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Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von
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Blutplasma-Gerinnungsfaktorpegeln Die Erfindung betrifft ein Verfahren
und eine Vorricht;ung zur Bestimmung von Blutplasma-Gerinnungsfaktor-Pegeln einschließlich
Fibrinogen-Mengenbestimmung. Im besonderen betrifft die Erfindung ein Meßverfahren
und eine Meßtorrichtung dieser Art zur direkten Ablesung bestimmter Gerinnungsfaktorpegel
in Prozent Aktivität oder von Fibrinogen in Gewichtsprozent.
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Der sogenannte Prothrombin-Zeittest (P. T. Test) und der sogenannte
"aktivierte partielle Thromboplastin-Zeittest" (A. P. T. T. Test) sind herkömlich
verwendet klinische
Test zur Bestimmung des Gerinselbildungsvermögens
eines Patienten. Diese und anderweitige Tests finden in Erankenhäusern, Klinken
und Laboratorien in breitem Umfange Anwendung für unter anderem präoperative Untersuchungen
und im Rahmen der Anti-Koagulationstherapie für Patienten mit Herzkranheiten. Diese
erste beruhen sämtlich auf Zeitbestimmungen; zumeist wird in ihnen eine sogenannte
Endpunkt- oder Gerinnungszeit gemessen, d.h. diejenige Zeit, nach welcher Fibrinogen
zu Fibrin zu polymerisieren beginnt. Beispielsweise beträgt der "normale" Bereich
für einen A.P.T.T.-Endpunkt angenähert etwa 28 bis 4a Sekunden, und für einen P.T.-Endpunkt
angenähert etwa 11 bis 13 Sekunden. Dieser Normalbereich kann je nach den verwendeten
Reagentien schwanken. In allen Fallen werden dabei die Zeitdauer von der Zugabe
des letzten Reagens oder der letzten Chemikalie zu der Plasmalösung bis zu einem
bestimmten Punkt im Verlauf der Bildung von Fibrin aus Fibrinogen gemessen. Der
exakte Endpunkt hängt von dem jeweils verwendeten speziellen Instrument ab; bevorzugt
dient als Endpunkt jedoch der Beginn der Fibrinbildung gesäß der US-Patentschrlft
3 658 80.
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Es wurde einb Reihe von Instrumenten zur automatischen Messung der
Endpunktzeit entwickelt. Hierzu gehört das in der erwähnten US-Patentschrift 3 658
480 beschriebene Instrument. Bei dieser Apparatur wird ein Signal erzeugt, das den
Betrag der ersten Zeitableitung des zeitlichen Verlaufs der optischen Dichte entspricht,
sobald diese einen vorgegebenen Schwellwert als Nachweis für die beginnenae Fibrinbildung
überschreitet. In der US-Patentschrift 3 307 392 ist eine automatische Apparatur
zur Prothrombin-Zeitmessung beschrieben, bei welcher ebenfalls die erste Zeitableitung
der optischen Dichte eines
Blutplasmas in Abhängigkeit von der Zeit
bestimmt wird. In der US-Patentschrift 3 458 287 wird die zweite Zeitableitung des
zeitlichen Verlaufs der optischen Dichte gebildet, zur Feststellung, wann die erste
Zeitableitung ihr Vorzeichen ändert, als Anzeige für die Erreichung eines Scheitelwertes.
Zwar wird in allen diesen Patentschriften ein auf Zeitmessung beruhendes Instrument
beschrieben, Jedoch unterscheiden sich alle diese Instrumente in ihrer Wirkungsweise.
Die Apparatur nach der 115-Patentschrift 3 658 480 geht nicht auf einen Scheiteiwert
aus, wie dies in der US-Patentschrift 3 458 287 der Fall ist. Vielmehr bezweckt
die Apparatur gemäß der US-Patentschrift 3 658 480 die Bestimmung desjenigen Punktes,
wo das der ersten Zeitableitung entsprechende Signal einen um einen vorgegebenen
Betrag unterhalb dem Scheitelwert liegenden Wert übersteigt. Wesentlich in vorliegendem
Zusammenhang ist, daß bei allen diesen test und daher auch bei allen diesen und
anderweitigen Instrumenten stete die Zeit gemessen wird um das Blutgerinnungsvermögen
eines Patienten zu bestimmen.
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Der Erfindung liegt unter anderem die Erkenntnis zugrunde, daß die
Zeitbestimmung allein kein genaues Verfahren zur Bestimmung des Blutgerinnungsvermögens
des Patienten ißt, insbesondere unter traumatischen Bedingungen, wie beispielsweise
einer Unfallverletzung, einem Schock oder bei chirurgischen Operationen. Auch reicht
die Zeit allein nicht für genaue Bestimmungen der prozentualen Faktoraktivität oder
der Pibrinogenpegel im Blutplasma eines Patient ten aus. Durch die vorliegende Erfidnung
soll ein neues Verfahren und eine neue Vorrichtung für derartige Bestimmungen geschaffen
werden. Nach dem Grundgedanken der Erfindung werden diese Bestimmungen in Abhängigkeit
vom
Scheitelwert der ersten Zeit ableitung des zeitlichen Verlaufs
der optischen Dichte eines einer Gerinnung unterliegenden Plasmas vorgenommen. Der
Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß diese Beziehung für Fibrinogen linear
und für die Intrinsic-Faktoren VIII, IX, XI und XII sowie für die Extrinsic-Faktoren
II, V, VII und 1 logarithmisch ist und daß sie reprodusierbar ist.
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Der Prozeß der Blutkoagulation ist außerordentlich kompliziert. Allgemein
gesprochen umfaßt er die Erzeugung von Fibrinfasern, welche durch die Polymerisation
von als Fibrinogen bezeichneten Proteinmolekülen gebildet werden.
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Es ist bekannt, daß sich Prothrombin in Thrombin umwandelt, und nachdem
genügend Thrombin gebildet ist, wirkt es als Katalysator für die Umwandlung von
Fibrinogen zu Fibrin. Manche Autoritäten behandeln die Fibrinbildung in einer Stufen-
oder Kaekadenform. Zweckmäßigkeitshalber wird der Prozeß in drei untereinander abhängige
Phasen unterteilt. In der Phase I wird eine als Thromboplastin bezeichnete Substanz
gebildet, und zwar durch aufeinanderfolgendes Zusammenwirken bestimmter Blutfaktoren
(V, VIII, IX, 1, XI und XII) mit plättchenförmigem Lipid in Gegenwart von Calcium
(das sogenannte Intrinsic-System) oder durch die Einwirkung von Faktor VII auf Gewebe-Thromboplastin
(Faktor III). In der Phase II unterstützt das Thromboplastin, in Gegenwart der Blutfaktoren
V, VII und X sowie von Calcium, die Umwandlung des Prothrombins (Faktor II) in seine
aktive Form Thrombin. In der Phase III unter stützt das Thrombin enzymatisch die
Polymerisation von Fibrinogen zu Fibrin, welches die Substanz des Gerinsels bildet.
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Es sei an dieser Stelle betont, daß die vorliegende
Erfindung
sich ganz auf mit Thrombin gerinnungsfähiges Fibrinogen bezieht. Es mag andere Fibrinogenarten
geben, welche nicht durch Thrombin gerinnungsfähig sind. Diese Fibrinogenarten sind
bei der vorliegenden erfindung nicht in Betracht gezogen.
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Das Internationale Komitee für Blutgerinnung (International Committee
on Blood Clotting) geht davon aus, daß elf Gerinnungsfaktoren (I bis V und VII bis
XII) an dem Gerinnungsprozeß beteiligt sind, von denen die meisten enzymatischer
Natur sind. Ein neuer Faktor (Faktor XIII) wurde noch entdeckt und ist nunmehr ebenfalls
anerkannt. Man nimmt an, daß Fibrin durch diesen Faktor XIII stabilisiert wird.
Eine abnormale Blutkoagulation kann entweder von angeborenen quantitativen oder
qualitativen Defekten der zehn an dem Prozeß beteiligten Plasmafaktoren und--ton
irgendeiner erworbenen diese Faktoren betreffenden Erkrankungen oder von der Verabreichung
von Antikoagulationsmitteln herrühren. So ist beispielsweise bekannt, daß die klassische
Hämophilie von einem Mangel oder Fehlen des.
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Faktors VIII herrührt. Das Fehlen des Faktors IX führt zu einem hämophilioiden
Defekt (Hämophilie B, "Christmas Disease").
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Eine nähere Prüfung der verschiedenen bekannten Tests, wie etwa des
P.T.- und des A.P.T.T.-Test, hat gezeigt, daß die Messung der Zeit zur Bestimmung
des Vorliegens und des relativen Aktivitätspegels eines Plasmagerinnungsfaktors
bestenfalls ein ganz grober Test ist. So vermag gemäß eine Verlängerung der Zeit
nur das Vorliegen eines oder mehre-' rer abnormaler Faktorpegel anzuzeigen, ohne
Hinweis darauf, um welchen Faktor es sich handelt. Die ofloimg der Zeit bis zum
Auftreten eines Endpunkts wird Jedoch nicht
notwendigerweise die
Herabsetzung eines Plasmafaktorpegels anzeigen, insbesondere falls die Zeit im "normalen"
Bereich liegt. Bestimmte Zeitwerte sind nicht absolut.
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"Standard"-Zeiten oder Bereiche unterliegen Schwankungen von Laboratorium
zu Laboratorium, von Testverfahren zu Testverfahren und je nach dem verwendeten
Reagens. In einem der weiter unten beschriebenen Beispiele zeigt beispielsweiee
ein A0P.T.T.-Test eine Endpunktzeit von 39,7 Sekunden für ein Plasma an, in welchem
der Faktor IX nur einen Aktivitätspegel von 20 * besitzt. Ein Patient mit einem
Faktoraktivitätspegel von 20 % kann bei chirurgischer Operation Blutungserscheinungen
zeigen. Gleichwohl betrachten viele Laboratorien eine A.P.T.T.-Zeit von 40 Sekunden
als normal.
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Insgesamt folgt daraus, daß die bestehenden Gerinnungszeittests, so
wertvoll und wirksam sie an und für sich sein mögen, nur dann von Wert sind, falls
der Faktorpegel solcher Art ist, daß die Endpunkt zeit über einen normalen Bereich
hinaus verlängert wird. Leider können jedoch Plasmagerinnungafaktormängel bestehen,
obwohl die Endpunktgerinnungszeiten im normalen Bereich liegen, und derartige Paktormängel
kbnnen zu ernsthaften Problemen bei Operationen und anderweitigen traumatischen
Anlässen derXoben erwähnten Art führen.
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Durch die Erfindung wird ein neues Verfahren und eine neue Vorrichtung
zur Bestimmung von Plasmagerinnimsfaktorpegeln geschaffen, mittels welcher das erwähnte
Ungenügen der derzeitigen Laboratoriumstechniken für die Durchführung von Faktormessungen
behoben wird. Erfindungsgemäß wird die Amplitude der ersten Zeitableitung des zeitlichen
Verlaufs der optischen Dichte gemessen. Der, Erfindung
liegt die
Erkenntnis zugrunde, daß ein jeweiliger bestimmter Faktoraktivitätspegel (ausgenommen
Fibrinogen) eine logarithmische Funktion der Scheitelwertamplitude der erketen Zeitableitung
der optischen Dichte ist. Ferner liegt der Erfindung die Erkenntnis zugrunde, daß
Fibrinogen eine lineare Funktion dieses Scheitelwerts bei der Durchführung des Thrombin-Zeittests
zur quantitativen Fibrinogenbestimmung ißt. Erfindungsgemäß wird daher die Scheitelwertamplitude
der ersten Zeitableitung eines unbekannten Blutplasmas in Bssiehung zu an einem
Standardplasma bestimmten Scheitelwerten gesetzt, um einen prozentualen Aktivitätspegel
für einen bestimmten Faktor zu bestimmen. Für den Faktor I (Fibrinogen) sieht die
Erfindung eine direkte Ablesung in Gewicht je Volumeneinheit vor. Das erfindungsgemäße
Verfahren wird automatisch und zeitunabhängig durchgeführt, ohne daß graphische
Aufzeichnungen erforderlich sind. Durch die Erfindung wird somit ein neues Verfahren
und eine neue Apparatur zur Überwachung von Blutplasma bezüglich Gerinnungsfaktorpegeln
sowie zum differenziellen (das heißt faktorspezifischen) Nachweis von Plasmagerinnungsfaktormängel
geschaffen.
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Im folgenden werden Austihrungsbeispiele der Erfindung an Band der
Zeichnung beschrieben; in dieser zeigen Fig. 1A, 1B und 1C graphische Darstellungen
der ersten Ableitung (erster Differentialquotient) der optischen Dichte nach der
Zeit, für einen P.T.-Test, Fig. 2A, 2B und 2C graphische Darstellungen der ersten
Zeit ableitung der optischen Dichte für einen A.P.T.T.-Test,
Fig.
3A bis 3H graphische Darstellungen der ersten Zeitableitung der optischen Dichte
für einen A.P.T.T.-Test, der als Grundlage für eine Faktor IX-Bestimmung an einem
Plasma mit einem Faktor IX-Gehalt von 100 %, 60 %, 40 %, 20 %, 10 %, 6 %, 2 % und
kleiner als 1 % vorgenommen wurde, Fig. 4 eine graphische Darstellung der Scheitelwerte
der Kurven aus Fig. 3 in doppelt-logarithmischer Darstellung, Fig. 5A bis 5H graphische
Darstellungen der ersten Zeitableitung der optischen Dichte für einen A.P.T.T.-Test,
der als Grundlage für eine Faktor-VIII-Bestimmung an einem Plasma mit einem Faktor-VIII-Gehalt
von 80%, 60 %, 40 %, 20 %, 10 %, 5%, 2,5% und kleiner als 1 % durchgeführt wurde,
Fig. 6 eine graphische Darstellung der Scheitelwertamplituden der Kurven aus Fig.
5 in doppeltlogarithmischer Darstellung, Fig. 7A bis 7H graphische Darstellungen
der ersten Zeitableitung einer Faktor VIII-Bestimmung, Fig. 8 eine graphische Darstellung
der Scheitelwertamplituden der Kurven aus den Fig. 7A bis 7H in doppelt-logarithmischer
Darstellung sowie eine Darstellung der Endpunkt- oder Gerinnungszeit aus den gleichen
Kurven, Fig. 9 ein Blockschaltbild einer Apparatur zur
Durchführung
der vorliegenden Erfindung, Fig. 10 ein Blockschaltbild einer anderen Ausführungsform
einer Apparatur zur Durchführung der vorliegenden Erfindung, Fig. 11 ein Streudiagramm
zur Veranschaulichung einer Beziehung bzw. Korrelation zwischen den Scheitelwerten
der ersten Ableitung der optischen Dichte des A.P.T.T. und des P.T.-Tests, Fig.
12 ein Streudiagramm zur Veranschaulichung einer Beziehung bzw. einer Korrelation
zwischen den Scheitelwerten der ersten Ableitung der optischen Dichte des A.P.T.e.-
und des T.T.-Tests.
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Die meisten Bestimmungen von Abnormalitäten im GerSnnungsvermögen
von Blut erfolgen mittels Blutplasmatests. Nimmt man von einem Patienten eine Blutprobe
ab, füllt sie in ein Reagenzglas und läßt sie gerinnen, so wird der nach der Gerinnung
verbleibende flüssige Teil als Serum bezeichnet. Falls man vor der Gerinnung der
gesamten Blutprobe ein Anti-Koagulier-Reagens zusetzt und danach das mit dem Anti-Eoagulier-Reagens
versetzte gesamte Blut zentrifugiert, so wird der dann zurückbleibende flüssige
Anteil als Plasma bezeichnet. Beispiele gewöhnlich verwendeter Antikoagulationsmittel
sind Natriumcitrat und Natriumoxalat. Natriumcitrat ist für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung vorzuziehen, da es ein stetigeres Signal der ersten Zeitableitung ergibt,
jedoch ist die Erfindung nicht hierauf beschränkt, sondern grundsätzlich mit beiderlei
Antikoagulationsmitteln durchführbar. Normalerweise werden die Antikoagulationsreagentien
dem Blut im
Verhältnis von 1 Teil Antikoaguliermittel zu 9 Teilen
Gesamtblut zugegeben.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Apparatur zur Messung
der Pegel von Plasma-Gerinnungsfaktoren. In der nachfolgenden Beschreibung wird
zumeist auf Mängel bzw. Defizienzen der Pegelwerte von Plasma-Gerinnungsfaktoren
Bezug genommen, da dies der übliche Fall ist. Jedoch wurden auch Beispiele von erhöhten
Gerinnungsfaktorpegeln nachgewiesen, wie beispielsweise des Faktor IrtIl bei einigen
thrombotischen Patienten. Die Erfindung eignet sich durchaus auch zum Nachweis derartiger
erhöhter Pegelwerte und ist daher nicht allein auf die Messung von Mangelwerten
beschränkt, wenngleich die Messung von Mangelwerten zumeist erwähnt wird.
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Der Prothrombin-Zeit-Test (P.T.) und der aktivierte Partial-Thromboplastin-Zeit-Test
(A.P.T.T.) wurden bereits erwählt. Es gibt auch andere Tests, wie beispielsweise
den Thromboplastin-Erzeugungs-Test (T.G.T) und den Thrombin-Test (T.T.), die zur
Bestimmung von Plättchen- und Plasmafaktor-Mängeln bzw. zur quantitativen Fibrinogenbestimmung
verwendet werden. Ein weiterer Test ist der Prothrombin-und Proconvertin-test (P&P).
Diese anderweitigen Tests brauchen hier nicht im einzelnen beschrieben zu werden,
da sie in der Fachwelt bekannt sind. Ein kurze Beschreibung des P.T.-Tests und des
A.P.T.T.-Tests zag jedoch für das Verständnis der Erfindung hilfreich sein.
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Zur Durchführung des Prothrombin-Zeit-Tests (P.T.) wird in der Weise
vorgegangen, daß man 0,1 nF mit Anti-Koaguliermittel versetztem Blutplasma gewinnt
und hierzu 0,1 ml Thromboplastin und 0,1 ml Calciumchlorid zugibt. Die
Gerinnungs-
oder Endpunkt zeit wird vom Zeitpunkt der Zugabe des Thromboplastin und des Calciumchlorids
bis zum Beginn einer Gerinselbildung gemessen. Der Test wird bei einer Temperatur
des Gemischs von 37°C, das heißt bei Körpertemperatur, vorgenommen.
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Der P.T.-Test spricht auf die Faktoren I, II, V, VII und X an; das
heißt, ein Mangel an diesen Paktoren kann zu einer Verlängerung der Gerinnungszeit
über den normalen Bereich hinaus führen. Der normale Bereich für einen P0T.-Test
beträgt annähernd 11 bis 13 Sekunden. Dieser Normalbereich kann je nach dem verwendeten
Reagens schwanken; jedoch sind diese Abweichungsschwankungen in den vorhandenen
Handbüchern standardisiert.
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Der aktivierte Partial-Thromboplastin-Zeit-Test (A.P.T.T.) wird in
der Weise durchgeführt, daß man 0,1 ml Cephalin-Reagens zu 0,1 ml Plasma zugibt.
Dae Plasma und Cephalin werden zusammen 2 bis 5 Minuten lang inibiert', je nach
der Art des verwendeten Cephalin-Reagens. Danach'werden 0,1 ml Calciumchlorid dem
inkubierten Gemisch zugegeben und der Endpunkt von der Zeit der Einbringung des
Calciumchlorids an gemessen. Das Calciumchlorid besitzt eine Molarität von 0,02
bis 0,03 Mol. Der normale Zeitbereich für einen A.P.T.T.-Test beträgt etwa 28 bis
40 ßeXunden, wiederum in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Reagens.
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Ein A.P.T.T.-Test spricht auf Mängel an den Blutfaktoren I, II, V,
VIII, IX, X, XI und XII an.
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Diese verschiedenen Tests (beispielaweise P.T. und A.P.g.v.) werden
häufig in Verbindung miteinander zur Isolation von Gruppen möglicher Faktormängel
angewandt. Falle beispielsweise ein P.T.-Test in den normalen Bereich
fällt,
jedoch der A.P.g.20-lest eine abnormal lange Gerinnungszeit zeigt, so folgt daraus
durch Schlußfolgerung, daß wahrscheinlich einer der Faktoren VIII, IX, XI oder XII
die Ursache der abnormalen Gerinnungszeit ist. Nach bekannten Laborverfahren werden
dann anderweitige Tests eingeleitet zur Bestimmung, welcher dieser vier Faktoren
die abnormale Gerinnungszeit verursachen kann. Als anderweitige Tests stehen dem
Kliniker auch Faktor-Bestimmungen für jeden einzelnen der bekannten Faktoren zur
Verfügung.
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Faktorbestimmungen werden nicht am Beginn ausgeführt, da sie langwierig,
mühsam, fehleranfällig und häufig ungültig sind.
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Man kennt verschiedene Verfahren zur Messung der Endpunlrtzeiten.
Hierzu gehören mechanische, manuelle, indirekt optische und optische Dichtemeßverfahreno
Nahezu alle Blul;-gerinnungstests werden in der Weise durchgeführt, daß mn vom Zeitpunkt
der letzten Reagenszugabe bis zu einem Punkt während der Bildung des Fibrinendpunktes
mißt. Die Bildung von Fibrin ist durch änderungen der optischen Dichte nachweisbar,
da das Fibrin in der Plasmalösung unlöslich ist und daher eine Ausfällung bildet.
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Wie bereits angedeutet, ist der Vorläufer (oder Katalysator) für den
Prozeß der Fibrinbildung durch Fibrinogen-Polymerisierung Thrombin. Der Beginn der
Bildung eines Gerinsels, das heißt der Fibrinbildung, wird durch eine Anderung des
Anstiegs der Kurve der optischen Dichte nach der Zeit bestimmt. Die bestehenden
Geräte messen die erste Zeitableitung der Kurve der optischen Dichte zur Endpunktbestimmung.
Ein Beispiel einer derartigen Vorrichtung ist in den US-Patentschriften 3 307 392
und 3 658 480 beschrieben.
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Erkenntnis und Die vorliegende Erfindung betrifft bzw. beruht auf
einer / Auswertung der Signifikanz der ersten Zeitableitung des Zeitverlaufs der
optischen Dichte. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß der Scheitel-
oder Spitzenwert des Signals der ersten Zeit ableitung der optischen Dichte in einer
signifikanten Beziehung zu Mangelwerten in einem oder mehreren Gerinnungsfaktoren
steht. Wie bereits erwähnt, ist Thrombin der Vorläufer (oder Katalysator) der Fibrinogen-Polymerisation.
Grundsätzlich führen Mangelwerte an Gerinnungsfaktoren zu einem Unterschied in der
Geschwindigkeit der Thrombinerzeugung und der Menge des erzeugten Thrombins. Anders
ausgedrückt: Die Bildungsgeschwindigkeit von Thrombin und die Menge des gebildeten
Thrombins hängen von den Gerinnungsfaktoren sowie der Art und Weise, wie die Faktoren
miteinander und aufeinander reagieren, ab. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde,
daß Vorhandensein, Abwesenheit oder teilweise Abwesenheit normaler Gerinnungsfaktoren
und die Art ihrer Reak tion miteinander sich im Anstieg des Scheitelwertes einer
graphischen Darstellung der ersten Zeitableitung der optischen Dichte des Blutplasmas
im Verlauf der Gerinnung CP.T.-oder A.P.T.T.-oder T.T.-Thrombinzeit (Fibrinogenfaktor
1)) als Funktion der Zeit niederschlägt bzw. äußert.
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Bei Aufzeichnung der Ausgangsgröße der Apparatur gemäß der US-Patentschrift
3 658 480 für einen P.T.-Test würde man ein den in den Fig. 1A, 9B und 1C dargestellten
Kurven ähnliches Ergebnis erhalten. Die in der genannten US-Patentschrift 3 658
480 beschriebene Apparatur mißt den Beginn der Bildung eines Gerinsels an der nach
oben gerichteten Steigung der ersten Zeitableitungskurve, wie durch die Pfeile in
den graphischen Darstellungen der Fig. 1A, 13 und 1C angedeutet. Fig. 1A zeigt eine
graphische
Darstellung der ersten Zeitableitung für normales Blutplasma
mit einer Gerinnungszeit von 11,5 Sekunden in einem P.T.-Test. Die Kurve in Fig.
1B zeigt eine Gerinnungszeit von 14,4 Sekunden für einen P.k.JUest. Die Kurve in
Fig.
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10 zeigt eine Blutgerinnungszeit von 18,4 Sekunden für einen P.T.-Test.
Die Fig. 1B und 1C stellen Kurven von Blutplasma mit unterschiedlichen Pegeln der
Faktoren II, VII und X dar.
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Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß die Bildung eines
Gerinsels viel komplizierter ist als ursprünglich angenommen. Die in Fig. 1A dargeetellte
Kurve gilt für normales Blut. Von der Kurve in Sig. 1B ist bekannt, daß sie abnormal
ist. Ihre P.T.-Gerinnungszeit beträgt 14,4 Sekunden, der Betrag bzw. die Höhe des
Scheitelwertes ist niedriger als für die in Fig. 1A dargestellte Kurve, und Form
und Verlauf des absteigenden Kurvenasts sind signifikant verschieden. Dieser Unterschied
ist noch ausgeprägter in Fig. 1C (Gerinnungszeit 18,4 Sekunden), welche einen wesentlich
niedrigeren Scheitelwert und einen radikal verschiedenen Kurvenabfall besitzt. Damit
ist klar, daß die charakteristische Form und der Verlauf der Kurven in den Fig.
13 und 1C das Ergebnis mehrfacher Faktormängel sind. Im betrachteten Beispiel handelt
es sich um die Faktoren II, VII und X. Ähnliche Unterschiede in der charakteristischen
Form ünd dem charakteristischen Verlauf der ersten Zeitableitungekurve kbnnten mit
anderweitigen Mehrfach- oder Einzelfaktormängel erhalten werden.
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Die Fig. 2k,, 2B und 2C zeigen die Ergebnisse eines A.P.T.T.-Tests
für normales Blutplasma, für ein Blutplasma mit Faktor IX-Mangel sowie für ein Gemiech
aus Faktor IX-und normalem Blutplasma. Für die Zwecke der vorliegenden
Anmeldung
wird vollständiger gel eines bestimmten Faktors in ienem Blutplasma angenommen,
falls dessen Aktivitätspegel kleiner als 1 ist. Kommerziell verfügbare Substratplasmen
mit Faktormangel, wie sie routinemäßig verwendet werden, sind nicht vollkommen frei
von dem fehlenden Faktor. Im allgemeinen weisen sie 0,1 bis 0,15 % des vorgeblich
fehlenden Faktors auf. Ein derartiges Blutplasma ist in Fig. 2B veranschaulicht,
mit einer A.P.T.T.-Zeit von 902 Sekunden. In Fig. 20 wurden 9 Teile des Plasmas
mit Faktor IX-Mangel mit 1 Teil normalem Plasma gemischt. Die A.P.T.T.-Zeit der
Kurve in Fig. 2C ist auf 46 Bekunden verringert und die Form der Kurve ist dahingehend
geändert, daß der Scheitelwert wie auch die Gerinnungszeit irgendwo in den Bereich
zwischen die in den Fig.
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2A und 2b gezeigten Werte fallen. Somit ändert sich die Form der ersten
zeitabnleitungskurve eines Plasmas mit einem einzelnen Faktormangel auch als eine
Funktion des Ausmaßes bzw. der Größe dieses Mangels.
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In den Fig. 3A bis 3H sind 8 Kurven für verschiedene Gemische von
normalen und Plasmen mit Faktor IX-Nangel dargestellt. Hierbei handelt es sich sämtlich
um graphische Darstellungen'des zeitlichen Verlaufs der ersten Zeitableitung der
optischen Dichte, wie man sie mit einer Apparatur gemäß der US-Patentschrift 3 658
480 erhält. Es handelt sich dabei durchwegs um A.P.T.T.-Tests.
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Fig. 3A zeigt normales Blutplasma; das heißt Plasma mit einem 100
% Aktivitätspegel des Faktors IX. Fig. 3B zeigt Plasma mit einem Aktivitätspegel
des Faktors IX von 60 5'; Fig. 3C von 40 %, Fig. 3D von 20 %, Fig. 3E von 10 5',
Fig.
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3G von 2 % und Fig. 3H mit einem Faktor IX-Aktivitätspegel cvon weniger
als 1 %.
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Wie erwartet, nimmt die Endpunkt- oder Gerinnungszeit mit abnehmendem
Aktivitätspegel zu. SignifSkanterweiJe beträgt die Endpunktzeit für die Kurve gemäß
Fig. 3D 39,7 Sekunden, obwohl bekannt ist, daß das betreffende Plasma einen verhältnismäßig
niedrigen Faktor IX-Aktivitätspegel von nur 20 % besitzt. Eine derartige Endpunktzeit
wird von vielen Laboratorien als noch in den normalen Bereich der A.P.T.T.-Zeit
fallend betrachtet. Jedoch kann ein Patient mit einem Faktor IX-Aktivitätspegel
von nur 20 % oder darunter bei chirurgischer Behandlung (ver-) bluten. Dies zeigt,
daß die Endpunkt zeit allein nicht notwendigerweise eine ausreichende oder spezifische
Determinante für Blutplasma-Faktormängel ist.
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Weiterhin zeigt eine Untersuchung der Fig. 3A bis 3H, daß die Scheiteiwertamplituden
der ersten Zeitableitungskurve mit niedriger werdendem Aktivitätspegel ebenfalls
abnehmen. Dies ist besonders deutlich veranschaulicht in Fig.
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4, in welcher die Scheitelwertamplituden für die einzelnen Kurven
gemäß den Fig. 3A bis 3H in Abhängigkeit von der prozentualen Aktivität des Faktors
IX in doppelt-logarithmischer Darstellung aufgetragen sind. Die graphische Darstellung
aus Fig. 4 zeigt eine annähernd gerade Linie. Unter Berücksichtigung der normalerweise
bei derartigen Testverfahren auftretenden Variablen und Schwankungen kann in der
Tat davon ausgegangen werden, daß die graphische Darstellung in Fig. 4 eine gerade
Linie bildet.
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Die Fig. 5A bis 5K und Fig. 6 zeigen den Fig. 3 bzw. 4 entsprechende
graphische Darstellungen für Gemische aus normalen und mit Faktor VIII-Mängeln behafteten
Plasmen.
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Alle Darstellungen betreffen einen A.P.T.T.-test.
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Fig 5A zeigt einen Faktor VIII-Aktivitätspegel von 80 *, mit einer
Endpunktzeit von 33,3 Sekunden. Fig. 5B zeigt einen Faktor VIII-Aktivitätspegel
von 60 % mit einer Endpunktzeit von 36,1 Sekunden, Fig. 50 einen Faktor-VIII-Aktivitätspegel
von 40 % mit einer Endpunktzeit von 37,1 Sekunden, Fig. 5D einen Aktivitätspegel
von 20 % mit einer Endpunktzeit von 39,2 Sekunden, Fig. 5E einen Faktor VIII-Aktivitätspegel
von 10% mit einer Endpunktzeit von 45,1 Sekunden, Fig. 5F einen Faktor VIII-Aktivitätspegel
von 5 % mit einer Endpunktzeit von 50,5 Sekunden, Fig. 5G einen Aktivitätspegel
des Faktors VIII von 2,5 % mit einer Endpunktzeit von 55,7 Sekunden, und Fig. 5H
eine Endpunktzeit von 72 Sekunden für ein Plasma ohne Faktor VIII, das heißt mit
einem Faktor VIII-Aktivitätspegel von weniger als 1*1 Eine Untersuchung der graphischen
Darstellungen in den Fig. 5A bis 5R zeigt wiederum, daß der Scheitelwert der ersten
Zeitableitungskurve mit abnehmendem Aktivität spegel abnimmt. Bei Auftragung in
doppelt logarithmischer Darstellung gemäß Fig. 6 erhält man wieder eine geradlinige
Beziehung.
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Zu beachten ist dabei, daß die Endpunktzeiten zwischen den Aktivitätspegeln
von 80 % und 20 % nur um 6 Sekunden schwanken, trotz des erheblichen Unterschieds
von 60 % im Pegel des Gerinnungsfaktors, vergleiche Fig. 5A bis 5D.
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Ein Patient-mit einem Faktor VIII-Aktivitätspegel von 20 * ist ein
potentieller Bluter und bildet damit ein ernsthaftes chirurgisches Risiko. Gleichwohl
kann es dahin kommen, daß ein Patient auf der Grundlage einer A.P.T.T.-Endpunktzeit
von 39,2 Sekunden für chirurgische Behandlung zugelassen wird. Fig. 5E betrifft
einen Faktor VIII-Aktivitätspegel
von 10 %, mit einer A.P.T.T.-Zeit
von 45 Sekunden. In manchen Laboratorien wird dieser Zeitwert noch als Gerinnungszeit
am oberen Ende des Normalbereiche oder als Gerinnungszeit in der "Grauzone" angesehen
Nur eine spezifische Faktor-Messung würde das Ausmaß des Faktor VIII-Mangels angezeigt
haben. Ändererseits ist das Vorliegen eines Faktormangeis aus der graphischen Darstellung
in Fig. 6 klar ersichtlich.
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Die graphischen Darstellungen in den Fig. 3, 4, 5 und 6 simulieren
jeweils Faktor-Mängel, indem man normales Blutplasma mit einem Plasma mit einem
bekannten Faktormangel mischt und dann die A.P.T.T.-Zeit bestimmt. Als Ergebnis
erhält man eine geradlinige Beziehung zwischen dem Scheitalwert der ersten Zeitableitung
des zeitlichen Verlaufs der optischen Dichte und dem simulierten Faktor-Aktivitätspegel.
Die Fig. 7A bis 7H zeigen entsprechende ällnliche Kurvendarstellungen der ersten
Zeitableitung für Gemische von Plasma mit Faktor VIII-Mängeln mit verdünntem normalem
Plasma, wie dies bei einer herkömmlichen Faktorprobe üblich ist. Diese Kurven werden
nachfolgend im einzelnen erläutert.
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Herkömmlicherweise erfolgt eine Probe bzw. Messung zur Be-Bestimmung
eines Faktormangels in der folgenden Weise: Zunächst wird ein Plasma, von dem bekannt
ist, daß es einen Mangel an einem bestimmten Faktor aufweist, in ein Reagenzglas
gegeben. Beispielsweise kann ein Plasma mit Faktor VIII-Mangel verwendet werden.
Von einem Plasma mit einer A.P.T.T.-Zeit von mehr als 100 Sekunden wird angenommen,
daß es einen Aktivitätspegel von weniger als 1 * besitzt.
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Der nächste Schritt besteht in der Verdünnung von normalem Plasma
mit einer gepufferten Salzlösung in Verbältnissen von 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160
und 1:320. Für das 1:10 verdünnte normale Plasma wird ein Aktivitätspegel von 100
5 angenommen, für die 1:20 Verdünnung ein Aktivitätspegel von 50 % und so weiter
bis zu der Verdünnung 1 :320.
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Als nächster Schritt werden 0,1 ml des 1:10 verdünnten normalen Plasmas
Cdas heißt mit Aktivität 100 *) zu 0,1 ml eines bekannten Plasmas mit Faktor Vill-Mangel
(Aktivitätspegel kleiner als 1 %) sowie 0>1 ml eines A.P.T.T.-Reagens und 0,1
ml Calciuschlorid der richtigen Molarität zugegeben. Nach der Zugabe des Calciumchlorids
wird der Endpunkt der Gerinnungszeit gemessen; das Ergebnis ist in Fig. 7A dargestellt.
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Das gleiche Verfahren wird für die 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 und 1:320
verdünnten normalen Blutproben in genau den gleichen Mengen durchgeführt und es
werden wiederum die Zeiten gemessen, wie in den graphischen Darstellungen der Fig.
7B bis 7H gezeigt. Diese Kurven veranschaulichen das Vermögen von normalem verdünntem
Plasma, die Gerinnungszeit des Plasmas mit bekanntem Faktormangel zu korrigieren.
In dem gezeigten Beispiel weist das Plasma einen Faktor VIII-Mangel auf.
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Die Gerinnungs- oder Endpunkt zeit ist in den Fig. 7A bis 7H jeweils
angegeben und braucht hier nicht wiederholt zu werden. Infolge der Verdünnung des
normalen Plasmas sind die Endpunkt zeiten wesentlich länger als für unverdünntes
Plasma.
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Eine Analyse der Kurven in den Fig. 7A bis 7H zeigt wiederum, daß
die Scheitelwertamplitude in direkter Beziehung
zur prozentualen
Aktivität steht. Dies ist in Fig. 8 graphisch veranschaulicht; Fig. 8 zeigt eine
geradlinige Beziehung zwischen der Scheitelwertamplitude der ersten Zeitableitung
des zeitlichen Verlaufs der optischen Dichte und dem prozentualen Aktivitätspegel.
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Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde für ein Plasma mit bekanntem
Faktormangel durchgeführt. Der nächste Schritt besteht darin, daß man das Plasma
des Patienten mit einem unbekannten Faktormangelpegel in der oben angegebenen Weise
verdünnt. Beispielsweise kann eine Verdünnung 1:10 und 1:20 vorgenommen werden.
Unter Verwendung des gleichen Reagens werden jeweils die A.POGOvO-Endpunktzeit und
Spitzenwertamplitude für diese beiden Verdünnungen bestimmt. Indem man auf der Kurve
von Fig. 8 den betreffenden Wert der Scheitelwertamplitude aufsucht, erhält man
die prozentuale Aktivität.
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Zur Veranschaulichung des Vorteils der Verwendung von Scheitelwertamplituden
statt Endpunkt zeiten ist in Fig. 8 die mit T bezeichnete Zeitkurve eingetragen.
Diese Kurve veranschaulicht die Beziehung zwischen der Gerinnungszeit in Sekunden
und dem prozentualen Aktivitätspegel. Zu beachten ist, daß die Fig. 7E bis 7H keinen
signifikanten Unterschied in der Gerinnungszeit zeigen, obwohl bekannt ist, daß
der prozentuale Aktivitätspegel in den einzelnen Kurven jeweils wesentlich niedriger
ist. Dies ist in Fig.
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8 durch den horizontalen Teil der Kurve T veranschaulicht.
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Der Grund für diesen horizontalen. Kurvenabschnitt besteht darin,
daß die Ansprechempfindlichkeit des Gerinnungszeitverfahrens irgendwo zwischen etwa
1 und 6 * Aktivität aussetzt, das heißt daß die Zeit nicht mehr als Funktion, das
heißt in Abhängigkeit von der Verdünnung zunimmt. Der
gestrichelte
Teil der Kurve (T) veranschaulicht, welche Resultate auf der Grundlage der Zeit
allein bei Extrapolation zu erwarten wären. Eine stichhaltige und wissenschaftlich
korrekte Extrapolation der Zeitlinie ist jedoch nicht möglich, da keine sinnvolle
Methode für die Bestimmung und Verifizierung der Zeitlinienwerte unterhalb etwa
6 * existiert. Das zeigt, daß die bestehenden Probeverfahren zur Bestimmung von
Faktoraktivitätspegeln unterhalb etwa 6 % Aktivitätspegel nicht empfindlich sind.
Dies ist bedeutsam, weil ein hämophilischer Patient möglicherweise nicht blutet,
wenn sein Aktivitätspegel oberhalb 6 % liegt. Eine Kenntnis des prozentualen Aktivitätspegels
eines derartigen hämophilischen Patienten im Bereich oberhalb 6 * ist daher wichtig
und wesentlich. Diese Kenntnis ist jedoch nicht zu erlangen, wenn allein auf die
Gerinnungszeit abgestellt wird0 Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Werte
in einfacher Weise durch Messung der Scheitelwertamplitude der ersten Zeit ableitung
des zeitlichen Verlaufs der optischen Dichte bestimmt werden.
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Die Erfindung gibt somit ein Verfahren an die Hand, mit welchem Faktorproben
und -bestimmungen verläßlicher gestaltet werden können.
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In der vorstehenden Beschreibung wurde die der Erfindung zugrunde
liegende Erkenntnis über die Beziehung zwischen der Scheitelwertamplitude der ersten
Zeitableitung der optischen Dichte und der prozentualen Aktivität an Hand graphischer
Darstellungen in doppelt-logarithmischer Darstellung zum Ausdruck gebracht. Alle
diese Beziehungen stellen sich dabei als Gerade dar. Bei Darstellung in linearem
Maßstab ergäbe sich eine exponentielle Beziehung, Mathematisch kann diese Beziehung
wie folgt ausgedrückt
werden: Die prozentuale Aktivität (ist) für
ein Plasma mit Faktor mangel ist eine logarithmische Funktion der Scheitelwertamplitude
(Y) der ersten Zeit ableitung der optischen Dicht te: log X = NlogT - C oder X =
YN - C (1) worin N der Anstieg bzw. die Neigung der Kurve und C eine Konstante,
welche Abweichungen vom Nullpunkt Rechnung trägt Cd. h. einer Nullpunktverschiebung
Rechnung trägt), bedeutet.
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Die vorstehenden Ausführungen veranschaulichen klar die Beziehung
zwischen der Scheitelwertamplitude der ersten Zeitableitung der optischen Dichte
und dem Betrag bzw.
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Ausmaß des Faktormsngels als Funktion des prozentualen Aktivitätspegels.
Nach der der Erfindung zugrunde liegenden Erkenntnis, daß eine derartige Beziehung
besteht, kann diese Beziehung nunmehr zur Bestimmung von Plasmafaktormängeln auf
elektronischem Wege verwendet werden.
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In Fig. 9 ist ein Ausführungsbeispiel einer eriindungsgemäßen Apparatur
10 zur Bestimmung von Gerinnungsfaktor-Mängeln im Plasma veranschaulicht. Die Schaltung
liefert eine Ausgangsgröße, die direkt in zwei verschiedenen Einheiten abgelesen
werden kann: entweder als Milligramm pro Prozent (mg/%) oder in Milligramm pro Deziliter
(mg/dl).
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Fibrinogen ist der einzige Faktor, der derzeit in
Gewichtseinheiten
gemessen werden kann, statt in relativer prozentualer Aktivität wie für die übrigen
Faktoren.
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Die Vorrichtung 10 weist einen Halterungsblock 12 auf, de mit einer
Heizvorrichtung versehen sein kann, um in seinem Inneren eine Temperatur von 3700,
d. h. der Temperatur des menschlichen Blutes im Körper und damit der geeigneten
Temperatur für Blutplasmauntersuchungen, aufrecht zuerhalten. In dem Halterungsblock
12 ist ein Reagenzglas 14 angeordnet, das eine Plasmaprobe 16 enthält, die mittels
einer Pipette-oder einem anderweitigen geeigneten Instrutent zur Zugabe von Flüssigkeiten
in gewünschter Menge eingebracht wurde.
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Eine Lichtquelle 18 emittiert Lichtstrahlung mit Wellenlängen von
nahen Infrarot über den sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums. Dieses
Licht durchsetzt das Plasma 16 in dem Reagenzglas 14 und wird mit einem Photodetektor
20 gemessen Der Photodetektor 20 kann beispielsweise ein Photowiderstand sein, es
können jedoch auch anderweitige Arten von Detektoren, wie sie sich zur Verwendung
in elektronischen Schaltungen eignen, verwendet werden. Die Ausgangsgröße des Photodetektors
20 kann in herkömmlicher Weise mit verfügbaren Instrumenten, wie sie beispielsweise
in der US-Patentschrift 3 658 480 beschrieben sind, bearbeitet werden. Das am Ausgang
des Photodetektors 20 auftretende Signal gibt die optische Dichte (O.D) als Funktion
der Zeit (t) für eine Blutplasmaprobe wieder, welcher ein geeignetes Reagens und/oder
Calciumchlorid in den oben angegebenen richtigen Mengen zugesetzt wurde.
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Die Ausgangsgröße des Photodetektors 20 wird einem
Differensierverstärker
24 zugeführt, welcher das Signal der optischen Dichte nach der Zeit differenziert
und an seinem Ausgang das elektrische Signal 26 (dO-.D./dt) abgibt. Hierbei handelt
es sich um das gleiche Signal wie in Fig. 1A veranschaulicht, wobei jedoch selbstverständlich
seine jeweilige Form und Amplitude von dem jeweiligen Plasma, der Testart (beispielsweise
P.T. oder A.P.gg.) ) und dem verwendeten Reagens abhängt.
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Die Ausgangsgröße des Differentialverstärker 24 wird einem Differentialverstärker
28 zugeführt, der das Signal wiederum unter Verwendung herkömmlicher Schaltungen
nochmals differenziert und als Ausgangsgröße das Signal 30 Cd2O.D./dt2) erzeugt,
das an der Ausgangsleitung graphisch veranschaulicht ist. Der Grund für die Erzeugung
auch der zweiten Zeit ableitung der Ausgangsgröße des Photodetektors 20 beruht darin,
daß man auf diese Weise den mit dem Scheitelwert des elektrischen Signals 26 zusammenfallenden
Nulldurchgangspunkt erhält. Dieser Scheitelwert des die erste Zeit ableitung darstellenden
elektrischen Signals 26 ist ja der gesuchte Wert für die Durchführung des hier beschriebenen
Analyseverfahrens. Es sei darauf hingewiesen, daß der Differentialverstärker 28
im vorliegenden Fall nicht zur Bestimmung der Endpunkt- oder Gerinnungszeit dient.
Er dient lediglich der Bestimmung des Scheitelwertes eines Signals, der ja bekanntlich
an der Stelle liegt, wo der Tangentenanstieg sein Vorzeichen wechselt.
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Die Ausgangsgröße des Differenzierverstärkers 28 wird einem Komparator
32 zugeführt. Der andere Eingang des Komparators 32 liegt an Nasse. Das heißt für
die in Fig. 9 gezeigte Schaltung wurde als Nullpunktausgangsgröße des Differenzierverstärkers
28 Massepotential gewählt.
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Sobald das Ausgangssignal des Differenzierverstärkers 28 durch den
Nullpunkt geht, ändert sich die Ausgangsgröße des Komparators 32. Beispielsweise
kann die Anordnung so getroffen sein, daß das Ausgangssignal sich negativ von 5
V auf 0 V ändert. Dieses Signal wird einer Verriegelungsschaltung 34 zugeführt.
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Die Verriegelungsschaltung 34 ist eine Flipflopschaltung.
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Als andere Eingangsgröße wird der Verriegelungsschaltung 34 die Endpunktzeit
zugeführt, wie sie aus der in der US-Petentschrift 3 658 480 beschriebenen Schaltung
erhalten wird. Es sei daran erinnert, daß die Endpunktzeit normalerweise abgenommen
wird, bevor das Signal der ersten Zeitableitung seinen Scheitelwert erreicht, wie
durch die Pfeile in den Fig. 1A, 1B und 1C veranschaulicht. Dieses Endpunktsignal
dient zur Riickstellung des Flipflops der Verriegelungsschaltung 34; hierbei wird
am Ausgang der Verriegelungsschaltung ein Signal erzeugt, welches die übringe Schaltung
in Bereitschaft zur erneuten Aufnahme eines Scheitelwertes setzt. Die Schaltung
weiß, daß sie die Scheitelwertamplitud. erreicht hat, sobald die Verriegelungsschaltung
34 ein Signal von dem Komparator 32 erhält.
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Diese Anordnung hat den Sinn, sicherzustellen, daß die Schaltung erst
hoch oben auf dem ansteigenden Zweig des Zeitableitungnsignals 26 für die Scheitclwertumplitude
ansprechbar wird. Hierdurch wird jede Möglichkeit der Aufzeichnung eines zufälligen
oder Spuren-Scheitelwertsignals vermieden. Die Ausgangsgröße der Verriegelungsschaltung
34 wird einer elektronischen Verstärkungsregelschaltung 56 und einem Digitalvoltmeter
38 zugeführt; diese beiden Schaltungen werden durch die Ausgangsgröße betätigt.
Die elektronische Verstärkungsregelschaltung 56 dient zur Anfangseichung des Instruments
in der nachfolgend beschriebenen
Weise. Wie oben für die bestimmung
von Blutplasma-Faktormängeln, insbesondere an Hand der Fig. 7 und 8 erläutert wurde,
wird die unbekannte Blutplasmaprobe mit einem bekannten Standard vergleichen, um
die prozentuale Faktoraktivität des Blutplasmas zu bestimmen. Um dies in dem vorliegenden
Instrument durchzuführen, ist zunächst eine Kalibrierung des Instruments erforderlich.
Und zwar muß das Instrument jeweils nach jedem Wechsel des Reagens oder des Standardplasmas
und auch jeweils bei Inbetriebnahme zu Beginn einer Testperiode neu geeicht werden.
Der Grund dafür besteht darin, daß die Reagentien und die Blutplasmastandards sowohl
zwischen verschiedenen Herstellern als auch zwischen verschiedenen Serien eines
und desselben Herstellers schwanken, ja sogar Blutplasma oder Reagens aus ein und
derselben Serie kann täglichen Schwankungen infolge Änderungen der Umgebungsbedingungen
unterliegen.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die unbekannte Probe mit einem
Bezugsstandard verglichen, zur Bestimmung von Fibrinogen in Milligramm pro Prozent,
oder im Vergleich mit einem vorgegebenen Signal entsprechend einer Aktivität von
100 %, wie nachfolgend beschrieben.
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Die elektronische Verstärkungsregelschaltung 56 ist eine herkömmliche
"Tw -Schaltung zur Signalrückführung, wobei der vertikale Widerstandszweig digital
für Grob- und Feinabstufungen der Verstärkung gewählt wird. Beispielsweise kann
die Verstärkung der elektronischen Terstärkungsregelung digital vom Wert 1 bis zum
Wert 5 in 99 Schritten gewählt werden.
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Zur Bestimmung von Fibrinogen in Milligramm pro Volumeneinheit
(beispieleweise
mg/dl) wird der mit "Fibrinogen" bezeichnete Schalter 50 gedrückt und hierdurch
eine Funktionssteuerschaltung 44 betätigt, Diese betätigt ein Relais, welches einen
Schalter 64 in die in Fig. 9 veranschaulichte Stellung bringt. In dieser Stellung
ist der Komparator 58 mit einem Digital-Teiler 60 verbunden, der mittels Einstellung
an einem Rändelradschalter ein der Fibrinogenmenge in dem Vergleichs- oder Kontrollplasma
proportionales Signal erzeugt. Der Fibrinogengehalt des Kontrollplasma ist auf dem
Etikett vom Hersteller angegeben. Gegebenenfalls kann er aber auch nach chemischen
Verfahren bestimmt werden. Dieser Wert wird an den Digital-Teiler 60 mit dem Rändelradschalter
eingestellt. Dieser Wert erscheint daher am einen Eingang des Komparators 58.
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Auf diese Weise wird die Schaltung so eingestellt, daß alle nachfolgenden
Tests an unbekannten Plasmaproben gegen die Standardmenge gemessen werden können
Sodann wird auch der Referenz- oder Bezugs-Einstellschalter gedrückt. Hierdurch
erhält die Schaltung die Anweisung zur Eichung aufgrund des ersten Signals, jedoch
an keinem weiteren danach, wie weiter unten noch im einzelnen erläutert wird.
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Bei-dem Plasma 16 in dem Reagenzglas 14 handelt es sich zu dieser
Zeit in der Schaltung um du Standard- oder Vergleichs- oder Kontrollplasma. Im Effekt
bewirkt die Schaltung dabei, daß das ankommende Plasmasignal gleich der mit dem
Digital-Teiler 60 eingestellten Bezu,gsgröße gesetzt wird.
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Die Betätigung des Fibrinogenschalters 50 bewirkt eine Einstellung
des einstellbaren Funktionsverstärkers 42 auf
Verstärkung 1, derart,
daß der Verstärker nicht für eine Fibrinogenmessung verwendet wird. Das Signal 26
an seinem Eingang ist somit gleich dem Signal an seinem Ausgang.
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Hierdurch wird ein lineares Meßverhalten der Schaltung eingestellt,
wie es für die Fibrinogenmessung erforderlich ist.
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Die Verstärkung eines weiteren Verstärkers 54 mit einstellbarer Verstärkung
wird durch die elektronische Verstärkungssteuerung 56 und im besonderen durch den
Widerstandswert ihrer "T"-Schaltung eingestellt. Es sei betont, daß die Verstärkung
der Ausgangsgröße des Differenzierverstärkers 24 verhältnismäßig klein ist und niemals
gleich der Äusgangsgröße des Digital-Teilers 60 sein kann.
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Das von der Verriegelungsschaltung 34 gelieferte Signal löst einen
Zeit- oder Taktgeber 63 zur Erzeugung eines Zeitgebersignals für die elektronische
Verstärkungssteuerschaltung 56 aus. Beispielsweise kann die Zeitgeberschaltung 63
als Ausgangsgröße ein 6 kRz Signal erzeugen, wobei jedoch die jeweils für den Zeitgeber
gewählte Frequenz nicht besonders bedeutsam ist0 Der Zeit bzw. Taktgeber 63 treibt
zwei Dekadenzähler. Dies ergibt eine BCD-Zählung binär codierte Dekadenzählung)
von 0 bis 9 für jeden der Zähler. Insgesamt liefern die Decoder 99 Stufen. Das T-Netzwerk
enthält 19 Widerstandswerte (10 Grob- und 9 Feinwiderstände). Diese 19 Widerstandswerte
ergeben 99 diskrete Verstärkungsstufen für den Regelverstärker 54. (Verstärker mit
einstellbarer Verstärkung).
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Aus dem Vorstehenden ergibt sich, daß die elektronische Verstärkungssteuerung
56 die Verstärkung des Regelverstärkers 54 in einem 6 kHz Takt stufenweise höherschaltet,
bis
die Ausgangsgröße des Verstärkers gleich der mit dem Digital-Teiler
60 eingestellten Spannung ist, wobei der Abgleich durch einen Komparator 58 festgestellt
wirde Sobald die Spannungen am Eingang des Komparators 58 gleich groß sind, erzeugt
dieser ein Signal, welches das Zeit- bzwe Taktgebersignal von der elektronischen
Verstärkersteuerung 56 abschaltet. In diesem Zeitpunkt ist der Regelverstärker 54
so eingestellt, daß er an das Digitalvoltmeter 38 eine Ausgangsgröße liefert, die
gleich den in den Digital-Teiler 60 eingegebenen Probenwerten ist. Dies wird an
einem Wiedergabeausgang 40 des Digitalvoltmeters 38 bestätigt, dessen Ablesung mit
den in den Digital-Teiler 60 eingegebenen Werten übereinstimmen sollte.
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Danach wird der Bezugsgrößen-Einstellschalter 52 gedruckt; die vorstehend
beschriebene Rückführschaltung ist nun nicht mehr wirksam, da der Regelverstärker
54 auf den gewünschten Wert eingestellt ist.
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Die Schaltung ist nun in Bereitschaft zur Testuntersuchung einer unbekannten
Plasmaprobe auf ihren Fibrinogengehalt.
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Es wird nach dem gleichen Verfahren wie zuvor beschrieben vorgegangen,
mit dem Unterschied, daß nunmehr das unbekannte Plasma sich in dem Reagenzglas 14
befindet, das in den Block 12 eingesetzt ist. Die Schaltung wird wie oben beschrieben
betätigt und auf diese Weise das Scheitelpunktsignal mit Hilfe der Verriegelungsschaltung
34 bestimmt. Die an der Wiedergabeeinheit 40 angezeigte Ausgangsgröße des Digitalvoltmeters
bildet nun eine Anzeige des Fibrinogengehalts der unbekanaten-Probe direkt in Milligramm
ae VolumeneinKbit, beispielsweise mg/dl.
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Vorstehend wurde die Verwendung der Schaltung gemäß Fig. 9
zur
Bestimmung von Fibrinogen beschrieben. Zur Durchführung von Faktorbestimmungen mit
P.T.-und A.P.T.T.-Endpunkten muß die Schaltung modifiziert werden, da diese logarithmisch
statt linear sind. In diesem Fall wird entweder der P.T.-Schalter 46 oder der A.P.T.T.-Schalter
48 gedrückt. Hierdurch wird bewirkt, daß die Funktionssteuerschaltung 44 den Schalter
64mittels eines Relais so verstellt, daß er mit einer 100 %-Referenz-Quelle 66 verbunden
ißt. Dies bildet eine in den Komparator 58 eingegebene einstellbare Spannung, Die
100 %-Bezungsspannungsquelle 66 ist eine Spannungsquelle, deren Betrag einem 100
wert gleichgesetzt wird; hierbei ist zu beachten, daß bei den P.T.- und A.P.T.T.-Tests
Blutplasma auf Faktormängel gemäß den relativen prozentualen Aktivitätswerten vermessen
wird. Dieses Verfahren beruht auf einem normalen Kontroll- oder Vergleichsplasma
mit angenommener 100%iger Aktivität sämtlicher Faktoren. Zur Eichung der Schaltung
wird ein Standardplasma mit einem bekannten normalen Faktorpegel in das Reagenzglas
14 gegeben und je nach Wunsch nach Maßgabe entweder eines P.T.-Testsystems oder
eines A.P.T.T.-Testsystems zur Gerinnung gebracht.
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Der Bezugsgrößeneinstell-Schalter 52 ist gedrückt. Hierdurch wird
der Wert des Regelverstärkers auf den 100 %-Pegel eingestellt, wie er durch die
100 %;Besugsspannungsquelle 66 bestimmt und vorgegeben ist. Am Digitalvoltmeter
38 wird daher die 100 %-Bezugsspannung abgelesen. Nunmehr wird der einstellbare
Funktionsverstärker 42 in Tätigkeit gesetzt. Hierbei ist festzuhalten, daß die in
den Fig. 6 und 8 gezeigte und in der oben angegebenen Formel (1) beschriebene scheinbar,
lineare Beziehung in Wirklichkeit eine logarithmische Funktion ist. Mit anderen
Worten: Die Scheitelwert-Amplituden der ersten Zeitableitung des zeitlichen Verlaufe
der optischen Dichte sind eine
logarithmische Funktion, keine lineare
Funktion. Würde man die in den Fig. 6 und 8 gezeigten Scheitelwertamplituden auf
Papier mit linearer Teilung statt auf doppelt-logarithmisch geteiltem Papier auftragen,
würden sie einen exponentiellen Verlauf zeigen.
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Der regelbare Funktionsverstärker 42 hat daher die Aufgabe, das differenzierte
Eingangssignal 26 in eine logarithmische Funktion umzuwandeln. Die Form der logarithmischen
Funktion hängt von den Werten für N, Y und C ab, die ihrerseits davon abhängen,
ob ein POX.- oder ein A.P.T.T.-Test vorgenommen wird. Da logarithmische Umwandlungsschaltungen
bekannt sind, braucht der regelbare Funktionsverstärker 42 hier nicht im einzelnen
beschrieben zu werden, Nachdem die Schaltung unter Verwendung eines Standardplasmas
geeicht wurde, wird nunmehr zur Bestimmung des prozentualen Aktivitätspegels Plasma,
das in den oben angegebenen Verhältnissen verdunnt ist, jeweils in den Block 12
eingebracht und die jeweiligen Ausgangsgrößen in der Anzeigevorrichtung 40 werden
bestimmt. Nachdem die Schaltung in dieser Weise für eine Standardprobe geeicht wurde,
können alle unbekannten Blutplasmas unter direkter Anzeige ihrer prozentualen Aktivität
untersucht werden. Es sind daher keinerlei graphische Auftragungen erforderlich.
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In Fig. 10 ist eine andere Busführungsform der Erfindung dargestellt,
bei welcher Faktorbestimmungen und Fibrinogengehaltmessungen unter Verwendung eines
Computers durchgeführt werden können. Außerdem kann die Apparatur gemäß Fig. 10
zum differenziellen Nachweis von Faktormängeln durch Vergleich der Scheitelwertamplituden
von P.T.-,
A.P.X.T.- und T.T.-Tests verwendet werden, wie nachfolgend
noch im einzelnen erläutert wird.
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Die in Fig. 10 gezeigte Vorrichtung ist als Ganzes mit 101 bezeichnet
und weist einen Halterungsblock 113 auf, der mit einer geeigneten Heizvorrichtung
versehen sein kann, um die Temperatur in seinem Inneren auf 37 0C zu halten, das
heißt der Temperatur des menschlichen Bluts im Körper und damit der geeigneten Temperatur
zur Untersuchung von Blutplasma. In dem Block 113 ist ein Reagenzglas 115 angeordnet,
das eine Plasmaprobe 117 enthält, die mittels einer Pipette oder einem anderweitigen
Instrument zur Einbringung von Flüssigkeiten in der geeigneten Menge in das Reagenzglas
eingebracht wurde.
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Eine Lichtquelle 119 emittiert Licht mit Wellenlängen vom nahen Infrarot
über den sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums. Dieses Licht durchsetzt
das Plasma 117 in dem Reagenzglas 115 und wird mit einem Photodetektor 121 gemessen.
Der Photodetektor 121 kann ein Photowiderstand sein, jedoch können auch anderweitige
Arten von Detektoren in Anpassung an die elektronische Schaltung und die Wellenlängen
der auffallenden Strahlung verwendet werden. Die Ausgangsgröße des Photodetektors
121 kann mit bekannten Instrumenten, etwa einem Instrument gemäß der US-Patentschrift
3 658 480 zur Bestimmung der Gerinnungs-(Endpunkt-)zeit des Plasmas behandelt werden.
Das am Ausgang des Photodetektors 121 auftretende Signal gibt in Abhängigkeit von
derZeit die optische Dichte, gemessen an einerBlutplasmaprobe wieder, welcher ein
geeignetes Reagens und/oder Calciumchlorid in den erforderlichen Mengen zugesetzt
wurde, wie oben beschrieben.
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Die Ausgangsgröße des Photodetektors 121 wird einem Differenzierverstärker
125 zugeführt, welcher das den zeitlichen Verlauf der optischen Dichte wiedergebende
Signal differenziert und an seinem Ausgang ein elektrisches Signal 127 erzeugt.
Hierbei handelt es sich um das gleiche Signal wie in Fig. 1A, wobei selbstverständlich
die jeweilige Form und Amplitude je nach dem Plasma, der Test art (beispielsweise
P.T., T.T. oder A.P.U..) sowie nach dem verwendeten Reagens variieren können.
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Die Ausgangsgröße des Differenzierverstärkers 125 wird einem Differenzierverstärker
129 zugeführt, welcher das Signal noch einmal unter Verwendung herkömmlicher Schaltungen
differenziert, wodurch am Ausgang ein Signal 131 erzeugt wird, das in der Zeichnung
graphisch an der Ausgangsleitung angedeutet ist. Der Grund für die Erzeugung einer
zweiten Zeitableitung der Ausgangsgröße des Photodetektors 121 besteht darin, daß
man auf diese Weise den mit dem Scheitelwert des elektrischen Signals 127 übereinstimmenden
Nulldurchgangspunkt erhält. Bekanntlich geht es bei der Durchführung der hier beschriebenen
Analyse um diesen Scheitelwert. Es sei darauf hingewiesen, daß der Differenzierverstärker
129 nicht zur Bestimmung des Endpunkts der Gerinnungszeit dient. Er dient ausschließlich
zur Bestimmung des Scheitelwerts eines Signals, der bekanntlich dann erreicht ist,
wenn der Tangentenanstieg sein Vorzeichen wechselt.
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Die Ausgangsgröße des Differenzierverstärkers 129 wird einem Komparator
133 zugeführt. Der andere Eingang des Komparators 133 liegt an Masse. Bei der Schaltung
gemäß Fig. 10 ist somit als Nullpunktsausgangsgröße des Differenzierverstärkers
129 Massepotential gewählt.
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Sobald das Ausgangssignal des Differenzierverstärkers 129 durch Null
geht, ändert sich die Ausgangsgröße des Eomparators 133. Beispielsweise kann die
Anordnung so getroffen werden, daß diese Ausgangsgröße sich in negativer Richtung
von 5 V auf 0 V ändert. Dieses Signal wird einer Verriegelungs schaltung 135 zugeführt.
Die Verriegelungs schaltung 135 ist eine Flip-Flop-Schaltung. Als die andere Eingangsgröße
wird der Verriegelungsschaltung 135 die Endpunktzeit zugeführt, wie sie beispielsweise
mittels einer Schaltung gemäß der US-Patentschrift 3 658 480 oder einer anderwedtigen
Schaltung zur Messung dieses Wertes erhalten wird.
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Hier sei daran erinnert, daß die Endpunkt zeit normalerweise an einer
Stelle bestimmt wird, bevor das erste Zeitableitungssignal seinen Scheitelwert erreicht,
wie durch die Pfeile in den Fig. 1A, IB und 10 angedeutet. Dieses Endpunkt signal
dient zur Rückstellung des Flip-Flops der Verriegelungsschaltung 135, derart, daß
am Ausgang des Flip-Flops ein Signal erzeugt wird, welches die übrige Schaltung
zum Nachweis eines Scheitelwertes empfindlich macht.
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Die Schaltung weiß, daß sie die Scheitelwertamplitude erreicht hat,
sobald die Verriegelungsschaltung 135 ein Signal vom Komparator 133 erhält. Hierdurch
soll verhindert werden, daß die Schaltung auf ßpuren- oder Neben-Scheitelsignale
anspricht. Dies wird dadurch erreicht, daß man die Schaltung so lange, sperrt, derart,
daß sie für die Bestimmung der Scheitelwertamplitude erst weit oben am aufsteigenden
Ast des Zeitableitungssignals 127 empfindlich wird.
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Die Ausgangsgröße der Verriegelungsschaltung 135 wird einem Digitalvoltmeter
139 zur Betätigung zugeführt.
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Die Apparatur gemäß Fig. 10 weist des weiteren eine Stromquelle 141
und einen Zeit- bzw. taktgeber 143 zur Erzeugung
von Zeitgeber-
bzw. Taktsignalen und geeignete Spannungen für die verschiedenen Schaltungselemente
auf. Gegebenenfalls können der Zeitgeber 143 oder eines oder mehrere der von diesem
erzeugten Zeit bzw. Taktgebersignale durch die Ausgangsgröße der Verriegelungsschaltung
135 gesteuert werden0 Aus dem Vorhergehenden ergibt sich, daß das Digitalvoltmeter
139 so gesteuert wird, daß es eine Digitalausgangsgröße gleich dem Scheitelwertbetrag
des Ableitungssignals 127 erzeugt, das elektronisch eine Spannung ist. Diese Ausgangsgröße
wird in einen Speicher in einem Computer 145 übertragen. Falls erwünscht, kann auch
vorgesehen sein, daß der Computer 145 den Scheitelwertbetrag an einer Anzeigevorrichtung
147 anzeigt. Gegebenenfalls kann alternativ oder zusätzlich auch eine direkt mit
dem Digitalvoltmeter 139 verbundene Anzeigevorrichtung wie auch eine mit dem Computer
145 verbundene Anzeigevorrichtung vorgesehen sein.
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Der Computer 145 ist zur Durchführung von Faktormessungen, Fibrinogen-mengenbestimmungen
sowie zum differentiellen (d. h. faktorspezifischen) Nachweis von Faktormängeln
programmiert, wie nachfolgend beschrieben. Beispielsweise (jedoch ohne einschränkende
Bedeutung) könnte als Computer 145 ein Fairchild PPS 25 Gerät dienen, bei dem es.
sich um einen mit Maske programmierbaren Mini-Computer handelt. Dieser Computer
vermag sämtliche nachfolgend beschriebenen Funktionen durchzuführen; selbstverständlich
kann Jedoch auch jeder beliebige anderweitige derzeit verfügbare Mini-Computer verwendet
werden und es ist vorherzusehen, daß auch bestimmte, sich derzeit in Entwicklung
befindliche Typen von Mikro-Computern zur
Durchführung der nachfolgend
beschriebenen Funktionen eignen werden.
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Die Apparatur 101 weist des weiteren eine Funktionssteuerschaltung
149 auf, welche die geeigneten Schaltungsverbindungen für die Wahl der Betriebsart
oder Funktion des Computers 145 herstellt und als Interface-Einheit zwischen den
Betrieb sarten-Wählschalt em 151 , 153, 155, 157 und 159 und dem Computer 145 über
die Kabelverbindung 163 dient Die in der Zeichnung einfachheitshalber als einfache
Linien dargestellten Leitungen, wie beispielsweise die Leitung 163, können selbstverständlich
in Wirklichkeit mehrere Leitungen zur Ubertragung elektronischer Signale von einem
funktionellen Schaltungsteil zum anderen aufweisen.
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Mit dem Computer 145 ist des weiteren ein Digitalkodierer 164 verbunden,
welcher mittels Rändelradschaltern zur Erzeugung eines dem Fibrinogenmeßwert gleichenden
BCD-(binär kodierten Decimal-)Signals einstellbar ist, wie weiter unten noch im
einzelnen beschrieben wird.
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Die Apparatur 101 kann in folgender Weise zur Durchführung von Faktormessungen
verwendet werden. Die exponentielle Beziehung zwischen der prozentualen Aktivität
eines bestimmten Faktors in einem Plasma und der Gerinnungszeit dieses Plasmas wurde
weiter oben im einzelnen nachgewiesen und dargelegt. Diese Beziehung gilt sowohl
für Faktormessungen der Intrinsiofaktoren VIII, IX, XI und XII unter Verwendung
des "aktivierten partiellen Thromboplastin Tests" (A.P.'.X.) wie auch für Faktormessungen
der Extrinsicfaktoren II, V, VII und X nach dem Prothrombin-Zeit-Test (P.e.). Wie
in Fig. 8 gezeigt, ergibt eine graphische Darstellung des Faktorwertes in doppelt-logarithmischer
Darstellung,
Wobei die Zeit auf der 'ßY"- oder vertikalen Achse und die prozentuale Aktivität
auf der "x"- oder horizontalen Achse aufgetragen wird, eine gerade Linie. Die Faktorbestimmung
für das unbekannte oder Patientenplasma erfolgt durch Einpassung des Meßwerts auf
dieser Linie.
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Das Problem bei einer Gerinnungszeitmessung besteht darin, daß die
Ansprechempfindlichkeit irgendwo zwischen etwa 1 und 6 96 Aktivität verlorengeht.
Es müssen daher Neßgänge mit verschiedenen Verdünnungen durchgeführt werden, derart,
daß mit Hilfe von Datenpunkten für höhere Faktorpegel die Neigung der Linie gefunden
werden kann.
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Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß der Scheitelwertbetrag
der ersten Zeitableitung der änderung der optischen Dichte proportional dem Pegel
der verschiedenen Gerinnungsfaktoren in dem Plasma ist. Dies hat die weitere Erkenntnis
zur Folge, daß bei Verwendung der früher beschriebenen Meßverfahren die Amplitude
der ersten Zeitableitung sich als Funktion des in dem Plasma vorliegenden prozentualen
Anteils des gemessenen Faktors ändert, da der Pegel aller übrigen Faktoren in dem
mit einem Faktormangel behafteten Substratplasma normal ist. Insbesondere verhält
sich die Scheitelwertamplitude der ersten Zeitableitung exponentiell und proportional
zum Pegel des interessierenden Faktors, beispielsweise: hohe Amplitude = hoher Pegel,
niedrige Amplitude =niedriger Pegel, ohne direkte Beziehung zur Gerinnungszeit.
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Wie bereits erwähnt, ergibt sich als einer der Hauptvorteile hieraus,
daß diese Beziehung bis herab zu etwa 1,5 % Aktivität gilt, während der gleiche
Test als zeitabhängi ger Test seine Ansprechempfindlichkeit bei etwa 6 * Aktivität
verliert. Für einige Faktoren läßt sich die Gültigkeit
der Beziehung
zwischen Scheitelwertbetrag/prozentuale Aktivität bis herab zu Faktorpegeln von
0,1 O/o und weniger verifizieren. Da die Amplitude der ersten Zeit ableitung der
optischen Dichte ihre Proportionalitätsbeziehung über diesen weiten Bereich von
Faktoraktivitätspegeln behält, ist es nicht mehr erforderlich, zur genauen Bestimmung
der Neigung der Funktionsgeraden Versuchsgänge mit Plasma-Zwischenverdünnungen vorzunehmen.
Es können daher zwei in weitem Abstand, voneinander befindliche Scheitelwertbeträge
(A1 und A2 weiter unten) mit Zuverlässigkeit gewählt werden.
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Es wurde bereits erläutert daß die Scheitelwertamplitude der ersten
Zeitableitung der optischen Dichte in dem Digitalvoltmeter 139 gemessen wird, und
auch, daß dieser Scheitelwert in den Computer 145 eingetastet wird. Dieser Scheitelwert
und weitere nachfolgend noch erläuterte Werte werden in dem Computerspeicher gespeichert;
der Computer verarbeitet danach diese Information und zeigt schließlich die prozentuale
Faktoraktivität des untersuchten Plasmas ohne irgendwelche graphische Aufzeichnung
auf doppeltlogarithmischem Papier an.
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Zur Ermittlung des prozentualen Faktoraktivitätspegels eines unbekannten-Plasmas
muß die Apparatur 101 zuerst die Anstiegsneigung der nachfolgenden logarithmischen
Beziehung bestimmen:
In dieser bedeuten: A = prozentualer Faktoraktivitätspegel des
unbekannten Plasmas (ist gleich dem Numerus der Größe Log A) V = Scheitelwertamplitude
der Zeitableitung dO.D./t des unbekannten Plasmas (Spannung) A1 = bekannter Faktoraktivitätspegel
einer ersten Blutplasmastandardprobe (z. B. log 0,1 = -1) VI = Scheitelwertamplitude
der Zeitableitung dO.D./dt yon A1 (Spannung) A2 = Faktoraktivitätspegel einer zweiten
Blutplasmastandardprobe (beispielsweise log 100 = 2) V2 = Scheitelwertamplitude
der Zeitableitung dO.De/dt von A2 (Spannung).
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Die Formel (2) ist aus der Formel (1) abgeleitet.
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Mit den vorstehend angegebenen bzwO angenommenen Werten für A1 und
A2 läßt sich die Gleichung für Ä (das heißt für die prozentuale Faktoraktivität
der unbekannten Plasmaprobe) wie folgt vereinfachen: A = Numerus
A = Numerus
Wie oben erwähnt, erlaubt der weite Gültigkeitsbereich der
Beziehung
gemäß der Gleichung (2) die Wahl der Faktoraktivität 100% und der Faktoraktivität
0,1 * zur Bestimmung der Anstiegsneigung der Geraden. Außerdem kann auf diese Weise
die Anstiegsneigung der Geraden unter Verwendung von nur zwei derartigen Punkten
bestimmt werden. Dies erfolgt in der Apparatur 101 in der Weise, daß man zwei Kontroll-oder
Vergleichsplasmen mit bekannten Faktoraktivitätspegeln vermißt, von welchen das
eine normales Plasma mit 100 * Faktoraktivität und das andere das im wesentlichen
faktorfreie Substratplasma mit einem Wert von nur 0,1 * Faktoraktivität ist. Die
Scheitelwertamplitude der ersten Zeit ableitung dieser beiden Kontroll- oder Vergleichsplasmen
ist unbekannt, da sie durch die Art der verwendeten Reagentien beeinflußt wird und
zwischen verschiedenen Faktorbestimmungen schwanken wird. Die Reagentien bewirken
jedoch lediglich einen Unterschied in der Nullpunktversetzung, was in graphischer
Hinsicht als die Versetzung entlang der "Y"- oder vertikalen Achse gedeutet werden
kann. Die gleichen Plasmen ergeben bei Vermessung mit verschiedenen Reagentien parallele
Gerade auf einem doppeltlogarithmischen Papier. Nachdem daher die Scheitelwertamplitude
für Faktoraktivität 100 * und Faktoraktivität 0,1 * in dem Computerspeicher einmal
gespeichert sind, wird die Lösung der Gleichung (4) zur Bestimmung der prozentualen
Aktivität des unbekannten Plasmas eine einfache Sache, indem man lediglich die Scheitelwertamplitude
der ersten Zeitableitung ihrer optischen Dichte in Form einer Spannung bestimmt
und über den Ausgang des Digitalvoltmeters 139 in den Computer eingibt.
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Zur Durchführung dieses Verfahrens mit der Apparatur 101 wird der
Faktormessungs-Knopf 159 gedrückt, wodurch der Computer über die Funktionssteuerschaltung
in die Betriebsart
Faktormessung eingestellt wird. Danach wird
ein Kontroll- oder Vergleichsplasma mit Faktoraktivität 100 * in das Instrument
eingegeben und vermessen, vorzugsweise zweifach, wie weiter unten erwähnt. Hierzu
wird das Reagenzglas 115 mit dem Plasma 117 in den Block 113 eingesetzt. Danach
wird das Reagens zugefügt und die Pipette wieder herausgezogen. Der Test verläuft
dann automatisch weiter, bis der Scheitelwertbetrag der ersten Zeitableitung (V2)
durch das Digitalvoltmeter 139 bestimmt und im Speicher des Computers 145 gespeichert
wird.
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Der zweite Schritt besteht in einem Versuchsgang mit dem Vergleichs-
oder Kontroll-Substratplasma mit Faktoraktivität 0,1 %, und zwar wiederum in Doppelausführung
in der oben beschriebenen Weise. Dieser Wert (V1) wird in den Computer eingegeben.
Danach kann/können die unbekxante(n) Plasmaprobe(n) vermessen werden.
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Die Lösung der Gleichung (4) für (A) erfolgt nach einem einfachen,
direkten Programm und braucht hier nicht mit näheren Einzelheiten beschrieben zu
werden. Programme zur Lösung logarithmischer Funktionen sind bereits vorhanden und
es kann daher ein beliebiges geeignetes Programm dieser Art verwendet werden.
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Wie bereits angedeutet, ist es nach guter klinischer Praxis angezeigt,
alle Proben, und zwar sowohl die Vergleichs- wie auch die unbekannten Proben, jeweils
in doppelten Versuchsgängen zu testen und den Mittelwert zu nehmen. Die Gleichung
(4) und das Computerprogramm wären hierfür wie folgt zu modifizieren:
Darin beziehen sich jeweils die einfach gestrichenen Grö-Ben auf die erste Probe
und die zweifach gestrichenen Größen auf die zweite Probe.
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Eine Fibrinogen-Messung kann mit der Apparatur 101 wie folgt durchgeführt
werden. Wie oben festgestellt, ist die Beziehung zwischen der Scheitelwertamplitude
der ersten Zeit ableitung der optischen Dichte und der Fibrinogenmenge in dem Plasma
unter Verwendung von Thrombin-Reagens linear. Falls beispielsweiee-eine Scheitelwertamplitude
von 3 V (Volt) einer Fibrinogenmenge von 300 mg/dl entspricht, so entspricht eine
Scheitelwertamplitude von 4 V einer Fibrinogenmenge von 400 mg/dl.
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Zur Durchfahrung der Fibrinogenbestimmung mit der Apparatur 101 wird
durch Drücken des Knopfs 155 der Computer in eine Betriebsart für Fibrinogenmessung
geschaltet. Danach wird ein gontroli- oder Vergleichsplasma, dessen Fibrinogengehalt
(anderweitsg) bestimmt wurde, mit der Apparatur 101 in der folgenden Weise vermessen:
Der (anderweitig bestimmte) Fibrinogengehalt wird mit dem Rindelßchraubenschaltor
an dem Teiler 164 eingestellt.
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Dieser Wert wird mittels des Bezugswerteinstellschalters
157
in den Speicher des Computers 145 übertragen. Sodann wird in einem Versuchsgang
das Kontroll- bzw. Vergleichsplasma in der Apparatur 101 zur Bestimmung seiner Scheitelwertamplitude
vermessen. Die Vermessung des Eontrollplasmas erfolgt doppelt. Dieser Vorgang liefert
den Mdltiplikator für alle nachfolgend im Vergleich gegen das Kontrollplasma vermessenen
Plasmaproben. Die Grundformel für Fibrinogen lautet: CV = F (8) worin C eine Konstante
und V die Scheitelwertamplitude der ersten Zeitableitung (in Volt) sowie F den Fibrinogengehalt
in.mg/dl bedeuten.
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Für doppelte Probenvermessung erhält man
worin V' sich auf die erste Probe und V" sich auf die zweite Probe bezieht.
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Zur Einstellung des Computers muß die Konstante (C) als Funktion von
F1, das heißt des mittels des Teilers 164 eingestellten Bezugs-Fibrinogengehalts
in mg/dl, bestimmt werden.
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Hierfür gilt
Nachdem C bestimmt wurde und in den Computer eingegeben ist, erfolgt die Bestimmung
des Fibrinogengehalts F der
unbekannten Plasmaprobe nach der Beziehung:
Da sämtliche vorstehend genannten Gleichungen linear sind, bereitet die Aufstellung
eines geeigneten Programms für den Computer 145 keinerlei Schwierigkeiten und braucht
daher nicht mit näheren Einzelheiten beschrieben zu werden.
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Die Apparatur 101 kann auch zum differentiellen (das heißt faktorspezifischen)
Nachweis von Faktormängeln verwendet werden. Wie oben bereits angedeutet, gestattet
der differentielle (das heißt der faktorspezifische) Vergleich zwischen verschiedenen
Tests dem Kliniker die Bestimmung, welcher bestimmte Faktor oder welche bestimmte
Faktorgruppe fehlt. Wie erwähnt, sind die meisten Tests (beispielsweise der P.T.-
und der A.P.T.T.-Test) für mehr als einen Gerinnungsfaktor spezifisch, mit Ausnahme
des Thrombin-Tests, der nur für Fibrinogen (Faktor I) spezifisch ist.
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Daher werden differentielle (faktorspezifische) Vergleiche zwischen
den Tests vorgenommen, um festzustellen, welcher spezielle oder individuelle Faktor
oder welche Faktorgruppe fehlt. Dies läßt sich am besten unter Bezugnahme auf die
drei häufigsten Situationen bei der grankenhausaufnahme oder bei der präoperativen
Untersuchung veranschaulichenO Der Prothrombin-ZeitxPest (P.T.) ist für die Faktoren
II, V, VII und X spezifisch. Der aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit-Test (A.P.T.T.)
ist für die Faktoren II, V, VIII, IX, X, XI und XII spezifisch. Diese beiden Tests
werden außerdem von der vorhandenen Menge des Faktors I (Fibrinogen) beeinflußt.
Der Thrombin-Zeit-Test
(T.T.) ist nur für den Faktor I spezifisch.
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Wie bereits erwähnt, handelt es sich bei diesen Tests um Zeittests.
Die Scheitelwertamplitude der ersten Zeitableitung dieser Tests liefert jedoch zusätzliche
Information über das Plasma, die aus der Gerinnungszeit allein nicht erhalten werden
kann. Der Vergleich der Scheitelwertamplituden des P.T.- und des A.P.T.T.-Tests
ergibt einen zusätzlichen Uberwachungsparameter, der für leichtere, milde Mängel
im Intrinsic-Gerinnungssystem empfindlicher ist als die Gerinnungszeit. Außerdem
ist dieser Vergleich auch empfindlich bezüglich Mängeln im Extrinsic-Gerinnungssystem.
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Sowohl die P.T.- als auch die A.P.T.T.-Test-Amplituden sind empfindlich
bezüglich Fibrinogen (Faktor I) Die Fibrinogenmenge in dem Plasma beeinflußt die
Amplitude der ersten Zeitableitungskurve, beispielsweise in dem Sinne, daß ein hoher
Fibrinogengehalt eine hohe Amplitude und ein niedriger Fibrinogengehalt eine niedrige
Amplitude bewirkt, und in den meisten Fällen ist dabei die Amplitudenänderung als
Funktion des Fibrinogengehalts, insbesondere bei hohen Pegeln, durch eine Gerinnungszeitmessung
nicht nachweisbar. Die Gerinnungszeiten für die meisten leichteren, milden Faktormängel
liegen im "normalen" oder 'tGrenz"-Bereich und sind für die Diagnose von keiner
oder nur von geringer Hilfe. Ein differentieller (faktorspezifischer) Vergleich
der Scheitelwertamplituden des P.T.- und des A.P.T.T.-Tests eines Plasmas liefert
jedoch in einfacher Weise einen Nachweis leichterer, milder Faktormängel und gleichzeitig
eine Anzeige, ob der Mangel im Intrinsic-oder im Extrinsic-Gerinnungssystem liegt.
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Hierzu wird zunächst das Verhältnis der P.T.-Amplitude zur A.P.T.T.-Amplitude
für eine große Anzahl von normalen Plasmen bestimmt. Graphisch kann die P.T.-Amplitude
auf der vertikalen oder Y-Achae einer linearen (das heißt nicht logarithmischen)Darstellung
und die A.P.T.T.-Amplitude des gleichen Plasmas auf der horizontalen oder 1-Achse
aufgetragen werden0 Infolge der Schwankungen im Fibrinogen-Pegel fallen diese Datenpunkte
in einen Bereich um eine Regressionslinie in dem so erhaltenen Streudiagramm. Fig.
11 zeigt ein Beispiel eines derartigen Streudiagramms auf der Basis von hundert
normalen Plasmen. Das Streudiagramm gemäß Fig. 11 setzt die Scheitelwertamplitude
der ersten Zeitableitung der optischen Dichte (V max # O.D.) des A.P.T.T.- und des
P.T.-Tests in Beziehung zueinander, und zwar für normale Subjekte (punkte) und acht
Patienten mit einem isolierten, leichten Faktor VIII-Mangel (case-hummer). Die mittlere
Regressionslinie wird von einem Vertrauensbereich ("confidence belt") von 95 und
97 * eingeschlossen. Die Standardabweichung für eine Regression (Korrelation) beträgt
0,23. Die Neigung der Regressions- (bzw. Korrelations-)linie in Fig. 11 beträgt
0,65.
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Aus einem Streudiagramm der in Fig. 11 gezeigten Art lassen sich Formeln
für den Vergleich der P.T.- und A.P.T.T.-Tests ableiten und hieraus einer der drei
Schlüsse ziehen: 1. Normal 2. Intrinsic-Mangel 3. Extrinsic-Mangel.
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Im'Falle von 2 oder 3 wären weitere Untersuchungen
vorzunehmen,
um den jeweiligen bestimmten Faktormangel zu isolieren.
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Die Grundgleichung für die Regressions- bzw. Eorrelationslinie ist
Y = M X + BodX = ### (12) Darin bedeuten: Y = P.T.-Scheitelwertamplitude (Spannung)
M = Neigung der Regressionslinie X = A.P.U.T.-Scheitelwertamplitude (Spannung) B
= Nullpunktversetzung.
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Die vorstehende Gleichung (12) wird zur Bestimmung der Grenzen für
1 - "Normal", 2 - "Intrinsic-Mangel" und 3 - "Extrinsic-Mangel" verwendet. Die Amplituden
sind jeweile die Scheitelwertamplituden der ersten Zeitableitung der optischen Dichte.
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Unter Verwendung des Streudiagramms von Fig. 11 erhält man folgende
Ergebnisse 1. Falls y# 0,65 X + 1,3 und # 0,65 1 - 0,3 = normal 2. Falls y >
0,65 X + 1,3 = Intrinsic-Mangel 3. Falls Y < < Q,65 x - 0,5 = Extrinsic-Mangel.
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Die Neigung (M) und die Versetzung (B) gegenüber dem Nullpunkt hängen
von dem verwendeten A.P.T.T.-Reagens und bis
zu einem gewissen
Grad von Thromboplastin in dem P.XO-Test ab. Diese beiden Parameter (M und B) müssen
daher durch Vermessung vieler normaler Plasmen mit den verschiedenen Reagentien,
die üblicherweise verwendet werden, bestimmt werden. Nachdem diese Konstanten einmal
bestimmt und definiert sind, können sie mittels Wählschalter in dem Computer 145
der Apparatur 101 gewählt werden. Dies erfolgt mittels den Schaltern 151 und 153.
Insgesamt werden somit die Parameter M und B durch Vorversuche bestimmt und festgelegt
und die Werte als voreingegebene Bezugsgrößen in das Instrument 101 eingegeben.
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Wie bereits erwähnt, besitzen die Gerinnungsfaktoren 1, II, V und
X eine Auswirkung sowohl auf den P.T.- und den A.P.T.T.Test. Die Fibrinkonzentration
(Faktor I) kann im allgemeinen nicht durch einen differentiellen (faktorspezifischen)
Vergleich der P.T.- und A.P.T.T.-Tests nachgewiesen und gemessen werden. Die Faktoren
II, V und X beeinflussen jedoch entschieden die Amplitude des P.T.- und des A.P.T.T.-Tests
und können, bei gleichartiger Verringerung ihrer Scheitelwert amplituden, als "normale
Werte" erscheinen. Aus den vorstehend genannten Gründen wird ein differentieller
(faktorspezifischer) Vergleich zwischen dem P.T.- und dem Thrombin-Zeit-Test (,.)
und ein differentieller (faktorspezifischer) Vergleich zwischen dem A.P.T.T.- und
dem T.T.-test durchgeführt. Für diese Vergleiche wird die gleiche oben erwähnte
Formel (12) verwendet. Die Ergebnisse werden hieraus wie folgt abgeleitet: P.T.
gegen T.T. = normal oder Extrinsic-Mangel A.P.T.T. gegen T.T. = normal oder Intrinsic-Mangel.
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Da die Faktoren V und X sowohl den P.T.- und den A.P.T.T.-
Test
beeinflussen, läßt sich ein Mangel an diesen Faktoren nachweisen, da diese sowohl
als Intrinsic- wie auch als Extrinsic-Nångel erscheinen. Danach kann mittels normaler
Korrektionsverfahren eine Unterscheidung zwischen den Faktoren V und X getroffen
und auch jeder anderweitige Faktor mangel festgestellt werden.
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Nachfolgend wird die Verwendung der Apparatur 101 für den differentiellen
(faktorspezifischen) Vergleich der Scheitelwertamplituden der ersten Zeitableitung
der optischen Dichte gemäß den oben beschriebenen differentiellen Untersuchungstests
beschrieben. Dies ergibt ein Testsystem, das für leichtere, milde Faktormängel wesentlich
empfindlicher ist als die Gerinnungszeit allein.
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Das Verfahren unter Verwendung der beschriebenen Apparatur besteht
darin, daß man zunächst die Neigung M und die Nullpunktversetzung B in Abhängigkeit
von dem jeweiligen Reagens bestimmt. Danach werden alle zu untersuchenden Plasmen
durchnumeriert. Sodann wird der P.T.-Betriebsartfunktionsschalter 151 gedrückt und
für jedes der verschiedenen Plasmen aufeinanderfolgend Jeweils zweifach die Scheitelwertamplitude
gemessen und der Mittelwert der Scheitelwertamplituden im Speicher des Computers
145 gespeichert. Danach wird der A.P.T.T.-Betriebsartfunktionsschalter 153 gedrückt
und die gleichen Plasmen in der gleichen Reihenfolge und jeweils zweifach in dem
Instrument vermessen. Die hierbei verfügbar werdenden Daten aus dem A.P.T.T.-Test
werden vom Computer mit den gespeicherten Daten aus den P.T.-Tests verglichen0 Dies
erfolgt gemäß der Gleichung (12). Je nachdem, ob ein Extrinsic- oder ein Intrinsic-Mangel
vorliegt, erfolgt eine entsprechende Anzeige oder ein Ausdruck.
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Das gleiche Verfahren könnte zum Vergleich von T.T0-Werten mit P.T.-Werten
und von T.T.-Werten mit A.P.T.T.-Werten Anwendung finden. Als Beispiel zeigt Fig.
12 ein Streudagramm der Scheitelwertamplitude der ersten Zeit ableitung der optischen
Dichte für den A.P.T.T. und T.T. für normale Subjekte (Punkte) und acht Patienten
mit isoliertem, leichterem (milaem) Faktor VIII-Mangel (Case Nummern). Die mittlere
Regressions- oder Korrelationslinie ist durch Vertrauenebereiche 95 und 97 % eingeschlossen.
Die Standardabweichung von der Regression (Korrelation) beträgt 0,20. Auch hier
ist die Programmierung des Computers nach den angegebenen Gleichungen eine einfache
Angelegenheit, insbesondere da es sich um lineare Beziehungen handelt, und braucht
daher nicht näher beschrieben zu werden.
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Die Erfindung wurde vorstehend an Rand spezieller Ausführungsbeispiele
beschrieben, die jedoch selbstverständlich in mannigfachen Einzelheiten abgewandelt
werden können, ohne daß hierdurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird.
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Patentansprüche:
L e e r s e i t e