus 20 g (117 mMol) Diäthylamin-N-cyanthioharnstoff LR.L.rtcKee und J.D. Thayer,
J. Organic Chem.
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Bd. 17, S. 1494 (1953)/, 18,2 g (117 mMol) Phenacylchlorid und 90
ml Methanol wird 15 Minuten zum Sieden unter Rückfluß erwärmt, wobei sich zunächst
alles löst und sich dann ein neugebildeter Feststoff abscheidet. Durch Abkühlen
und Filtrieren erhält man 19,8 g des Produkts vom F. = 177 bis 1790C (dunkelgrüne
Schmelze).
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Beispiel 2 Herstellung von 4-<4-Chlorphenyl) -2-thiazolcarbamonitril
Die in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise wird unter Verwendung von 4-Chlorphenacylchlorid
anstelle des Phenacylchlorids wiederholt. Das Produkt hat einen Schmelzpunkt von
173 bis 176 OC (dunkelgrüne Schmelze).
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Beispiel 3 Herstellung von 1- (4-Phenyl-2-thiazolyl) -3-phenylguanidin
Eine Lösung von 19,8 g (100 mMol) 4-Phenyl-2-thiazolcarbamonitril und 10 ml (10,2
g, 110 mMol) Anilin in 350 ml Äthanol wird 8 Stunden zum Sieden unter Rückfluß erwärmt
und dann über Nacht abkühlen gelassen. Es werden 23 g Produkt vom F. = 179 bis 180
°C erhalten. Nach dem Umkristallisieren aus 550 ml Äthanol werden 19,5 g Produkt
vom F. = 180 bis 181 °C erhalten.
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Beispiel 4 Herstellung von 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-(3-chlorphenyl)-guanidin
Eine Lösung von 1,6 g (8 mMol) 4-Phenyl-2-thiazolcarbamonitril und 0,9 ml (1,1 g,
8,6 mMol) m-Chloranilin in 30 ml Äthanol wird 30 Stunden zum Sieden unter Rückfluß
erwärmt und dann über Nacht gekühlt. Es werden 0,7 g Produkt erhalten, dessen Umkristallisation
aus 5 ml Äthanol 0,45 g Produkt vom F. = 134 bis 135 °C liefert.
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Beispiel 5 Herstellung von 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-(4-carbomethoxyphenyl)-guanidin
Eine Lösung von 2,0 g (10 mMol) 4-Phenyl-2-thiazolcarbamonitril und 1,65 g (11 mMol)
Methyl-4-aminobenzoat in 40 ml Äthanol wird 30 Stunden zum Sieden unter Rückfluß
erwärmt und dann über Nacht gekühlt. Es werden 0,75 g Produkt erhalten, dessen Umkristallisation
aus 15 ml Äthanol 0,6 g Produkt vom F. = 189 bis 191 OC ergibt.
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Beispiel 6 Herstellung von 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-(4-fluorphenyl)-guanidin
Eine Lösung von 2,0 g (10 m?iol) 4-Phenyl-2-thiazolcarbamonitril und 1,24 g (10,5
=Mol) 4-Fluoranilin in 25 ml Äthanol wird 7 Stunden zum Sieden unter Rückfluß erwärmt
und dann über Nacht gekühlt. Es werden 1,4 g Produkt erhalten, dessen Umkristallisation
aus 8 ml Äthanol 1,0 g Produkt vom F. = 156 bis 158 °C liefert.
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Beispiel 7 Herstellung von 1-(4-Phenyl-2-thiazolyl)-3-(4-carboxyphenyl)-guanidin
Eine Lösung von 10,0 g (50 mMol) 4-Phenyl-2-thiazolcarbamonitril und 7,25 g (52,5
mMol) p-Aminobenzoesäure in 125 ml Äthanol wird 30 Stunden zum Sieden unter Rückfluß
erwärmt. Während dieser Zeit tritt ein Feststoff auf. Die Mischung wird
noch
heiß filtriert, wodurch 5,2 g Produkt erhalten werden, das aus 30 ml EssigsOure
umkristallisiert wird. Nach Trocknen in einer Abderhalden-Pistole bei 110 °C über
Nacht werden 5,1 g Produkt vom F. = 245 bis 247 OC erhalten.
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Beispiel 8 Herstellung von 1-(4-Phensl-2-thiazolyl)-3-(p-tolyl)-guanidin
Eine Lösung von 10,0 g (50 mMol) 4-Phenyl-2-thiazolcarbamonitril und 6,0 g (55 rlol)
p-Toluidin in 150 ml Äthanol wird 7 Stunden zum Sieden unter Rückfluß erwärmt und
dann über Nacht gekühlt. Es werden 11,5 g Produkt erhalten, das nach dem Umkristallisieren
aus 100 ml Äthanol 9,3 g Produkt vom F. = 152 bis 153 OC liefert.
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Beispiel 9 Herstellung von 1-[4-(4-Chlorphenyl)-thiazolyl-2]-3-(p-tolyl)-guanidin
Eine Lösung von 2,4 g (10 mMol) 4-(4-Chlorphenyl)-2-thiazolcarbamonitril und 1,2
g (11 mMol) p-Toluidin in 30 ml Äthanol wird 8 Stunden zum Sieden unter Rückfluß
erwärmt und dann über Nacht gekühlt. Es werden 2,7 g Produkt erhalten, das nach
dem Umkristallisieren aus 50 ml Äthanol und dann aus 20 ml Toluol 1,9 g Produkt
vom F. = 175 bis 177 OC liefert.